Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Tính kháng thuốc oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

Chia sẻ: Hoa La Hoa | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:24

Thêm vào BST

Báo xấu

88
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Y học, chuyên ngành Vi sinh Y học với đề tài "Tính kháng thuốc oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012" do Hoàng Vũ Mai Phương thực hiện nhằm mục tiêu Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam; xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50); đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012. Sau đây là bản tóm tắt của luận án.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y học: Tính kháng thuốc oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thế kỷ XX, căn nguyên vi rút là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm đe doạ tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người, điển hình là các vụ dịch xảy ra như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Tại Việt Nam, số người mắc cúm có xu hướng tăng lên sau mỗi năm. Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Văc xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm. Sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir...) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm. Sự tương tác của thuốc với vi rút có thể gây sự kháng thuốc của vi rút. Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc và mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Tại Việt Nam quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại học Oxford thuộc bệnh viện bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ báo cáoở mức độ từng ca bệnh hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, mà chưa có một nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá của chủng vi rút cúm A theo thời gian. Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu: - Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam. - Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50). - Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012. Những đóng góp mới của luận án: 1. Đây là công trình nghiên cứu khoa học đầu tiên thực hiện có hệ thống để xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn từ 2001 đến 2012. 2. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là các kỹ thuật xét nghiệm mới cập nhật trong những năm gần đây. 3. Kết quả nghiên cứu đã xác định được giá trị IC50 ngưỡng,tỉ lệ và mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir củacác phân típ chủng vi-rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012. Đây là các công bố đầu tiên về giá trị ngưỡng tương tác của virut cúm A với oseltamivir tại Việt nam cho phép nhận định
2 mức độ kháng thuốc của vi rút cúm A, từ đó có thể phối hợp với bác sĩ lâm sàng đưa ra phác đồ điều trị phù hợp. 4. Kết quả nghiên cứu so sánh về sự tương đồng di truyền học giữa các vi rút cúm A được xác định giảm nhạy cảm với oseltamivir lưu hành tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A lưu hành trong nước, trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012 cho thấy sự các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir lưu hành song song cùng với các chủng cúm thông thường khác, kết quả này cũng bổ sung thêm thông tin về sự tiến hóa của vi rút cúm A tại Việt Nam. 5. Nghiên cứu về tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm theo chiều dọc thời gian từ 2001-2012 với các số liệu thu thập được là cơ sở dữ liệu đầu tiên về sự tương tác của vi rút cúm với oseltamivir tại Việt Nam. Bố cục luận án: Luận án dày 103 trang gồm: Đặt vấn đề 3 trang Chương I: Tổng quan 34 trang Chương II: Đối tượng, vật liệu và phương pháp 16 trang nghiên cứu Chương III: Kết quả 32 trang Chương IV: Bàn luận 15 trang Kết luận 2 trang Kiến nghị 1 trang Luận án có 23 hình vẽ, 11 bảng, 6 biểu đồ và 2 sơ đồ. Trong 123 tài liệu tham khảo có 6 tài liệu Tiếng Việt và 117 tài liệu Tiếng Anh. CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1. Vi rút cúm A 1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A Hệ gen của vi rút cúm A: Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần. Đoạn RNA 1, 3, 4, 5 và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA.Phân đoạn 2, 7 và 8 mỗi phân đoạn mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1- M2 và NS1-NS2. Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút: Heamaglutinin (HA): Heamaglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa bởi đoạn RNA số 4 có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Trên bề mặt tế bào người, HA gắn vào thụ thể alpha 2,6 axit sialic; trên tế bào gia cầm, HA gắn vào thụ thể alpha 2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể . Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme, neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide. NA xúc tác cho quá trình cắt đứt mối liên kết α 2,3 hoặc α 2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ
3 Các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1 đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9). Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 mã hóa cho hai protein M1 và M2.Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp vỏ của vi rút. M2 là một protein xuyên màng, hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H + từ nội bào vào trong vi rút, giải phóng các RNP của vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm Các polymerase PB1, PB2, PA và nucleoprotein (NP):Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm còn có các phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase: phức hợp PA-PB1-PB2.NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi rút cúm có tính bảo tồn cao, chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới. 1.1.2. Cơ chế nhân lên của virút cúm A Vi rút cúm A nhân lên qua bốn giai đoạn: Sự bám dính, sự thâm nhập, sự cởi áo, tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút. Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng heamoglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt tế bào (α2,3 hoặcα 2,6 axit sialic). Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào. Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào, phá vỡ vỏ giải phóng RNP vào tế bào chất của tế bào chủ. RNA của vi rút cúm được tổng hợp và nhân lên tại nhân tế bào, các RNP và M1 liên kết các thành phần lại để tạo nên hạt vi rút. Hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của enzyme neuraminidase. 1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A Những thay đổi nhỏ trên gen Enzyme polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên và đã tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới. Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA tác động lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới. Những biến đổi nhỏ này xảy ra còn liên quan đến sự né tránh miễn dịch của vi rút cúm với kháng thể đã được tạo ra bởi những lần nhiễm trước đó, vì vậy, các vi rút mang những biến đổi này có thể là nguyên nhân gây nên những vụ dịch cúm hàng năm. Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên Sự biến đổi lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên tạo nên vi rút tuy cùng mang tên một phân typ vi rút (vd: H1N1) nhưng bản chất vi rút đã có sự thay đổi hoàn toàn, vì vậy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ không cho kết quả đáp ứng chéo bảo vệ giữa các phân típ vi rút cùng tên đã biết. Hậu quả của sự xuất hiện vi rút mới mà không có kháng thể tồn lưu có khả năng chống lại trong quần thể, sẽ là nguyên nhân một đại dịch lan rộng trên toàn thế giới (đại dịch cúm 1918, 1977, 2009 với vi rút cúm A phân típ H1N1). 1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, với vật liệu di truyền phân đoạn như vậy, sự tái sắp xếp của vật liệu di truyền giữa các chủng vi rút cúm có khả năng xảy ra khi có sự
