Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08-A12) kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:25

Thêm vào BST

Báo xấu

88
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn nhằm phân loại chủng xạ khuẩn VN08 - A12; lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để khả năng sinh hoạt chất của chủng xạ khuẩn là cao nhất; tinh sạch và xác định cấu trúc của hoạt chất kháng Xoo sinh ra bởi chủng xạ khuẩn VN08 - A12.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08-A12) kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Dương Văn Hợp TS. Phạm Thế Hải Hà Nội - 2014
1 MỞ ĐẦU 1.Lý do chọn đề tài: Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, xuất hiện khá phổ biến trên các khu vực trồng lúa ở Việt Nam, đặc biệt tập trung ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh gây hại trong vụ lúa hè thu nhiều hơn trong vụ đông xuân do thời tiết ẩm ướt, nhiều sương mù, độ ẩm không khí cao. Bệnh xuất hiện và gây hại từ giai đoạn lúa đẻ nhánh đến đòng trổ và chín.Bệnh bạc lá lúa gây thiệt hại rất nặng nề cho ngành nông nghiệp, làm giảm năng suất lúa 25 - 50 %, thậm chí mất trắng(Số liệu thống kê của cục bảo vệ thực vật).Một trong những giải pháp quan trọng nhất phòng trừ bệnh bạc lá lúa hiện nay là sử dụng các dòng lúa mang gen kháng bệnh.Tuy nhiên, các dòng lúa chỉ mang một vài gen kháng đơn lẻ, được nuôi trồng liên tục trên diện rộng dẫn đến tình trạng các chủng Xoo có khả năng gây bệnh ngay cả khi có các gen kháng đó [18]. Chính vì vậy, việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa bằng biện pháp sinh học đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu [36]. Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương, được biết đến như nguồn sinh các chấtkháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học [6]. Bộ sưu tập hơn 3000 chủng xạ khuẩn đang đượcbảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi Sinh và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN hứa hẹn tiềm năng tìm ra các chất có hoạt tính sinh học mới dùng cho việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam hiện nay. Trong nghiên cứu này, được sự tài trợ của quỹ đề tài NAFOSTED, TS. Phan Thị Phương Hoa và các cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn và lựa chọn được 17 chủng có khả năng kháng tất cả 10 chủngXoo. Trong đó, lựa chọn chủng VN08-A12 là một tác nhân kiểm soát sinh học của bệnh bạc lá lúa. Chủng VN08-A12 có nhiều ưu điểm nổi bật đã được thử nghiệm ngoài đồng ruộng và thu được kết quả rất đáng mừng. Kết quả cho thấy chủng VN08-A12 không chỉ có thể làm giảm chiều dài tổn thương của cây lúa do nhiễmXoo, mà còn làm giảm đáng kể tổn thất năng suất của giống lúa bị nhiễm Xoo [23][24]. Chính vì vậy, để phát triển một chế phẩm khống chế sinh học để kiểm soát bệnh bạc lá lúa, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08-A12) kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae”. 2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu - Phân loại chủng xạ khuẩn VN08 - A12. - Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để khả năng sinh hoạt chất của chủng xạ khuẩn là cao nhất. - Tinh sạch và xác định cấu trúc của hoạt chất kháng Xoo sinh ra bởi chủng xạ khuẩn VN08 - A12.
