intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:27

62
lượt xem
3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nhằm mục đích giúp quản lý tốt người mang gen và cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài "Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA" với mục tiêu: Phát hiện người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 - OH.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21- Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dương Thị Giang PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN  THỂ THIẾU ENZYM 21­ HYROXYLASE BẰNG KỸ THUẬT MLPA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
  2. Hà Nội ­ 2015
  3. Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ­ Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học:  1. TS. BS Trần Huy Thịnh 2. PGS.TS Nguyễn Quang Huy Phản biện 1: PGS.TS. Trần Vân Khánh Phản biện 2: TS. Nguyễn Đình Thắng  Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp cơ sở chấm luận văn Thạc sĩ   họp tại Trường Đại học Khoa học  Tự nhiên ­ Đại học Quốc gia Hà Nội,  vào hồi 09 giờ, ngày 26 tháng 1 năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại:
  4. ­ Thư viện Quốc gia Việt Nam ­ Trung tâm Thông tin ­ Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
  5. MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh ­ TSTTBS (congenital adrenal hyperplasia ­   CAH) là bệnh gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzym tham gia   vào   quá   trình   tổng   hợp   corticosteroid,   dẫn   đến   rối   loạn   quá   trình   tổng   hợp   hormon vỏ  thượng thận; trong đó, thể  thiếu 21­ hydroxylase (21­OH) hay gặp   nhất và chiếm tỷ  lệ  90 ­ 95%, tiếp theo là thể  thiếu 11β­hydroxylase chiếm 5 ­   9%,   còn   lại   là   các   thể   bệnh   rất   hiếm   gặp   do   thiếu   hụt   3β­hydroxy   steroid  dehydrogenase (3β­HSD), 17α­hydroxylase và 20, 22­ desmolase [1]. Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu enzym 21­hydroxylase là   bệnh   di   truyền   đơn   gen   lặn,  trên  nhiễm   sắc   thể   thường   do   đột   biến   gen  CYP21A2 gây nên. Đối với thể  nặng, nếu bệnh không được chẩn đoán sớm và  điều trị  thích hợp sẽ dẫn đến cơn suy thượng thận cấp và bệnh nhân có thể  tử  vong. Các thể bệnh khác có thể   dẫn đến nam hóa  ở  trẻ  gái, giả  dậy thì sớm ở  trẻ  trai; do đó bệnh  ảnh hưởng nặng nề  đến sự  phát triển thể  chất, chức năng   sinh sản, tâm lý của người bệnh và gia đình [6]. Các đột biến mất đoạn, lặp đoạn và đảo đoạn chiếm tỷ  lệ  khoảng 25 ­  30%, là dạng đột biến gây ra thể  bệnh nặng   nên cần phải có biện pháp chẩn  đoán chính xác và kịp thời. Tuy nhiên, các dạng đột biến này rất khó xác định   bằng các kỹ  thuật PCR thông thường. Gần đây, kỹ  thuật MLPA là một phương  pháp mới với thời gian tiến hành ngắn, đơn giản và độ  nhạy cao đã phát hiện  chính xác các dạng đột biến này trên gen CYP21A2. Việc  ứng dụng kỹ  thuật   MLPA vẫn chưa được khai thác nhiều  ở  Việt Nam, đặc biệt là trong việc xác  định người lành mang gen gây các bệnh di truyền. Chính vì vậy nhằm mục đích   giúp quản lý tốt người mang gen và cung cấp những thông tin hữu ích cho tư vấn  di truyền và chẩn đoán trước sinh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề  tài: Phát   1
  6. hiện   người   mang   gen   bệnh   tăng   sản   thượng   thận   thể   thiếu   enzym   21­   Hydroxylase bằng kỹ thuật MLPA với mục tiêu: Phát hiện người mang đột biến dị hợp tử gen CYP21A2 ở các thành viên gia đình   bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21 ­ OH. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH TSTTBS THỂ THIẾU ENZYM 21­HYDROXYLASE  1.1. Một số nét khái quát về bệnh TSTTBS  Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh hay còn gọi là hội chứng sinh   dục­ thượng thận, là một bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, do sự  thiếu  hụt các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận. Trong đó,   sự  thiếu hụt enzym 21­ hydroxylase (21­ OH) là hay gặp nhất, chiếm tỷ  lệ 90 ­  95%,   tiếp   đến   là   sự   thiếu   hụt   enzym   11β­   hydroxylase   (11­   OH),   3β­  hydroxysteroid dehydrogenase (3β­ HSD), 17α­ hydroxylase (17­ OH) và ít gặp  hơn là sự thiếu hụt 20 ­ 22 desmolase  [35]. Tùy theo mức độ thiếu hụt enzym 21­ hydroxylase mà lâm sàng biểu hiện  ở   các   mức   độ   nặng   hay   nhẹ   khác   nhau.   