4 đồng nhiễm hai hay nhiều vi rút cúm A phân typ khác nhau trên một vật chủ, kết quả là sự tạo ra một loại vi rút thế hệ mới trong đó cấu trúc gen là sự trộn và sắp xếp lại của các vi rút cúm đồng nhiễm. 1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm Cúm là một bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do vi rút cúm gây ra. Đường lây truyền chủ yếu của vi rút cúm có thể qua là qua giọt nước bọt nhỏ mang vi rút tung ra khi người bệnh tiếp xúc trực tiếp với người lành. Từ đầu thế kỷ XX đến nay, thế giới ghi nhận 4 đại dịch cúm, ước tính có khoảng 40 triệu người đã chết do nhiễm cúm. Bệnh cúm ở Việt Nam xuất hiện quanh năm, có hai đỉnh rõ rệt vào mùa đông xuân với sự lưu hành của vi rút cúm B (tháng 2 – tháng 3) và mùa hạ với sự lưu hành của các chủng thuộc phân typ cúm A (tháng 7 – tháng 8). 1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A Sự tiến hóa của vi rút cúm được ghi nhận đầu tiên là sự tiến hóa về di truyền học với những thay đổi nhỏ, thay đổi lớn trên gen. Sự tiến hóa của vi rút cúm A còn được khẳng định là sự tiến hóa thích nghi. Tác động của con người lên sự tiến hóa của vi rút cúm A chưa được đánh giá một cách rõ ràng nhưng những hoạt động như sử dụng gia cầm, tiêm văc xin hay sử dụng thuốc kháng vi rút cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự tiến hóa. 1.2. Phòng và điều trị vi rút cúm A 1.2.1.Văc xin phòng cúm Các loại văc xin đưa vào sử dụng gồm hai chủng A (một chủng A/H3N2 và một chủng A/H1N1pdm09) và một chủng cúm B, được lựa chọn từ hơn 100 trung tâm cúm quốc gia từ hơn 80 quốc gia trên thế giới. Các loại văc xin cúm bao gồm: Văc xin bất hoạt, Văc xin sống giảm độc, Các loại văc xin thế hệ mới (reverse genetic văc xin, DNA văc xin) 1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A Các thuốc dòng ức chế sự xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, Cơ chế tác dụng của các chất này là ức chế kênh trao đổi ion M2 xuyên màng của vi rút cúm A, ion H+ không thể đi vào bên trong virút, pH trong vi rút không thay đổi, hạn chế quá trình hòa màng của vi rút với tế bào chủ , ngăn cản quá trình ”cởi áo” vi rút để xâm nhập vào bên trong tế bào chủ Hiện tượng kháng thuốc thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 do xuất hiện các điểm đột biến trên gen M (phần M2). Các thuốc dòng ức chế neuraminidase Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase của vi rút cúm. Ức chế quá trình phân cắt axit sialic trên bề mặt tế bào chủ khỏi glycoprotein HA của hạt vi rút mới nảy chồi, vi rút chỉ có khả năng nhiễm và nhân lên trong tế bào nhiễm nhưng không thể phát tán xâm nhập các tế bào lành khác, ngăn chặn khả năng gây bệnh của vi rút. Sự đột biến trên protein NA làm giảm hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase. 1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới Thuốc ức chế sự xâm nhập của vi rút vào tế bào (ức chế thụ thể trên bề mặt tế bào – DAS181); Các thuốc ức chế neuraminidase (Peramivir và Laninamivir); Thuốc ức chế sự tái tạo vi rút của vi rút cúm - T-705.
5 1.3.Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút 1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine Được sử dụng từ những năm 60 của thế kỷ trước, amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các phân típ cúm A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm A. Sau 7 năm đưa vào sử dụng (1995-2002), tác dụng của adamantane trong điều trị và phòng bệnh có hiệu quả không cao bởi quá trình kháng thuốc đã xuất hiện và lan truyền nhanh trong quần thể. Tỉ lệ kháng thuốc amantidine là 2% năm 2002 tăng lên 12% năm 2004 và 100% ở các chủng A/H3N2 năm 2005. Theo kết quả của các nghiên cứu về tỉ lệ kháng amantadine của virút cúm A cho thấy 100% các virút cúm A/H3N2 và A/H1N1pdm09 kháng amantadine. 1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase của vi rút cúm được đưa vào sử dụng từ năm 1999. Gần đây các nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra rằng những chủng vi rút kháng lại oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 lưu hành trước năm 2009. Các chủng kháng với oseltamivir đã bắt đầu xuất hiện năm 2007, sau đó tăng nhanh 43-60% năm 2008 và lan rộng trên toàn thế giới năm 2009 với tỉ lệ kháng lên đến 95% (Nhật, Mỹ, Châu Âu). Các phân típ H5N1, H1N1pdm09 cũng đã được ghi nhận các trường hợp kháng oseltamivir trên thế giới và tại Việt Nam. 1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A 1.4.1. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger (phương pháp thông thường):Kỹ thuật được thực hiện có thể theo dõi được sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm. Điển hình là sự xuất hiện của hiện tượng kháng amantadine của vi rút A/H3N2, hiện tượng kháng oseltamivir của vi rút A/H1N1 và là phương pháp chủ yếu được lựa chọn để xác định chủng vi rút cúm A kháng amantadine Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism): Enzyme giới hạn BspHI hoặc BclI sẽ cắt sản phẩm PCR tại với vị trí xác định có trình tự tương ứng với vi rút không mang đột biến kháng thuốc (vi rút nhạy cảm với thuốc), trong trường hợp vi rút mang gen kháng thuốc, sản phẩm PCR sẽ không được cắt bởi enzyme giới hạn. Kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ngắn thực hiện với từng nucleotide xác định (pyro- sequencing): Mục tiêu chính của phương pháp là xác định các điểm đột biến có sẵn trên cỡ mẫu lớn trong thời gian ngắn. Kỹ thuật realtime RT-PCR: Kỹ thuật này được đưa vào thử nghiệm lần đầu tiên năm 2008 với ứng dụng tìm điểm đột biến H275Y trên phân đoạn gen mã hóa NA của virút cúm A/H1N1. 1.4.2. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase Xác định hoạt động của NA
6 Mục đích của việc xác định hoạt động của neuraminidase là đánh giá hoạt động của enzyme trong quá trình nhân lên của vi rút và chuẩn hóa nồng độ vi rút trước khi thực hiện việc xác định mức độ kháng thuốc của vi rút. Xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir *Dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase với chất phát quang có nguồn gốc hóa học Việc nhận định mức độ kháng thuốc oseltamivir/zanamivir của vi rút cúm dựa vào sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học (chemiluminesence). Kết quả thu được từ kỹ thuật này được đánh giá có đủ độ tin cậy và được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) chuẩn thức trên thế giới như PTN tại trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US CDC), PTN tại viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia Nhật Bản. *Dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase với chất phát quang là huỳnh quang Đây là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của enzyme neuraminidase với thuốc ức chế hoạt động của enzyme (oseltamivir, zanamivir...) có sử dụng chất huỳnh quang trong thành phần của phản ứng. Kết quả của thử nghiệm xác định được nồng độ thuốc ức chế 50% hoạt động của vi rút. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các PTN do khả năng ứng dụng linh hoạt trong sử dụng hóa chất sinh phẩm và được tổ chức y tế thế giới khuyến cáo sử dụng xác định mức độ kháng thuốc của các chủng vi rút. 1.4.3. Giám sát sự kháng thuốc virút cúm Xây dựng quy trình giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm Các phương pháp đều đã được xây dựng quy trình chuẩn (SOP) nhằm tạo tiền đề cho việc thực hiện xét nghiệm giám sát thường xuyên sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm. Chiến lược thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm Quy trình giám sát vi rút cúm kháng thuốc được Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi rút thuộc Hiệp hội quốc tế về cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác(ISIRV) khuyến cáo thực hiện bao gồm quá trình xác định biểu hiện kháng thuốc của các chủng vi rút thông qua kỹ thuật NAI với cơ chất huỳnh quang, sau đó các chủng có biểu hiện kháng thuốc sẽ được xác định vị trí đột biến liên quan đến kháng thuốc trên gen NA bằng các phương pháp như giải trình tự gen thông thường hoặc realtime RT- PCR. Quy trình này hiện nay đang được áp dụng tại các phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG tại CDC-Altanta, Melbourne-Úc và NIID-Nhật Bản. Theo quy trình này, các chủng mang đột biến kháng thuốc sẽ được giám sát sự tiến hóa trong quá trình tiến hóa chung của vi rút cúm, từ đó có thể xác định được kiểu gen và kiểu hình đặc thù của vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam.