2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Bệnh bạc lá lúa và tác hại của bệnh bạc lá lúa 1.1.1. Giới thiệu chung Bệnh bạc lá lúa - hay còn gọi là bệnh cháy bìa lá lúa (Bacterial leaf blight disease) là một trong những bệnh phổ biến trong các nước trồng lúa. Bệnh bạc lá lúa được phát hiện lần đầu ở vùng Fukuoko, Kyushu, Nhật Bản ngay từ những năm 1884 [45]. Hiện nay, bệnh bạc lá đã xảy ra trên rất nhiều quốc gia, đặc biệt ở châu Á. Ở nhiều nước châu Á, căn bệnh này đã trở thành đại dịch trên lúa. Bệnh có thể làm giảm sản lượng ở mức độ khác nhau, tùy thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh của cây, mức độ nhạy cảm của giống lúa và ảnh hưởng của môi trường. Ở một số nước châu Á và Đông Nam Á, bệnh bạc lá lúa thường làm giảm năng suất 10-20 %nhưng có thể lên đến 50% [33][38]. Ở Nhật Bản, thiệt hại năng suất ước tính là 20-30% thậm chí đến 50%. Ở vùng nhiệt đới, bệnh phá hoại gây ảnh hưởng nặng tới hàng triệu ha lúa. Ở Ấn Độ, thiệt hại về sản lượng từ 6 đến 60%. Việc giảm sản lượng chủ yếu là do giảm số lượng bông và trọng lượng hạt [43]. Hình 1.Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩnXoo. (www.thaibinhseed.com.vn/benh-bac-la-lua) 1.1.2. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Vi khuẩn này có tế bào hình que với đầu tròn, với chiều dài từ 0,8 đến 1 µm, chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy. Đây là loại vi khuẩn Gram âm và không sinh bào tử, khuẩn lạc hình tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng (hình 2) [9].Vi khuẩn này chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn rồi dẫn đến nhiễm trùng toàn thân cây lúa. Ngoài ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗ thùy khổng ở mép lá, đầu mút lá dễ dàng gây tổn thương dọc theo gân lá [39].
3 5µm Hình 2. Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xoo [9] Loại vi khuẩn này đầu tiên được các nhà khoa học Nhật Bản, Hori và Bokura đặt tên là Bacillus oryzae từ năm 1911 và được đổi tên nhiều lần..[49][50]. 1.2. Các cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa 1.2.1. Sử dụng thuốc hóa học Thuốc hóa học được sử dụng để giết chết hoặc ức chế sự nhân lên của các tác nhân gây bệnh bằng cách ngăn chặn con đường trao đổi chất của vi khuẩn. Một số hóa chất được sử dụng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa như Bordeaux có hoặc không có đường, hỗn hợp đồng xà phòng, thuốc diệt nấm và đồng thủy ngân, dịch phun oxychloride. Ở Ấn Độ, sử dụng bột Clo trong xử lý nước cũng làm giảm bệnh [11]... [54]. Việc sử dụng các thuốc hóa học luôn mang lại hậu quả rất nặng nề đối với môi trường. Đồng thời, cũng chưa có phương thức kiểm soát bằng hóa chất nào mang lại hiệu quả cao bởi vì khả năng tồn tại và phát triển của các chủng kháng thuốc. 1.2.2. Chọn giống lúa kháng bệnh Chọn giống lúa kháng bệnh hiện nay cũng là phương pháp đang được quan tâm. Hiện nay, 23 gen kháng bệnh bạc lá lúa (Xa) đã được công bố (bảng 1).Các đoạn mồi cũng đã được thiết kế để phát hiện các gen Xa trên các giống lúa khác nhau (bảng 2). Bảng 1. Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa[37] Tên gen Xa mới Tên gen Xa cũ Nhiễm sắc thể Giống, dòng lúa đại diện Xa1 Xa1 NST 4 Kogyoku Xa1-h Xa-1h NST 4 IR28, IR29, IR30 Xa2 Xa2 NST 4 Rentai Emas2, tẻ tép Xa3 Xa-w NST11 Wase Aikoku3 Xa-4b NST11 Semora Mangga Xa-6 NST-5 Zenith Xa-9 NST-6 Sateng
