Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Hóa phân tích: Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối

Xây dựng phương pháp định tính, định lượng<br /> flavonoid trong lá và nụ vối<br /> Nguyễn Quốc Tuấn<br /> Trường Đại học Khoa học Tự nhiên<br /> Luận văn Thạc sĩ ngành: Hoá phân tích; Mã số: 60 44 29<br /> Người hướng dẫn: PGS.TS. Phương Thiện Thương<br /> Năm bảo vệ: 2012<br /> Abstract: Tách được 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone (CO -1) từ<br /> nụ vối. Xây dựng được phương pháp định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học. Tìm<br /> ra được hệ dung môi định tính flavonoid bằng sắc ký bản mỏng (TLC). Tìm ra được<br /> điều kiện chạy HPLC định tính chất CO-1 từ nụ và lá vối. Xác định được flavonoid<br /> toàn phần trong lá và nụ vối của một số mẫu dược liệu vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.<br /> Xây dựng được phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC. Ứng dụng phương pháp<br /> xây được trong việc định lượng các mẫu lá và nụ vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc.<br /> Keywords: Hóa học; Hóa phân tích; Cây Vối<br /> Content<br /> MỞ ĐẦU<br /> Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên<br /> khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ<br /> lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay<br /> hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực.<br /> Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid<br /> khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý như chống ung thư, chống dị ứng,<br /> chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm... Trong dự thảo<br /> Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối.<br /> Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chưa có tiêu chí về định tính và định lượng flavonoid<br /> trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học<br /> trọng.<br /> Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định<br /> tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây<br /> dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lượng<br /> dược liệu trên thị trường.<br /> Các mục tiêu của đề tài gồm có:<br /> • Phân lập được một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc<br /> định tính, định lượng flavonoid.<br /> <br /> • Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu nụ và lá<br /> vối.<br /> CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN<br /> 1.1 Tổng quan về cây vối<br /> 1.1.1 Tên gọi<br /> - Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà<br /> - Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry<br /> - Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb.<br /> - Họ Sim (Myrtaceae).<br /> 1.1.2 Đặc điểm thực vật<br /> Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân nứt nẻ, màu nâu đen. Cành<br /> nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn Lá đơn mọc đối, có cuống dài 11,5 cm, dai, cứng, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, dài 8-20 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn<br /> ở gốc, có mũi ngắn. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có<br /> màu tím, thể chất nạc, vị ngọt.<br /> <br /> a) Cây vối<br /> <br /> b) Nụ vối tươi<br /> <br /> b) Nụ vối khô<br /> <br /> ơ<br /> Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối<br /> 1.1.3 Thành phần hóa học<br /> Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều<br /> thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen. Trong lá vối<br /> có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol. Vỏ cây chứa triterpen<br /> nhóm ursan là acid usolic. Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã<br /> xác định cấu trúc hóa học.<br /> 1.1.4 Tác dụng sinh học của các flavonoid trong lá và nụ vối<br /> Các flavonoid còn có khả tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những<br /> chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ<br /> thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức<br /> xạ.<br /> <br /> 2<br /> <br /> Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý<br /> tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ<br /> khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol.<br /> - Tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư: 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'dimethylchalcone phân lập từ nụ vối có tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thƣ<br /> với các dòng TB ung thƣ khác nhau.<br /> - Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng ức chế maltase đường ruột làm giảm đường huyết<br /> trên chuột gây bệnh tiểu đường.<br /> - Tác dụng chống oxy hóa: ức chế các enzym α-glucosidase.<br /> - Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid như quercetin, kaempferol, tamarixetin được phân<br /> lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và<br /> butyrylcholinesterase.<br /> 1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid<br /> 1.2.1 Phƣơng pháp định tính<br /> a) Phương pháp ống nghiệm<br /> Phản ứng với hơi amoniac<br /> Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3. Có thể quan sát sự biến đổi màu này<br /> bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại.<br /> Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda).<br /> Phản ứng do sự có mặt nhân γ-penzopyron trong đa số flavonoid. Thuốc thử là HCl<br /> đặc và bột Magie kim loại.