7 CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi rút cúm thuộc nhóm A bao gồm các phân típ A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1, A/H1N1 đại dịch 09 phân lập được tại phòng thí nghiệm cúm từ năm 2001 đến 2012 từ các nguồn: Giám sát phòng thí nghiệm 2001 – 2005, chương trình giám sát cúm quốc gia 2006 – 2012 và giám sát viêm phổi nặng 2003 – 2012. Các chủng vi rút được thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Lạng Sơn, Hòa Bình, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Ninh Bình, Hưng Yên, Thái Bình và Thanh Hóa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Toàn bộ các vi rút cúm mùa A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 sau khi phân lập được xác định mức độ kháng thuốc bằng phương pháp ức chế neuraminidase, các vi rút có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir sẽ được giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA để xác định điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc và phân đoạn gen mã hóa HA để xác định sự tiến hóa của vi rút (ref). Tuy nhiên, để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu về sự tiến hóa của vi rút, toàn bộ chủng cúm A trong nghiên cứu được giải trình tự hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA. 2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm Chủng vi rút: Cỡ mẫu trong nghiên cứu được xác định là cỡ mẫu toàn bộ 342 chủng bao gồm: 42 chủng H1N1 thu thập từ năm 2001 đến 2009; 157 chủng H1N1pdm09 thu thập từ tháng 6 năm 2009 đến 2012; 115 chủng H3N2 thu thập từ năm 2003 đến 2012 và 28 chủng H5N1 thu thập từ năm 2004 đến 2012 Kỹ thuật xét nghiệm: Phân lập vi rút, xác định nồng độ oseltamivir ức chế neuraminidase và giải trình tự gen Sinh phẩm: Tế bào MDCK (CDC) phân lập vi rút cúm; Giải trình tự gen sử dụng bộ kit của hãng ABI, Mỹ, mồi được cung cấp bởi CDC; xác định nồng độ oseltamivir ức chế neuraminidase sử dụng bộ kit của hãng Life Technology, Mỹ, oseltamivir được cung cấp bởi hãng Roche. 2.4. Phân tích số liệu Các giá trị IC50 thu được sau khi thực hiện thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm JASPR được cung cấp bởi CDC-Altanta Hoa Kỳ. Giá trị ngưỡng và mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm được xác định và phân tích thông qua phần mềm Graphpad Prism 6.0.2, Mỹ. Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa NA và HA của các vi rút sau khi được giải trình tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA và Bioedit phiên bản 7.2.3; cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood. Các trình tự phân đoạn gen HA và NA tham chiếu thuộc các phân típ vi rút tương ứng được thu thập từ ngân hàng dữ liệu DNA (www.ncbi.com).
8 CHƯƠNG III - KẾT QUẢ 3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 - 2012 Số lượng các vi rút lưu hành trong mỗi năm cũng như ưu thế của từng phân típ vi rút thể hiện sự khác nhau. Phân típ vi rút A/ H1N1 chiếm tỷ lệ tuyệt đối (100%) trong các năm 2001, 2002 và 2006, và tỷ lệ này giảm tại năm 2003 (74%), 2008 (54%). 2009 (4,5%) và hoàn toàn không xuất hiện trong các năm sau. Sự xuất hiện lần đầu tiên của phân típ A/H1N1pdm09 vào năm 2009 với tỷ lệ 65,1% (2009) và ở mức 46,4% năm 2010, 98,3% năm 2011và không phát hiện trong năm 2012. Phân típ A/H3N2 không có đại diện trong nghiên cứu tại các năm 2001, 2002, 2006 (0%) nhưng là phân típ vi rút có mặt hầu hết trong các năm nghiên cứu (9/12 năm) với tỷ lệ dao động từ 1,7% (2011) đến 100% (2012). Với vi rút cúm gia cầm A/H5N1, lần đầu tiên được ghi nhận gây bệnh cho người vào năm 2003 cũng có mặt trong nghiên cứu (5%) và tiếp tục xuất hiện với tỷ lệ dao động từ 3,1% (2009) đến 60% (2005). Vi rút A/H5N1 không xuất hiện tại miền Bắc Việt Nam vào các năm 2006, 2011 và 2012. 3.2. Xác định giá trị IC 50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A Toàn bộ vi rút sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng để xác định giá trị ngưỡng cho từng phân típ, tuy nhiên phần mềm Graphad prism tự động loại bỏ các cá thể có những giá trị vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (IQR) vì vậy số cá thể vi rút sử dụng trong xây dựng giá trị ngưỡng không tương đồng với tổng số vi rút sử dụng trong nghiên cứu, cụ thể: số vi rút cúm A/H1N1 sử dụng là 30/42 vi rút; A/H1N1pdm09 là 152/157 vi rút và A/H5N1 là 21/28 vi rút. Kết hợp với phân tích tứ phân vị, chúng tôi có thể xác định được giá trị IC50 ngưỡng của các vi rút tương đương với giá trị trung bình IC50 và giá trị trung vị (Q2) (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Giá trị IC50 trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn. Giá trị IC50 Vi rút Số vi rút trung bình (nM) A/H1N1 30/42 0,413 A/H1N1pdm09 152/157 0,334 A/H3N2 115/115 0,164 A/H5N1 21/28 2,947 Vi rút chứng Giá trị IC50 (nM) A/Mississippi/03/2001 0,5 (A/H1N1) A/Perth/265/2009 0,6 (A/H1N1pdm09) A/Fukui/20/2004 (A/H3N2) 0,2 A/Vietnam/1194/2004 1,3 (A/H5N1)