4 Tên gen Xa mới Tên gen Xa cũ Nhiễm sắc thể Giống, dòng lúa đại diện Xa4 Xa-4 NST11 TKM6, IR20, UR22 Xa5 Xa-5 NST 4 DZ192,IR1545-339 Xa7 Xa-7 NST 4 DV85, DZ78 Xa8 Xa-8 NST 4 PI231129 Xa10 Xa-10 NST11 Cas 209 Xa11 Xa-11 RP 9-3, IR8 Xa12 Xa-kg NST4 Kogyoku, Java14 Xa12-h Xa-kgh NST 4 IR28, IR29, IR30 Xa13 Xa-13 NST 5 BJ1, Chinsura Boro II Xa14 Xa-14 Tai chung Native 1 Xa15 (t) Xa-nm (t) M41 Xa16 Xa-16 Tẻ tép Xa17 Xa-as(t) NST 4 Asominori Xa18 Xa-18 IR24, Milyang 23 Xa19 Xa19 Đột biến XM5 Xa20 Xa-20 Đột biến M6 Xa21 Xa-21 NST 11 IRBB21 Xa22 (t)b Xa-22 (t) NST 11 Zachanglong Xa23 (t)b Xa-23 (t) NST 11 WBB1 Bảng 2. Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa [15] Mồi Trình tự nucleotide Xa-gen MP1 5'-ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG-3' Xa-4 MP2 5'-dTG-CTA-TAA-AAG-GCA-TTC-GGG-3' RG556 F 5'-TAG-CTG-CTG-CCG-TGC-TGT-GC-3' Xa-5 RG556 R 5'-AAT-ATT-TCA-GTG-TGC-ATC-3' P3 F 5'-CAG-CAA-TTC-ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3' Xa-7 P3 R 5'-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT-ATC-GGA-3' Xa21F 5'-ATA-GCA-ACT-GAT-TGC-TTT-GC-3' Xa-21 Xa 21 R 5'- CGA - TCG - GTA - TAA- CAG-CAA-AAC-3' RG136 F 5' - TCC-CAG-AAA-GCT - ACA-GC-3' Xa-13 RG136 R 5' - GCA-GAC-TCC-AGT=TTG-ACT-TC-3' Gen Xa21 lần đầu tiên được phát hiện trong một giống lúa hoang dại Oryza longistaminata và đã dược chuyển vàogiống lúa IR24 để tạo ra giống lúa kháng bệnh IRBB21 [30]. Ở Ấn Độ và
5 Philippin, giống lúa này đã được chứng minh là có khả năng kháng với hầu hết các chủngXoo. Tuy nhiên, cho đến nay một số chủngXoo ở một số vùng của châu Á đã được phát hiện là có thể vượt qua được gen kháng Xa21 trong giống lúa IRBB21 (hình 3) [18]. 1.2.3. Khống chế sinh học Các thuốc hóa học đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa nhưng không được ứng dụng rộng vì những biến đổi khó lường của các tác nhân gây bệnh. Sự xuất hiện các quần thể kháng thuốc đặt ra mối đe dọa nghiêm trọng cho chiến lược kiểm soát hóa học lâu dài. Đồng thời, các chất hóa học thường rất độc hại đối với người sử dụng, gây ảnh hưởng đến các loài sinh vật khác, và tích lũy qua thời gian dài sẽ gây ảnh hưởng trầm trọng lên hệ sinh thái. Việc chọn tạo giống kháng bệnh cũng đã được áp dụng nhưng các nhóm quần thể kháng lại gen kháng bệnh cũng phát triển nhanh chóng. Do đó, kiểm soát sinh học được cho là một giải pháp sinh thái có hiệu quả cho việc ngăn ngừa bệnh bạc lá lúa [27]. Islam và Bora (1998) đã đưa ra biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá bằng việc sử dụng 2 chủng vi khuẩn Rhizobacterial vào việc khử trùng hạt giống. Kết quả cho thấy việc xử lý hạt giống không chỉ có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của bệnh bạc lá mà còn có tác dụng làm tăng năng suất lúa [17][29]. 1.3. Xạ khuẩn 1.3.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao hơn 55%. Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn [12]. Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất. Trong đất xạ khuẩn chiếm từ 9% - 45% tổng số vi sinh vật, số lượng trung bình khoảng 106 - 108 tế bào/ g đất. Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu chất dinh dưỡng hữu cơ, khoáng và lớp đất trên bề mặt (đến 40 cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn. Trong 1 g đất canh tác có thể có tới 5 x 106 tế bào xạ khuẩn, trong khi đó đất vùng sa mạc, nóng, khô, độ ẩm thấp, nghèo chất dinh dưỡng, có số lượng xạ khuẩn thấp hơn 10 - 100 lần, dao động trong khoảng 104 - 105 tế bào/ 1 g đất. Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc nhiều vào độ pH của môi trường, thường có nhiều trong lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, trong khoảng pH 6,0 - 8,0. Xạ khuẩn không có nhiều trong lớp đất kiềm hay axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm. Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [4].