<br /> Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H2SO4 đậm đặc<br /> Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H 2SO4 đậm đặc, sau đó cho thêm 0,1<br /> gam Mg, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm. Đun nóng, có màu hồng<br /> từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tím [6].<br /> Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%.<br /> Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất<br /> hiện màu xanh đen.<br /> b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)<br /> SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua<br /> pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần tách .<br /> 1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid<br /> a) Phương pháp cân: Ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavone hoặc flavonol và dịch<br /> chất ít tạp chất.<br /> b) Phƣơng pháp trắc quang<br /> Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung<br /> dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường<br /> thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng. Phương trình định lượng của phép đo dựa trên định<br /> luật Lamber-Beer: A = K.C<br /> 3<br /> <br /> Trong đó: A: Độ hấp thụ quang<br /> K: Hằng số thực nghiệm<br /> C: Nồng độ chất phân tích<br /> Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chất ở khoảng 10 -5 – 10-7M và là một<br /> trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến.<br /> Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối<br /> diazoni, tạo phức màu với AlCl3, muối titan…<br /> Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng như độ chính xác khá cao và là<br /> phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích.<br /> c) Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)<br /> Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác<br /> nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha<br /> động và một pha tĩnh. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion<br /> hoặc rây phân tử.<br /> Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra<br /> khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ.<br /> CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu<br /> Nụ và lá vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc họ Sim<br /> (Myrtaceae) được thu hái ở các địa phương khác nhau, ở các tỉnh phía Bắc. Sau đó phơi và<br /> sấy ở 500C cho đến khô. Các mẫu nụ và lá vối được lưu ở Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn,<br /> Viện Dược liệu<br /> 2.2 Nội dung nghiên cứu<br /> - Phân lập một flavonoid chính từ nụ vối. Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết<br /> cho việc định tính, định lượng.<br /> - Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối.<br /> - Xây dựng phương pháp định lượng một flavonoid chính từ lá và nụ vối.<br /> 2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi<br /> 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ<br /> - Cân kỹ thuật Precisa XT 620M<br /> - Cân phân tích Precisa XT 220A<br /> - Máy cất quay Buchi B481<br /> - Tủ sấy Binder – FD 115<br /> - Đèn tử ngoại<br /> - Hệ thống HPLC _ LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản)<br /> - Máy TLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG REPROSTAR3.<br /> - Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản)<br /> 2.3.2 Hóa chất, dung môi<br /> <br /> 4<br /> <br /> - Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn<br /> phân tích, dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại<br /> trước khi dùng.<br /> - Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck).<br /> - Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck).<br /> - Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phương pháp hóa học, định<br /> tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang,<br /> HPLC.<br /> CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ vối<br /> 3.1.1. Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn<br /> Cân 8 kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết bằng ethanol 96% bằng phương pháp ngâm<br /> lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm là 1 tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm 3<br /> lần (dịch đã nhạt màu). Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol và cô<br /> cách thủy, thu được cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hòa tan một lượng vừa đủ<br /> 0,5 lít ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thêm 1,5 lít nước cất để hòa tan. Quy trình chiết được<br /> tóm tắt ở sơ đồ 3.1:<br /> <br /> 3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat<br /> Cân khoảng 300g cao phân đoạn EtOAc Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan:<br /> ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung môi từ 49:1 đến 1:1). Dùng bình nón có thể<br /> tích 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu được 32 bình (200 ml). Tất cả các bình hứng<br /> đều được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho<br /> sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng (hình 3.1), gộp các bình này lại, cất thu hồi dung môi và<br /> cô cách thủy đến khô thu được chất rắn có màu da cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g).<br /> <br /> a) Hình ảnh SKLM<br /> <br /> b) Hình ảnh chất CO-1<br /> <br /> Hình 3.1: Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối<br /> <br /> 5<br /> <br />