9 3.2.1. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1 Giá trị ức chế 50% (IC50) của 30 chủng vi rút cúm A/H1N1 trong nghiên cứu có giá trị trung bình dao động trong khoảng 0,061 – 0,765nM. Độ tập trung của giá trị cho thấy tổng số 30/42 cá thể có giá trị IC50 dưới giá trị IC50 trung bình (0,413nM) và 12 cá thể còn lại có IC50 lớn hơn giá trị ngưỡng. So sánh với vi rút chuẩn A/Mississippi/03/2001 có giá trị IC50 là 0,5nM, giá trị IC50 ngưỡng được xác định cho phân típ vi rút A/H1N1 trong nghiên cứu này chính là giá trị IC50 trung bình đã được xác định là 0,413 ± 0.352 nM 3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1pdm09 Với các chủng A/H1N1pdm09, sự dao động giá trị IC50 trong tổng số 152 vi rút được phân tích không nhiều, độ tập trung cao của 147/ 152 cá thể vi rút xung quanh giá trị IC50 trung bình 0,334nM được ghi nhận tại biểu đồ 3.3, tương tự giá trị IC50 của vi rút tham chiếu chuẩn A/Perth/265/2009 là 0,6nM, vì vậy giá trị ngưỡng của vi rút được xác định là 0,334 ± 0,286 nM. 3.2.3. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H3N2 Toàn bộ vi rút thuộc phân típ A/H3N2 có giá trị IC50 vi rút trung bình dao động từ 0,04 đến 0,29 nM . Giá trị IC50 trung bình 0,164 nM của các vi rút H3N2 tương đương với giá trị IC50 0,2 nM của vi rút tham chiếu chuẩn A/Fukui/20/2004, giá trị IC50 ngưỡng của phân típ vi rút cúm A/H3N2 được xác định là 0,164 ± 0,126 nM. 3.2.4. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H5N1 Tổng số 21/28 chủng vi rút cúm A/H5N1 được chấp nhận phân tích kết quả theo chương trình Graphpad prism. Cụ thể theo từng vi rút cho thấy giá trị IC50 nhỏ nhất là 0,13 nM, lớn nhất là 8,98 nM. Các vi rút A/H5N1 có giá trị IC50 tập trung gần hoặc dưới giá trị IC50 trung bình 2,947 nM (17/21), giá trị IC50 của vi rút chủng vi rút tham chiếu chuẩn A/Vietnam/1194/2003 (A/H5N1) là 1,3 nM. Giá trị ngưỡng của phân típ cúm A/H5N1 được xác định là 2,947 ± 2,539 nM. 3.3 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A 3.3.1. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1 Tổng số 42 vi rút A/H1N1 lưu hành từ năm 2001 đến 2009 được thu thập, sử dụng thử nghiệm ức chế neuraminidase, đã xác định được 12 vi rút H1N1 có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng trong nghiên cứu. Toàn bộ các vi rút này được xác định là vi rút lưu hành trong năm 2008 và 2009 (Bảng 3.3). Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi xác định được hai chủng cúm A/H1N1pdm09 là A/Vietnam/33419/09 có giá trị IC50 125.99nM năm 2009 và A/Vietnam/36530/11 127.91nM năm 2011. Giá trị IC50 của các chủng này tăng từ 350 – 400 lần so với giátrị IC50 ngưỡng của vi rút
10 Bảng 3.3. Giá trị IC50 của H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009 Giá trị Giá trị IC 50 Giá trị IC 50/ Giá Năm Tên chủng/Số chủng IC50 (nM)±SD trị IC 50 ngưỡng ngưỡn g 2001 8 0,28 ± 0,09 0,68 2002 4 0,51 ± 0,32 1,23 2003 14 0,33 ± 0,14 0,79 2006 3 1,06 ± 0,09 2,57 A/Vietnam/TX285/08 534,23 ± 3,58 1294 A/Vietnam/TB289/08 1624,44 ± 4,52 3933 A/Vietnam/TX200/08 456,11 ± 5,38 1104 2008 A/Vietnam/TX233/08 453,28 ± 9,39 1097 A/Vietnam/BT241/08 678,45 ± 6,12 0,413 1643 A/Vietnam/LS324/08 59,98 ± 2,35 145 A/Vietnam/32036/09 704,20 ± 4,80 1705 A/Vietnam/EL197/09 581,24 ± 4,78 1407 A/Vietnam/Q271/09 464,86 ± 6,49 1126 2009 A/Vietnam/31808/09 527,95 ± 15,75 1278 A/Vietnam/34381/09 575,72 ± 5,81 1273 A/Vietnam/N116/09 565,95 ± 11,17 1370 Chứng A/Mississippi/03/2001 458,2 1109 3.3.2 Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1pdm09 H1N1pdm09. Ngoài ra, số liệu trong bảng 3.4 còn thể hiện giá trị IC50 của ba chủng H1N1pdm09 đã được thực hiện năm 2009 (Bảng 3.4). Bảng 3.4. Giá trị IC50 của H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm 2009 và 2011 Giá trị IC 50 Giá trị IC50 Giá trị IC 50/ Giá trị Năm Tên chủng (nM)±SD ngưỡng IC 50 ngưỡng 429,5 ± A/Vietnam/32043/09 1422 10,25 323,66 ± A/Vietnam/32060/09 1072 2009 12,68 A/Vietnam/32067/09 889,2 ± 9,73 2944 0,334 125,99 ± A/Vietnam/33419/09 417 13,44 127,91 ± 2011 A/Vietnam/36530/11 356 9,84 Chứng A/Perth/261/2009 191,2 572
11 3.3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H3N2 Kết quả thử nghiệm NAI thực hiện trên 157 chủng vi rút A/H3N2 cho thấy giá trị IC50 của các chủng H3N2 dao động trong khoảng 0,038 – 0,29nM, không phát hiện cá thể vi rút nào có giá trị nào vượt giá trị ngưỡng (0,164nM) từ 10 lần trở lên. 3.3.4. Mức độ giảm độ nhạy, kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A/H5N1 Số chủng vi rút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu là 28 vi rút phân lập trên bệnh nhân nhiễm vi rútA/H5N1trong giai đoạn từ 2004-2010. Kết quả nghiên cứu đã xác định được 2 vi rút A/Vietnam/HN31412/08 và A/Vietnam/HN31413/08 lưu hành năm 2008 có giá trị IC50 đạt mức 19,04nM và 14,48nM. Hai vi rút này có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng lần lượt là 6 lần và 5 lần. Ngoài ra, chủng A/Vietnam/HN30408/05 có giá trị IC50 đã được xác định năm 2005 tăng 30 lần so với giá trị ngưỡng (Bảng 3.6). Bảng 3.6. Giá trị IC50 của hai chủng H5N1 năm 2005 và 2008 Giá trị Giá trị IC 50 Giá trị IC50/ Giá Năm Tên chủng IC50 (nM)±SD trị IC 50 ngưỡng ngưỡng 2005 A/Vietnam/HN30408/05 90 ± 5,82 30 A/Vietnam/HN31412/08 19,04 ± 2,34 6 2008 2,947 A/Vietnam/HN31413/08 14,48 ± 2,09 5 Chứng A/Vietnam/HN30408/05 90 30 3.3.5. Nhận định kết quả kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A lưu hành 2001 – 2012 Kết quả bảng 3.7 cho thấy nhóm 12 vi rút cúm A/H1N1 với biểu hiện giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng từ 145 - 3933 lần được xếp vào nhóm các vi rút giảm mạnh độ nhạy cảm với thuốc oseltamivir Tương tự, nhóm 5 chủng vi rút H1N1pdm09 cũng được xếp vào nhóm các vi rút giảm mạnh độ nhạy với oseltamivir khi giá trị IC50 của vi rút nhóm này cao hơn giá trị ngưỡng từ 356 đến 2944 lần. Vi rút H5N1 với giá trị IC50 chỉ lớn hơn giá trị ngưỡng 5-6 lần được đánh giá ở mức có biểu hiện giảm độ nhạy (hai vi rút) và vi rút có giá trị IC50 lớn hơn giá trị ngưỡng 30 lần được xác định là giảm độ nhạy với osetlamivir. Toàn bộ số chủng vi rút cúm A/H3N2 trong nghiên cứu đều được xác định là nhạy cảm với oseltamivir. 3.4. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A liên quan đến kháng thuốc oseltamivir Các vi rút được phân tích trong nghiên cứu này là A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H5N1 thuộc phân típ NA1 (N1), vì vậy một số đột biến tương đồng và thường gặp trên phân đoạn gen mã hóa N1 được ghi nhận là H275Y, N295S hoặc I117V sẽ được phân tích bằng phương pháp phân