6 A B Hình 4. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn. (A) Actinoplanes brasiliensi (VTCC-A- 2908). (B) khuẩn lạc chủng Streptomyces lannensis (VTCC-A2780). C D Hình 5. Cuống sinh bào tử của một số chủng xạ khuẩn. (C) Nonomuraea roseoviolacea (VTCC - A- 2062). (D) Streptomyces malachitofuscus (VTCC - A - 2789). 1.3.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh. Trong số 5500 chất kháng sinh hiện nay có 4000 chất có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng rộng, kìm hãm và ức chế được nhiều loại vi sinh vật khác nhau [35]. Rất nhiều chất kháng sinh được sinh ra bởi xạ khuẩn đang được sử dụng rộng rãi trong thực tế hiện nay như:Streptomycin, neomycin, gentamycin, tetracyclin, cloramphenicol, erythromycin, novobiocin, amphoterycin, daunorubixin… [40]. [25][19][7][42][52]. 1.3.3. Sử dụngxạ khuẩn trong khống chế sinh học
7 Một trong những phương pháp kiểm soát sinh học được tập trung nghiên cứu đó là sử dụng các chủng xạ khuẩn. Các chủng xạ khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật bằng cách tác động trực tiếp như thải ra sắt, photpho hòa tan và sản sinh các hormone thực vật hoặc gián tiếp như ức chế tác nhân gây bệnh hoặc cảm ứng các cơ chế kháng của thực vật chống lại mầm bệnh [14][22]. Một số chủng thuộc chi Streptomyces đã được chứng minh là không những hỗ trợ thực vật trong việc hấp thu các chất dinh dưỡng mà cònkiểm soát các tác nhân gây bệnh cho cây trồng [20].Ngoài ra, một số chủng Streptomyces spp. phân lập từ 21 mẫu đất Indonesia được công bố có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis và Gram âm Xanthomonas axonopodis [32]. Các kết quả thử nghiệm đã chứng minh chủng P.fluorescens này có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh cây củ cải đường, lúa mạch và cây thuốc lá. Các nghiên cứu của Ji và cộng sự năm 2008 đã cho thấy chủng Lysobacter antibioticus 13-1 có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loài nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật, trong đó có Xoo [29]. 1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trong kiểm soát bệnh bạc lá lúa Tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, TS. Phan Thị Phương Hoa và cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn đang được lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) và tìm được 167 chủng được lựa chọn với khả năng kháng cao nhất cả hai chủng kiểm định Micrococcus luteus NBRC 13867 và Escherichia coli NBRC 14237 [23]. Các chủng xạ khuẩn này được tiếp tục sàng lọc khả năng kháng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 và R10 do PGS. TS. Phan Hữu Tôn (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội)và cộng sự phân lập. Trong số 167 chủng xạ khuẩn này, 17 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng cả 10 chủng Xoo. Để nghiên cứu khả năng kháng đặc hiệu đối với Xoo của các 17 chủng xạ khuẩn, các chủng vi sinh vật Bacillus subtilis NBRC 3134, Saccharomycescerevisiae NBRC 10217, Azotobacter sp. VTCC - B-106 và Pseudomonas putida VTCC - B-657 được sử dụng. 5 chủng VN06 - A -353, VN08 - A - 306, VN08 - A - 352, VTCC - A - 99, VN10 - A - 44 và VN08 - A12 có tính đặc hiệu cao với Xoo, chúng chỉ ức chế một loại vi sinh vật kiểm định. Trong số đó, chủng VN08 - A12 sinh trưởng tốt nhất và không gây ức chế những vi sinh vật có lợi như Azotobacter sp. (VTCC - B - 106) và Pseudomonas putida (VTCC - B - 657). Những thử nghiệm ngoài đồng ruộng trên 2 giống lúa Oryza sativa L. SS1 và Oryza sativa L. KD18 cho thấy dịch nuôi cấy của chủng VN08 - A12làm giảm đáng kể tổn thương do Xoo gây ra trên lá lúa [23]. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại và phân tích hoạt chất kháng Xoo do chủng VN08-A12 sinh ra.