Thiếu   hụt   hoàn   toàn   enzym   21­   hydroxylase gây bệnh cảnh lâm sàng mất muối với các triệu chứng suy thượng  thận cấp và cường  androgen, thiếu enzym 21­ hydroxylase ở mức độ vừa phải (1   ­ 3%) sẽ  biểu hiện triệu chứng nam hóa đơn thuần do cường androgen và khi  enzym 21­ hydroxylase giảm nhẹ  (20 ­ 50%) sẽ  xuất hiện thể  bệnh không cổ  điển [15]. 1.2. Vài nét về tình hình  nghiên cứu bệnh TSTTBS 1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trên thế giới 2
  7. Đầu thế kỷ 19, Emil Huschke, một nhà giải phẫu và phôi thai học, đã phân  biệt vỏ và tủy thượng thận, đồng thời tìm thấy mối liên quan giữa tuyến thượng  thận và tuyến sinh dục [8]. Bệnh nhân TSTTBS thể  mất muối đầu tiên được   Butler (1939) và Wilkins (1940) mô tả. Năm 1950 ­ 1951, Wilkins, Bartter và cộng  sự  đã chứng minh rằng việc sử  dụng cortisol có thể   ức chế  sự  tổng hợp thừa   androgen trong hội chứng sinh dục ­ thượng thận do TSTTBS [9].    Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã được nhận biết từ  những năm  1930 và được mô tả chi tiết bởi Knudson năm 1951, đó là bệnh di truyền đơn gen  lặn, nằm trên nhiễm sắc thể thường. Năm 1977, Dupont thông báo bản đồ gen và  sự liên kết gần giữa TSTTBS và phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC). Sau đó,  Komainami phân lập được Cytochrome P450c21 là chuỗi peptid đơn. Năm 1982 ­   1983, O’ Neill và Fleishwicle phát hiện sự  liên quan giữa gen CYP21 với MHC   nhóm III gồm yếu tố B, C2, C4A, C4B [37]. Đến nay, nhờ kết hợp phản  ứng PCR với một số kỹ thuật sinh học phân  tử  khác như  giải trình tự  gen, hầu hết các đột biến của gen CYP21 gây bệnh  TSTTBS đã được phát hiện [26].  1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS tại Việt Nam Ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh TSTTBS. Các công   trình nghiên cứu có thể kể đến như: Năm 2004, Triệu Quốc Khánh đã nghiên cứu nhận thức của bố  mẹ  và  bệnh nhân bị bệnh TSTTBS thấy rằng bệnh  ảnh hưởng nặng nề đến tình trạng   tâm lý gia đình và bệnh nhân [2].  Năm 2008, Nguyễn Thúy Giang đã nghiên cứu sự  phát triển thể  chất và  một số yếu tố  ảnh hưởng  ở trẻ TSTTBS đang điều trị  tại Bệnh viện Nhi Trung  ương nhận thấy bệnh gây  ảnh hưởng lớn đến sự  phát triển của trẻ  đặc biệt là  chiều cao [1]. 3
  8. Nhìn chung, ở Việt Nam những nghiên cứu về lâm sàng và ảnh hưởng tâm  lý của gia đình và bệnh nhân là phổ biến, chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh học   phân tử bệnh TSTTBS. 1.3. Tần suất mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Tần suất mắc bệnh trên thế giới là 1/10.000 ­ 1/15.000. Tỷ lệ mắc bệnh cao  nhất  ở  hai quần thể  người Eskimo Yupik (Alaska) và La Réunion (Pháp) với tần  suất 1/282 và 1/2141, tỷ lệ mắc bệnh ở châu Âu là 1/14.000 [28].    Tại Việt Nam, hàng năm có từ 50 đến 70 trẻ được chẩn đoán mới, chiếm  tỷ  lệ  60,7% các bệnh lý tuyến thượng thận và chiếm 2% các bệnh lý di truyền  vào điều trị tại khoa Nội tiết ­ Chuyển hóa ­ Di truyền, Bệnh viện Nhi TW [17].  1.4. Cơ chế bệnh sinh của bệnh TSTTBS Khi thiếu enzym, một hay nhiều con đường tổng hợp hormon bị tắc nghẽn  và hormon dưới chỗ  tắc không được sản xuất đủ, đặc biệt là cotisol. Cơ  chế  điều hòa ngược (feed back) kích thích tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH, gây  tăng sản tuyến thượng thận, kích thích các tế bào chứa melanin tạo hắc tố [26]. 1.5. Lâm sàng bệnh TSTTBS Sự  thiếu hụt enzym 21­ OH dẫn đến sự  thiếu hụt cortisol và/hoặc thiếu  hụt aldosteron cũng như thừa androgen thượng thận. Tùy thuộc vào mức độ thiếu  hụt của 21­ OH mà sự  biểu hiện lâm sàng của TSTTBS được chia thành 3 thể  khác nhau bao gồm: Thể mất muối; Thể nam hóa đơn thuần; Thể không cổ điển 2. CƠ SỞ PHÂN TỬ VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH TSTTBS 2.1. Cơ sở phân tử của bệnh TSTTBS 2.1.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21 Vị trí gen CYP21  Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả  gen CYP21A2P, cả hai cùng  nằm bên trong phức h ợp hòa hợp mô chủ  yếu MHC trên cánh ngắn của NST   4