12 Bảng 3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir Giá trị IC 50/ Năm Tên chủng Giá trị IC50 Nhận định kết quả ngưỡng Vi rút A/H1N1 A/Vietnam/TX285/08 1294 A/Vietnam/TB289/08 3933 A/Vietnam/TX200/08 1104 2008 A/Vietnam/TX233/08 1097 A/Vietnam/BT241/08 1643 Giảm mạnh độ nhạy cảm A/Vietnam/LS324/08 145 (GMĐNC) của vi rút với A/Vietnam/32036/09 1705 oseltamivir A/Vietnam/EL197/09 1407 A/Vietnam/Q271/09 1126 2009 A/Vietnam/31808/09 1278 A/Vietnam/34381/09 1273 A/Vietnam/N116/09 1370 Vi rút A/H1N1pdm09 A/Vietnam/32043/09 1422 A/Vietnam/32060/09 1072 2009 GMĐNCcủa vi rút với A/Vietnam/32067/09 2944 oseltamivir A/Vietnam/33419/09 417 2011 A/Vietnam/36530/11 356 Vi rút A/H5N1 A/Vietnam/HN30408 GMĐNCcủa vi rút với 2005 30 /05 oseltamivir A/Vietnam/HN31412 Có biểu hiện giảm ĐNCủa 6 /08 vi rút với oseltamivir 2008 A/Vietnam/HN31413 5 /08 tích trình tự chuỗi thông thường (Sanger sequecing). Kết quả sẽ được xác nhận khi so sánh với trình tự chuỗi nucleotide của các vi rút không có biểu hiện giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir và các vi rút tham chiếu chuẩn. 3.4.1. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1 liên quan đến kháng thuốc oseltamivir Năm vị trí đột biến liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir trên phân đoạn gen mã hóa NA của các vi rút cúm A/H1N1 thường gặp là Q137K, Y156H, I223V, S247G và H275Y. Kết quả phân tích trình tự phân đoạn gen mã hóa NA của 12 vi rút cúm A/H1N1 cho thấy: toàn bộ các vi rút này đều phát hiện đột biến tại vị trí 275. Cụ thể, trình tự nucleotide đã có sự thay đổi từ CAC sang TAC, và protein thay đổi tại vị trí này được ghi nhận là H275Y. Không phát hiện các đột biến liên quan khác tại vị trí 137, 156, 223 hoặc 247.
13 3.4.2. Vị trí đột biến trên protein NA của các chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09 liên quan đến kháng thuốc oseltamivir Vi rút cúm A/H1N1pdm09 được ghi nhận các đột biến liên quan đến hiện tượng giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir bao gồm I223M, I223K, S247N, H275Y và đồng đột biến tại hai vị trí Q313K và I427T. Hình 3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên Hình 3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1 protein NA của các chủng cúm A/H1N1pdm09 Tương tự với kết quả phân tích phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H1N1, tổng số 5 vi rút A/H1N1pdm09 có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir đều xuất hiện đột biến H275Y trên protein NA. Các đột biến khác tại các vị trí I223M, I223K, S247N không được phát hiện trên các vi rút này. 3.4.3. Vị trí đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA của các chủng vi rút cúm A/H5N1 liên quan đến kháng thuốc oseltamivir Trên phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm gia cầm A/H5N1, các vị trí axit amin thay đổi liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir bao gồm I117V, Q136L, D199G, S247N, H275Y, N295S. Trong nghiên cứu này toàn bộ 28 vi rút cúm A/H5N1 được phân tích trình tự chuỗi nucleotide (1413 nucleotide). Kết quả cho thấy trong 3 vi rút có biểu hiện tăng IC50 và đột biến tại vị trí H275Y phát hiện trên vi rút A/Vietnam/HN30408, không phát hiện trên hai vi rút còn lại A/Vietnam/HN31412/08 và A/Vietnam/HN31413/08. Tuy nhiên đột biến tại vị trí I117V được phát hiện trên hai chủng này. Hình 3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein Hình 3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA - NA - A/H5N1 A/H5N1
14 Ngoài ra, chủng A/Vietnam/HN31209/07cũng được phát hiện mang đột biến I117V trên phân đoạn gen mã hóa NA nhưng không xác định được giá trị IC50. Các đột biến còn lại Q136L, D199G, S247N, N295S không được xác định trong nghiên cứu này. 3.5 Tỉ lệ các chủng vi rút cúm A kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam, 2001- 2012 Vi rút được xác định giảm độ nhạy oseltamivir dựa vào hai yếu tố quyết định, mức độ giảm độ nhạy (biểu hiện kiểu hình) và xuất hiện điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa NA (kiểu gen) của cùng một vi rút. Bảng 3.8 cho thấy trong tổng số 20 vi rút được phát hiện có biểu hiện tăng IC50 ở các mức độ giảm độ nhạy khác nhau đều có xuất hiện đột biến liên quan. Đột biến được ghi nhận phổ biến đó là H275Y (Histidine chuyển sang Tyrosine) xuất hiện trên 18/20 vi rút, đột biến I117V chỉ xuất hiện trong 2 vi rút có giá trị IC50 lớn hơn ngưỡng 5-6 lần. Bảng 3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm đột biến Giá trị IC50/ Phân Năm Tên chủng Giá trị IC50 Nhận định kết quả Đột biến típ ngưỡng A/Vietnam/TX285/08 1294 A/Vietnam/TB289/08 3933 A/Vietnam/TX200/08 1104 2008 A/Vietnam/TX233/08 1097 A/Vietnam/BT241/08 1643 GMDNC của vi rút với A/H1N1 A/Vietnam/LS324/08 145 oseltamivir H275Y A/Vietnam/32036/09 1705 (trung bình 1448 lần) A/Vietnam/EL197/09 1407 A/Vietnam/Q271/09 1126 2009 A/Vietnam/31808/09 1278 A/Vietnam/34381/09 1273 A/Vietnam/N116/09 1370 A/Vietnam/32043/09 1422 A/H1N1pd A/Vietnam/32060/09 1072 GMDNC của vi rút với 2009 m09 A/Vietnam/32067/09 2944 oseltamivir H275Y A/Vietnam/33419/09 417 (trung bình 1242 lần) 2011 A/Vietnam/36530/11 356 Giảm ĐNC của vi rút 2005 A/Vietnam/HN30408/05 30 H275Y A/H5N1 với oseltamivir A/Vietnam/HN31412/08 6 Có biểu hiện giảm 2008 ĐNC của vi rút với I117V A/Vietnam/HN31413/08 5 oseltamivir Tỉ lệ giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc theo từng phân típ trong khoảng thời gian từ 2001 đến 2012 được xác định 28,5% (12/42) đối với chủng cúm A/H1N1, 3,2% (5/157) chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09 và một chủng chủng vi rút A/H5N1giảm