8 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.1.1. Các chủng Xoo 10 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam đã nhận được từ PGS. TS. Phan Hữu Tôn và cộng sự (trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội). 2.1.1.2. Các chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 được phân lập năm 2008 hiện đang được lưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật học (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 2.1.1.3. Vi sinh vật kiểm định Sáuchủng vi sinh vật kiểm định được sử dụng hiện đang được bảo quản tại VTCC bao gồm: - Pseudomonas putida (VTCC - B-657);Saccharomyces cerevisiae (VTCC - Y-62);Bacillus subtilis(VTCC-B-888); Azotobacter sp.(VTCC - B-106);Fusarium oxysporum (ATCC - 7601);Staphylococcus aureus (ATCC - 29923). 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất 2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị 2.1.2.3. Môi trƣờng nghiên cứu  Môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn: + Môi trường 2M (g/l); Môi trường No. 8(g/l); Môi trường 301 (g/l); Môi trường A-3M g/l); Môi trường A-16 (g/l); Môi trường SKS (g/l); Môi trường YS (g/l). Môi trƣờng thử hoạt tính kháng vi khuẩn: + Môi trường PSA (g/l); Môi trường YM (g/l; Môi trường thạch thường (g/l); Môi trường Muller- Hinton (g/l 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật 2.2.1.1. Phương pháp thỏi thạch 2.2.1.2. Phương pháp đục lỗ thạch 2.2.2. Phân loại bằng đặc điểm hình thái 2.2.2.1. Hình thái khuẩn lạc 2.2.2.2. Hình thái chuỗi sinh bào tửvà bề mặt bào tử 2.2.3.Hóa phân loại 2.2.3.1. Phân tích thành phần axit amin trong thành tế bào
9 2.2.3.2. Phân tích thành phần menaquinone 2.2.3.3. Phân tích thành phần axit béo 2.2.3.4. Phân tích thành phần G+C trong AND 2.2.4. Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S – rADN 2.2.5. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn 2.2.5.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 2.2.5.2. Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 2.2.5.3. Lựa chọn thể tích nuôi cấy thích hợp 2.2.5.4. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 2.2.5.5. Lựa chọn cách cấy giống 2.2.6. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo 2.2.6.1. Tách dịch chiết thô 2.2.6.2. Tinh sạch bằng silica gel 2.2.6.3. Tinh sạch bằng HPLC 2.2.7.Xác định khối lƣợng phân tử bằng khối phổ (MS) CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 được tiến hành thử hoạt tính kháng với 10 chủng Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) từ R1 đến R10 bằng phương pháp thỏi thạch. Kết quả đường kính vòng hoạt tính kháng Xoo được thể hiện trong bảng 5. Bảng 5. Hoạt tính kháng 10 chủng Xoo của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d: mm) R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 VN08- 10±1 14±1 18±1 12±4 8±1 14±2 8±1 5±1 8±1 10±1 A12 Kết quả trong bảng 5 cho thấy chủng VN08 - A12 có khả năng kháng cả 10 chủng Xoo. Trong đó, chủng này có khả năng kháng mạnh đối với R2, R3 và R6 nhưng kháng yếu với R8. Bảng 6. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 STT Chủng Vi sinh vật kiểm đinh Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d: mm) 1 Pseudomonas putida VTCC - B-657 - 2 Fusarium oxysporum ATCC - 7601 - 3 Staphylococcus aureus ATCC - 29923 - 4 Saccharomyces cerevisiae VTCC - Y - 62 -
10 5 Bacillus subtilis VTCC - B - 888 - Kết quả cho thấychủng xạ khuẩn VN08 - A12 không ức chế vi sinh vật kiểm định nào. Ngoài ra, chủng VN08 - A12 có khả năng tăng trưởng khá nhanh. Vì vậy, chủng VN08 - A12 được tiếp tục kiểm tra khả năng ức chế đối với hai vi sinh vật có lợi Azotobacter sp. (VTCC - B - 106) và Pseudomonas putida (VTCC - B - 657). Kết quả thử hoạt tính cho thấy chủng VN08 - A12 không kháng cả hai loại vi khuẩn được kiểm tra này (Bảng 7). Như vậy, chủng VN08 - A12 có khả năng kháng rất đặc hiệu với vi khuẩn Xoo. Bảng 7. Hoạt tính kháng vi sinh vật có lợi của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng xạ khuẩn Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D - d, mm) Azotobacter sp. (VTCC - Pseudomonas putida B - 106) (VTCC - B - 657) VN08 - A12 - - 3.2. Phân loại chủng VN08-A12 3.2.1. Phân loạibằng hình thái Sau 7 ngày nuôi cấy trên đĩa thạch YS, chủng VN08-A12 tạo khuẩn lạc lồi, mép tạo viền có dạng sợi tia nhỏ, hệ sợi khí sinh có màu từ trắng đến nâu. Hệ sợi cơ chất có màu nâu nhạt (hình 7A). Đường kính khuẩn lạc 0,5- 2,5 mm, không tiết sắc tố vào môi trường. Chuỗi bào tử của chủng VN08-A12 có dạng thẳng, dài, thường có trên 20 bào tử trong một chuỗi (hình 7B và hình 8C).Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)bề mặt bào tử có dạng nhẵn (hình 8D). A B Hình 7. Khuẩn lạc và chuỗi bào tử của chủng VN08-A12
11 C D 1µm (Ảnh SEM ở 15KVx 5,000) (Ảnh SEM ở 10KVx 30,000) Hình 8. Chuỗi bào tử và bào tử của chủng VN08 - A12 3.2.2. Hóa phân loại 3.2.2.1. Thành phần axit amin trong thành tế bào Thành phần axit amin trong thành tế bào của chủng VN08-A12 được xác định bằng sắc ký bản mỏng như đã mô tả trong phần phương pháp 2.2.3.1 (hình 9).Kết quả so sánh với chất chuẩn cho thấy chủng VN08-A12 chứa LL- DAP. (DAP:Diaminopimelic). LL - DAP Chủng VN08 -A12: Meso - DAP LL - DAP 1 2 Hình 9. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng thành phần axit amin trong thành tế bào của chủng VN08- A12. (1). Chất chuẩn Meso -DAP và LL - DAP (2). Mẫu VN08 - A12
12 3.2.2.2. Thành phần menaquinone Thành phần menaquinone của chủng VN08-A12 được phân tích theo phương pháp đã được trình bày trong mục 2.2.3.2.Mẫu menaquinone sau khi được phân tách bằng sắc ký bản mỏng được thu lại để phân tích bằng LC-MS. Hai đỉnh ở phút 14,019 và 15, 689 trên LC được xác định tương ứng là MK -9(H6) và MK -9(H8) bằng phân tích khối phổ đi kèm (hình 10). Kết quả phân tích diện tích của hai đỉnh này được thể hiện trong bảng 8, cho thấy thành phần menaquinone của chủng VN08-A12 là MK -9 (H6) 51,9% và MK-9(H8) 48,1%. MK - 9 MK - 9 (H8) (H6) Hình 10. Kết quả phân tích LC thành phần menaquinone của chủng VN08-A12. Bảng 8 : Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 Peak Thời Diện tích Chiều Phần trăm Phần trăm Loại menaquinone gian lƣu peak cao diện tích chiều cao của VN08 -A12 peak peak (%) peak (%) 1 14,019 840142 44224 51,961 55,145 MK - 9 (H6) 2 15,689 776728 35972 48,039 44,55 MK - 9(H8) Tổng 1616869 80196 100,00 100,000 3.2.2.3.Thành phần axit béo Thành phần axit béo của chủng VN08-A12 được phân tích bằng hệ thống sắc ký khí kết hợp với phần mềm MIDI theo phương pháp được trình bày trong mục 2.2.3.3. Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 11 và bảng 9,cho thấy chủng VN08-A12 có thành phần axit béo gồm anteios-(anteios-C15:0), iso-(iso-C16:0) và (n-C16:0).