15 nhạy cảm với oseltamivir; phân típ A/H3N2 được xác định nhạy cảm với oseltamivir được thể hiện qua bảng 3.9. Bảng 3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen) Số chủng kháng Tỉ lệ oseltamivir/ kháng Tỉ lệ Tổng số chủng oseltami kháng Chủng vi rút Năm Phương vir oseltamivir Phương pháp giải theo chung pháp NAI trình tự năm (%) gen (%) 2001-2007 0/29 0/29 0 28,5 A/H1N1 2008 6/7 6/7 85,7 (12/42) 2009 6/6 6/6 100 2009 4/86 4/86 4,7 A/H1N1pdm09 2010 0/13 0/13 0 3,2 (5/157) 2011 1/58 1/58 1,7 A/H3N2 2003-2012 0/115 0/115 0 0 Đối với vi rút cúm A/H5N1, xác định 3 chủng vi rút đảm bảo tiêu chuẩn về kiểu hình và kiểu gen trong giới hạn giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir trong nghiên cứu. Do số lượng vi rút cúm A/H5N1 hạn chế nên chúng tôi không phân tích tỷ lệ theo năm. 3.6 Sự tương đồng về phân đoạn gen mã hóa HA và NA giữa các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ nhạy osletamir với các vi rút cùng phân típ lưu hành trong giai đoạn nghiên cứu. 3.6.1. Sự tương đồng về gen giữa các chủng vi rút cúm A/H1N1 giảm độ nhạy cảm oseltmivir với các chủng vi rút cúm A/H1N1 trên thế giới Cây gia hệ HA của vi rút A/H1N1 được xây bởi phương pháp Maximum Likelihood bằng trình tự các phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H1N1 trong nghiên cứu , các vi rút đại diện trong khu vực (Trung Quốc, Malaysia, Úc), châu Âu và châu Mỹ và các vi rút dự tuyển văc xin trong giai đoạn nghiên cứu: A/New Caledonia/20/1999, A/Wellington/1/2001, A/Solomon Island/3/2006 và A/Brisbane/59/2007. Phân tích cây gia hệ cho thấy phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút H1N1 lưu hành tại Việt Nam 2001 – 2009 được chia thành 2 nhóm chính nhóm 1 và nhóm 2. Các vi rút trong nhóm 1 lại được phân tách thành các nhómphụ : 1A ,1B và 1C , tương tự nhóm 2 có các nhóm phụ 2A, 2B và 2C. Các vi rút trong nghiên cứu có biểu hiện giảm độ nhạy osletamivir đều nằm trong nhóm phụ 2B. Theo phân tích cây gia hệ, các vi rút biểu hiện kháng oseltamivir không tạo các clade riêng và tương đồng cao với các vi rút lưu hành trong cùng thời gian. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA cũng có sự phân nhánh rõ rệt. các chủng kháng oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam hai năm 2008 và 2009 được nhóm vào nhóm 2C và không xác địnhsự khác biệt về di truyền học giữa các vi rút giảm độ nhạy oseltamivir và các vi rút cùng lưu hành trong cùng thời gian tại Việt Nam và các nước trong khu vực (Hình 3.5.).
16 Hình 3.5. Cây gia hệ phân đoạn gen mã Hình 3.9. Cây gia hệ phân đoạn gen hóa HA các chủng vi rút cúm A/H1N1, mã hóa HA các chủng vi rút cúm 2001-2009 A/H1N1- clade 2, 2001-2009 Hình 3.11.Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng vi rút cúm A/H5N1, 2003-2010
17 3.6.2. Sự tương đồng về gen giữa các chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy cảm oseltmivir với các chủng vi rút cúm A/H1N1pdm09 trên thế giới Các chủng cúm H1N1pdm09 năm 2009 và 2010 tại Việt Nam có độ tương đồng cao với các chủng lưu hành tại Thái Lan và Trung Quốc, không thể hiện sự phân nhánh rõ ràng so với chủng gốc A/California/07/99. Bốn phân đoạn gen mã hóa HA của các vi rút A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy cảm oseltamivir năm 2009 tương đồng cao với các chủng lưu hành trong cùng năm.Vi rút giảm độ nhạy cảm với oseltamivir năm 2011 nằm trong phân nhánh cùng với các vi rút khác lưu hành cùng năm. Phân đoạn gen mã hóa NA của các chủng H1N1pdm09 thể hiện sự tương đồng cao với chủng dự tuyển văc xin A /California/07/99 và các chủng khác lưu hành tại các nước láng giềng Thái Lan, Trung Quốc và các nước trong khu vực Singapore, Đài Loan-Trung Quốc, Úc từ năm 2009-2011 (Hình 3.9). 3.6.3. Sự tương đồng về gen giữa các chủng vi rút cúm A/H5N1 giảm độ nhạy cảm oseltmivir với các chủng vi rút cúm A/H5N1 trên thế giới Phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút H5N1 phát triển thành nhiều clade khác nhau, tính đến 2012, có tổng số 10 clade được đề cập đến (0-9). Vi rút H5N1 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam (6 chủng) từ năm 2003-2005 tập trung tại calde 1. Chủng H5N1 giảm độ nhạy cảm với oseltamivir A/Vietnam/HN30408/2005 nằm trong phân nhánh của các vi rút lưu hành năm 2004 và 2005. Các vi rút thu thập được trong những năm tiếp theo thể hiện sự phân tách rõ rệt sang clade 2, vi rút H5N1 tại Việt Nam nằm trong phân nhánh 2.3.4 cùng các chủng vi rút đến từ Trung Quốc. Hai chủng A/Vietnam/HN31412/2008 và A/Vietnam/HN31413/2008 mang đột biến liên quan đến kháng thuốc tại vị trí I117V trên protein NA và có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir cũng nằm trong phân nhánh 2.3.4.3. Vi rút H5N1 trên người nhạy cảm hoặc giảm sự nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam phân đoạn gen mã hóa HA đều có sự tiến hóa chung với các chủng lưu hành trên gia cầm tại Việt Nam và có sự tương đồng với các chủng H5N1 gây bệnh tại miền Nam Trung Quốc.Phân tích cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA cho thấy vi rút A/Vietnam/HN30408/2005 mang đột biến H275Y biểu hiện giảm độ nhạy với oseltamivir được nhóm vào nhóm 2A. Và 2 vi rút đã được xác định mang đột biến I117V trên protein NA (A/Vietnam/HN31412/2008 và A/Vietnam/HN31413/2008 nằm trong nhóm 2B (Hình 3.11). CHƯƠNG IV - BÀN LUẬN 4.1 Sự lưu hành của các vi rút cúm A trong khoảng thời gian nghiên cứu Số lượng 342 chủng cúm A thu được trong nghiên cứu trong giai đoạn 2001-2012 với các phân típ đại diện cho từng năm lưu hành đã đảm bảo tính bao quát của nghiên cứu. Với số lượng 42 vi rút cúm A/H1N1; 157 vi rút cúm A/H1N1pdm09; 115 vi rút cúm A/H3N2 và 28 vi rút cúm A/H5N1 phản ánh quy mô của hoạt động giám sát cúm tại Việt Nam. Trong giai đoạn 2001-2005, giám sát cúm chưa thành hệ thống, chỉ được thực hiện tại một số điểm giám sát của Hà Nội vì vậy số lượng vi rút thu thập trong các năm này thấp dao động từ 4 vi rút (2001) đến 19 vi rút (2003). Tỷ lệ của các phân típ vi rút thu thập trong từng năm của nghiên cứu tương đồng tỷ lệ lưu hành các phân típ vi rút cúm A trong kết quả giám sát. Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng vi rút phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng dương tính với RT-PCR, vì vậy một số