13 Hình 11. Sắc ký đồ thành phần axit béo của chủng VN08-A12 Bảng 9.Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08-A12 Thời gian lƣu Tên peak Tỷ lệ phần trăm 6,974 14: 0 iso 1,77 7,503 14: 0 0,77 8,478 15: 0 iso 9,18 8,619 15: 0 anteiso 19,25 9,064 15: 0 1,13 9,838 16: 1 iso H 2,45 10,119 16: 0 iso 16,02 10,441 16:1 cis 9 11,16 10,744 16: 0 10,09 11,472 16:0 9 methyl 5,41 11,661 17: 1 anteiso 4,89 11,840 17: 0 iso 4,19 12,003 17: 0 anteiso 11,53 12,127 17: 1 0,75 12,438 17: 0 10 methyl 0,45 13,205 18: 1 iso H 0,41
14 3.2.2.4. Thành phần G+C trong AND Thành phần GC của chủng VN08-A12 được phân tích bằng phương pháp HPLC như được trình bày trong mục 2.2.3.4. Kết quả được thể hiện trong hình 12và bảng 10.Kết quả phân tích cho thấy rằng thành phần GC trong ADN của chủng VN08-A12 là 75%. C G T A Hình 12. Sắc ký đồ thành phần GC của chủng VN08-A12 Bảng 10. Kết quả phân tích thành phần GC của chủng VN08-A12 Peak Thời gian Diện tích Chiều cao Phần trăm Phần trăm Thành lƣu peak peak diện tích chiều cao phần peak (%) peak (%) GC 1 2,299 1063153 162556 38,736 40,537 C 2 4,058 1019074 161599 37,130 40,298 G 3 6,302 327432 40445 11,930 10,086 T 4 6,841 334930 36411 12,203 9,080 A Tổng 2744589 401012 100,000 100,000 3.2.3. Trình tự 16S rADN Kết quả Blast search trên GenBank cho thấy chủng VN08-A12 có trình tự 16S rADN hoàn toàn tương đồng với loài Streptomyces toxytricini với tỉ lệ 100%. Cây phân loại của chủng VN08- A12 được dựng bằng phần mềm ClustalX2 và ClustalW2 cho thấy chủng nghiên cứu nằm trong cùng nhóm với nhóm chủng Streptomyces toxytricini (hình 13). Như vậy căn cứ vào các kết quả phân tich về hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa, hóa phân loại và trình tự 16s rADN của chủng VN08 - A12 cho thấy chủng VN08 - A12 thuộc chi Streptomyces toxytricini.
15 Hình 13. Cây phân loại chủng VN08-A12 dựa trên trình tự gen 16S –rADN. 3.3. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng VN08-A12 3.3.1. Môi trường nuôi cấy thích hợp Để lựa chọn môi trường nuôi cấy của chủng VN08-A12 để đạt hoạt tính kháng Xoo cao nhất, 6 loại môi trường đã được lựa chọn để thử nghiệm bao gồm 3M, 16M, 2M, 301, N8 và SKS.... Kết quả được trình bày trong hình 14 và hình 29C.Kết quả cho thấy, môi trường SKS là môi trường tốt nhất cho chủng VN08-A12 để sản sinh chất khángXoo. 35 Đường kính vòng kháng 30 khuẩn (D-d:mm) 25 20 15 10 5 0 3M 16M 2M 301 N8 SKS Môi trường nuôi cấy Hình 14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08-A12
16 3.3.2. Thời gian nuôi cấy thích hợp Chủng VN08-A12 được nuôi lắc trong môi trường SKS ở 30oC, dịch nuôi cấy được thu và thử hoạt tính kháng Xoo ở các ngày khác nhau. Kết quả được trình bày trong hình 15 và hình 29B. Kết quả cho thấy rằng, thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sản sinh lượng chất kháng Xoo. Khả năng ức chế Xoo (R2) đạt cao nhất sau 4 ngày nuôi cấy và giảm dần khi tăng thời gian nuôi cấy. 30 Đường kính vòng kháng khuẩn 25 20 (D:mm) 15 10 5 0 3 4 5 6 7 Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình 15. Ảnh hưởng của thời gian cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08-A12 3.3.3. Thể tích nuôi cấy thích hợp Để xác định thể tích nuôi cấy thích hợp, chủng VN08-A12 được nuôi cấy trong môi trường SKS với các thể tích khác nhauở 30oC. Sau 4 ngày, dịch nuôi cấy được thu để thử hoạt tính khángXoo. Kết quả được thể hiện trong hình 16 và hình 29A…Kết quả này khẳng định oxy là nhân tố quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08-A12. 