18 phân típ vi rút sẽ không có mặt trong nghiên cứu khi sự lưu hành của phân típ này với tỷ lệ quá thấp ví dụ năm 2012 có ghi nhận sự lưu hành của A/H1N1pdm09, nhưng không phân lập được vi rút.Trong năm 2006, không ghi nhận trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 tại Việt nam, tiếp theo các năm 2011 và 2012 số người nhiễm vi rút cúm A/H5N1 có được ghi nhận tại Việt nam, tuy nhiên các trường hợp này chỉ được xác định tại khu vực phía Nam. Như vậy, kết quả thu thập vi rút cúm gia cầm A/H5N1 trong nghiên cứu này đã phản ánh đúng tình hình nhiễm cúm A/H5N1 trên người tại miền Bắc, Việt nam trong giai đoạn 2003-2012. 4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50) 4.2.1 Giá trị IC50 ngưỡng của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu cho thấy sự tương tác của oseltamivir tới mỗi phân típ vi rút cúm khác nhau không giống nhau cho dù có cùng kiểu dạng protein NA thể hiện ở giá trị IC50 trung bình cho các phân típ vi rút cúm mang protein NA1 lưu hành tại Việt Nam. Kết quả của chúng tôi phù hợp với những nghiên cứu trước đó tại Úc, Anh và Nhật. Sự khác nhau này có thể giải thích do mỗi vi rút cúm xâm nhập vào các quần thể người khác nhau có thể tạo ra các biểu hiện kiểu hình (phenotype) khác nhau trong quá trình tiến hóa. Ngoài ra, sự khác nhau về giá trị ngưỡng của típ/phân típ vi rút cúm có thể do mỗi neuraminidase của từng loại cúm có sự tương tác khác nhau với oseltamivir. Theo dõi được sự đa dạng trong tương tác của vi rút cúm với oseltamivir theo từng năm ta có thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về giá trị IC50 của từng vi rút cúm theo từng phân típ, tạo nền tảng để thực hiện công tác giám sát kháng thuốc của vi rút cúm tại miền Bắc Việt Nam nói riêng và mở rộng ra toàn quốc nói chung. Sự tương tự về kết quả trong nghiên cứu được khẳng định, tuy nhiên giá trị thực tế của IC50 tại mỗi quốc gia sẽ khác nhau. vì vậy việc xác định giá trị ngưỡng IC50 cho từng quốc gia, từng khu vực địa lý là cần thiết trong việc tiến hành giám sát sự kháng thuốc tại từng quốc gia. 4.2.2 Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir Sự thay đổi về độ mẫn cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút cũng là một biểu hiện của sự thay đổi để thích nghi và phát triển trên vật chủ của vi rút cúm. Thông qua giá trị ức chế 50% của oseltamivir (IC50) với các vi rút cúm A, nghiên cứu của chúng tôi đã xác định được tổng số 20 vi rút cúm thuộc các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 yêu cầu một nồng độ oseltamivir cao để ức chế sự phát triển của mình.Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy có sự xuất hiện của các vi rút cúm A/H1N1 giảm độ nhạy với oseltamivir vào các năm 2008 và 2009 với tỷ lệ 85,7% và 100%gợi ý về sự tự biến chuyển cơ bản về kiểu hình của phân típ vi rút cúm này. Điều này được khẳng định khi kết quả nghiên cứu tương tự với các chủng A/H1N1 lưu hành tại Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ và Châu Âu giai đoạn 2006 – 2009. Kết quả tại nghiên cứu cũng cho thấy mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir của phân típ vi rút này gần như tuyệt đối khi giá trị IC50 được xác định cao hơn giá trị ngưỡng từ 1104 đến 3933 lần. Có thể nhận định phân típ A/H1N1các năm 2008 và 2009 trong nghiên cứu có khả năng kháng hoàn toàn thuốc kháng vi rút oseltamivir. Để có thể xác định toàn diện về hiện tượng này, nghiên cứu hồi cứu về độ nhạy cảm của A/H1N1 nên được thực hiện với cỡ mẫu đủ lớn và đại diện cho các vùng tại Việt
19 Nam. Sự kháng thuốc mạnh mẽ của A/H1N1 sẽ là quan ngại lớn cho sức khỏe cộng đồng nếu phân típ vi rút này tiếp tục lưu hành trong các năm tiếp theo, tuy nhiên từ năm 2010 phân típ vi rút này đã không được xác nhận trong báo cáo của hệ thống giám sát quốc gia tại Việt Nam cũng như hệ thống giám sát cúm toàn cầu. Vi rút cúm A/H1N1pdm09 đã xuất hiện và bắt đầu lưu hành từ năm 2009 bằng đại dịch xảy ra từ tháng 5/2009 đến tháng 4/2010 trên toàn thế giới. Cũng như các vi rút cúm A khác, hiện tượng giảm độ nhạy cảm với oseltamivir có thể xảy ra, nhất là trong giai đoạn đầu mới xuất hiện, khi văc xin đặc hiệu chưa có và oseltamivir là công cụ chủ yếu để điều trị nhiễm vi rút. Tỉ lệ kháng thuốc của H1N1pdm09 năm 2009 trong thời điểm đại dịch được cho là hợp lý khi chúng tôi tham khảo nghiên cứu của Moghadas về mô hình kháng thuốc trong đại dịch cúm (năm 2008)và Hurt về sự kháng thuốc của vi rút cúm trong đại dịch (năm 2012). Tỷ lệ H1N1pdm09 giảm nhạy cảm với oseltamivir trong nghiên cứu của chúng tôi dường như cao hơn các nước trong khu vực, sự khác biệt này có thể giải thích do phạm vi nghiên cứu chỉ nằm trong giới hạn miền Bắc Việt Nam và thực hiện trên quần thể là vi rút phân lập, không phải tổng số mẫu dương tính với vi rút cúm (được xác định bằng phương pháp RT-PCR). Vì vậy, để xác định chính xác tỷ lệ giảm độ nhạy với thuốc kháng vi rút, cần phải mở rộng nghiên cứu cũng như sự thống nhất một cách đánh giá tỷ lệ của hệ thống giám sát cúm toàn cầu trong tương lai. Mức độ giảm độ nhạy với oseltamivir của vi rút cúm A/H1N1pdm09 lưu hành tại Việt Nam được xác định ở mức độ mạnh khi độ chênh lệch với giá trị ngưỡng được xác định từ 356 đến 2944 lần cao hơn giá trị IC50 ngưỡng, kết quả trên cho thấy sự đa dạng về đáp ứng với oseltamivir trong nhóm vi rút có cùng biểu hiện về kiểu gen đột biến liên quan H275Y. Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự với các thông báo từ các nước khác như Mỹ, Anh và Úc… trong cùng thời gian. Nghiên cứu của chúng tôi đã phát hiện ra trường hợp kháng thuốc đầu tiên của vi rút cúm A/H5N1 vào năm 2005 - vi rút A/Vietnam/HN30408/2005 - với giá trị IC50 cao hơn 30 lần so với giá trị ngưỡng được đánh giá ở mức giảm độ nhạy cảm với oseltamivir, vi rút này thuộc clade 1 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003-2005. Khi phân tích sâu về kiểu gen cho thấy, đây là vi rút có đột biến không hoàn toàn, chỉ có 6 trong tổng số 10 clone có nguồn gốc từ vi rút này được phát hiện có đột biến H275Y, vì vậy việc biểu hiện kiểu hình đa dạng của các vi rút mang đột biến là có thể và liên quan nhiều đến hiện tượng "quasi-species. Ngoài ra, cá thể vi rút này cũng được ghi nhận hiện tượng đột biến xuất hiện dưới áp lực của điều trị, do vậy việc kiểm soát điều trị hay xây dựng phác đồ điều trị thuốc kháng vi rút phù hợp sẽ góp phần kiểm soát hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm. Ngoài ra, chúng tôi cũng phát hiện hai vi rút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.4.3 lưu hành năm 2008, có đột biến tại vị trí I117V và có biểu hiện giảm độ nhạy với giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng 5-6 lần tương tự với các nghiên cứu của Hurt (2012) và Takano (2012) thu được giá trị IC50 sau đột biến I117V trong nghiên cứu giả định tại phòng thí nghiệm cùng cho kết quả tăng hơn 5-6 lần so với giá trị trung bình. Nghiên cứu với 115 chủng H3N2 chúng tôi nhận thấy giá trị IC50 của phân típ vi rút cúm này ít có sự khác biệt giữa các cá thể vi rút và không phát hiện sự giảm nhạy cảm với oseltamivir trong giai đoạn từ năm 2003 đến 2012. Tham khảo các tài liệu về
20 sự kháng thuốc của vi rút H3N2 cho thấy dường như vi rút chủ yếu kháng amantadine (thuốc điều trị cúm được sử dụng trước oseltamivir) và chỉ kháng oseltamivir ở mức độ thấp. Chúng tôi cho rằng đó có thể do khả năng gắn kết giữa protein NA của vi rút H3N2 với thuốc tốt hơn H1N1 và các đột biến tuy có xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa NA nhưng khả năng gây hiện tượng kháng thuốc không mạnh. Việc giám sự kháng thuốc của vi rút cúm thường xuyên tại PTN mới được TCYTTG khuyến cáo thực hiện từ năm 2009. Do vậy, phương pháp giám sát chuẩn thức vẫn được điều chỉnh hàng năm cho phù hợp với sự thay đổi của vi rút cúm và tình hình nhiễm cúm của từng quốc gia. Với phương pháp áp dụng cho nghiên cứu, chúng tôi xác định được các chủng vi rút cúm kháng oseltamivir. Với các bệnh phẩm lâm sàng dương tính với cúm nhưng không phân lập được vi rút, trong tương lai gần, chúng tôi sẽ áp dụng phương pháp giải trình tự gen với từng nucletotide xác định (pyrosequencing) để xác định trực tiếp đột biến liên quan đến kháng thuốc trên bệnh phẩm lâm sàng. Như vậy, việc giám sát kháng thuốc tại PTN sẽ bao quát được không những các chủng vi rút kháng thuốc mà còn những bệnh phẩm lâm sàng nghi ngờ mang vi rút cúm kháng thuốc. 4.3 Sự liên quan của các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA với quá trình kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam Tác dụng ức chế neuraminidase của oseltamivir thông qua sự bám kết của oseltmivir vào các vị trí hoạt động của enzym neuraminidase tại vị trí Glu276, Ala246, Arg224, và Ile222. Ái lực gắn bám sẽ quyết định hiệu quả hoạt đông ức chế của oseltamivir. Bất cứ sự đột biến, thay đổi của axit amin trên protein NA tại các vị trí này hoặc các vị trí xung quanh đều ảnh hưởng đến ái lực gắn bám hoặc làm thay đổi vị trí tương tác với oseltamivir sẽ dẫn đến hiện tượng giảm độ nhạy, hoặc kháng oseltamivir. nghiên cứu của chúng tôi chỉ phát hiện đột biến tại vị trí H275Y và I117V trên protein NA, trong đó vị trí H275Y chiếm ưu thế 90% (18/20 vi rút) trong khi đột biến I117V chỉ chiếm 10% (2/20 vi rút). Chỉ đột biến tại vị trí I117V chỉ được đề cập trong phân típ cúm A/H5N1, không xuất hiện trong các vi rút cúm người phân típ N1 (A/H1N1 hoặc A/H1N1pdm09). Đột biến này cũng phát hiện trên vi rút cúm A/H5N1 lưu hành trên gia cầm năm 2007-2008 tại Việt Nam, chứng tỏ sự liên hệ giữa vi rút cúm lưu hành trên gia cầm và trên người và cho phép nghĩ đến hiện tượng đột biến tự nhiên, không chịu áp lực của thuốc kháng vi rút oseltamivir. Sự nguy hiểm của vi rút cúm gia cầm mang gen kháng thuốc có khả năng lây bệnh cho người đã được chứng minh khi vi rút cúm A/H7N9 lưu hành tại Trung quốc gần đây. Phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H7N9 được xác định có đột biến R292K và đã làm mất/giảm hiệu lực của thuốc Taminflu và tỷ lệ tử vong cao của những người nhiễm bệnh đã được ghi nhận. Ngoài năm trường hợp H1N1pdm09 được khẳng định kháng thuốc trên cả kiểu hình và kiểu gen, chúng tôi còn xác định được 4 trường hợp khác cũng mang gen kháng thuốc. Tuy nhiên, do không thể xác định mức kháng thuốc (kiểu hình), một điều kiện quan trọng của việc khẳng định sự kháng thuốc cho nên các chủng này chỉ dừng lại ở mức ghi nhận có mang đột biến liên quan đến kháng thuốc.