30 Đường kính vòng kháng khuẩn 25 20 (D-d:mm) 15 10 5 0 25 50 75 100 125 150 Thể tích nuôi cấy (ml) Hình 16. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08-A12 (S.toxytricini)
17 3.3.4. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp Chủng VN08-A12 được nuôi trong môi trường SKS, ở các nhiệt độ khác nhau. Dịch nuôi cấy sau 4 ngày được thử hoạt tính kháng Xoo. Kết quả được trình bày trong hình 17 và hình 29D.Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự sản sinh hoạt chất kháng Xoo. Kết quả cho thấy rằng chủng VN08-A12 được nuôi ở nhiệt 30oC là tốt nhất. 35 Đường kính vòng kháng 30 (D-d:mm) 25 20 khuẩn 15 10 5 0 25 30 35 40 Nhiệt độ nuôi cấy (o C) Hình 17. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08-A12 3.3.5.Cách cấy giống thích hợp Cách cấy giống thường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học. Chính vì vậy, chúng tôi khảo sát các cách cấy giống khác nhau để tìm phương pháp thu được hoạt chất kháng Xoo cao nhất, bao gồm: giống cấp 1 ở 24, 48, 76, 92 giờ và bào tử (1x108, 2x108, 3x108 và 4x108)bào tử. Dịch nuôi cấy sau 4 ngày được thử hoạt tính kháng Xoo (R2). Kết quả được trình bày trong hình 18 hình 29E và hình 29F.Kết quả cho thấy rằngphương pháp cấy bằng giống cấp 1 tốt hơn cấy bằng bào tử. Giống cấp 1 ở các thời điểm khác nhau không ảnh hưởng đến khả năng sinh hoạt chất.
18 29 Đường kính vòng kháng khuẩn 28 27 (D-d:mm) 26 25 24 23 24 48 72 96 1x108 2x108 3x108 4x108 Giống cấp I (1x108) (2x108) (3x108) (4x108) ( Thời gian nuôi – giờ) Bào tử Cách cấy giống Hình 18.Ảnh hưởng của cách cấy giống đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08-A12. 3.4. Tinh sạch và phân tích hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08-A12 3.4.1. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08-A12 Dịch chiết thô của chủng VN08 - A12 được tách chiết bằng 1/2 thể tích ethyl acetate như đã mô tả trong mục 2.2.6.1 và tóm tắt ở sơ đồ hình 19. Hoạt tính kháng Xoo của dịch chiết thô được kiểm tra bằng phương pháp đục lỗ thạch và khẳng định hoạt chất được tách trong dung môi ethylacetate (hình 30A). Dịch chiết thô tiếp tục được tinh sạch bằng cột silica gel, các phân đoạn được thu và thử hoạt tính kháng Xoo (R2) như được trình bày trong mục 2.2.6.2. Hoạt tính của các phân đoạn được thể hiện trong bảng 11 và hình 30B. Các phân đoạn từ 4.1 trở đi đều có hoạt tính chứng tỏ hoạt chất kháng Xoo chỉ có thể thôi khỏi cột với nồng độ ethylacetate trên 80%. Dịch trong Dịch (1V) Ly tâm Dịch trong nuôi cấy (Ly tâm) (Dịch chiết thô) 1/2V Ethyl acetate Hình 19. Quy trình tách dịch chiết thô của chủng VN08 - A12 Bảng 11. Hoạt chất của VN08-A12 thu được từ các phân đoạn khi tinh sạch bằng silica gel