  9. số  6 vùng 6p21.3. Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P n ằm xen k ẽ  với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ  thể [18], [40]. Cấu trúc gen CYP21 Gen mã hóa cho enzym 21­ OH của vỏ  thượng thận là gen  CYP21A2, có  kích   thước   30   kb   và   cùng   với   giả   gen   không   chức   năng   (nonfunctional  pseudogene), CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3), trong   vùng phức hợp hòa hợp mô chủ  yếu (major histocompatibility complex­MAC)   (cạnh gen HLA). Gen CYP21A2 và gen tương đồng của nó, CYP21A2P, nằm xen  kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B.  Chức năng gen CYP21 Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21­OH gồm 494 acid amin, có vai trò phiên  mã tổng hợp ARNm tiền thân. Phân tử  này trải qua quá trình cắt các intron nối   chính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh. Phân tử này sẽ  được sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21­OH [20]. 2.1.2  Một số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS Hai gen CYP21A2 và CYP21A2P có trình tự  tương đồng nhau. Trình tự  của   gen   giả   CYP21A2P   có   các   loại   đột   biến   thường   thấy   trên   bệnh   nhân  TSTTBS. Điều này có thể  giải thích là do quá trình phân bào giảm nhiễm, sự  bắt chéo không đồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể dẫn tới vi ệc các trình tự  ở   vùng   gen   giả   CYP21A2P   chuy ển   sang   CYP21A2   gây   nên   đột   biến   gen   CYP21A2. Theo th ống kê, 95% các đột biến trên gen CYP21A2 là do chuyển   đoạn từ  gen giả  CYP21A2P, 5% còn lại là do gen CYP21A2 bị  đột biến. Các  đột biến thường gặp trên gen CYP21A2 là xóa đoạn hoặc chuyển đoạn lớn  (Large deletion/convertion), IVS­ 13A/C  → G, I172N. Ngoài ra còn có các đột   biến Q138X, R365W, R473W, P30L, del­ 8 bp cũng có tỷ  lệ  tương đối cao  [28]. 5
  10. 2.2. Đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS TSTTBS do thiếu enzym 21­ OH là một bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm  trên NST thường nên tuân theo quy luật di truyền Mendel. Bệnh chỉ  xảy ra  ở  người mang đồng hợp tử gen lặn.                            Aa  Aa                 AA  Aa  aa          (25%)                    (50%)                   (25%)  Hình 1.4. Quy luật di truyền gen lặn trên NST thường 2.3. Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử Về  mặt xét nghiệm, người mang gen dị  hợp tử  chứa các đột biến gen   CYP21A2 có tăng nhẹ  nồng độ  17­OHP, cortisol sau khi kích thích thượng thận   cao hơn những người bình thường không mang gen [19], [26]. 2.4. Phát hiện người lành mang gen bệnh Người mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện không biểu hiện tính   trạng ra ngoài. Người mang gen bệnh thường có dấu hiệu về lâm sàng hoặc sinh   học nhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì. Tuy vậy có thể  phát hiện dị  hợp   tử  bằng phương pháp sinh hóa. Định lượng 17­ OHP cho những người là thành   viên của gia đình người bệnh, với 17­ OHP  300 ­ 1499 ng/ml được chứng minh là dị  hợp tử  sau nghiệm pháp kích  thích bằng corticotropin (Lee HH el al 2000).  3. CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS  3.1. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng 3.1.1. Chẩn đoán xác định 6
  11. ­   Định   lượng   3   sản   phẩm   cuối   cùng   của   hormon   vỏ   thượng   thận:   Aldosteron, cortisol, và testosteron; 3 chất chuy ển hóa trong nước tiểu là 17­  CS,   17­   OHCS,   pregnanetriol.   Các   xét   nghiệm   này   không   đặc   hiệu   bởi   vì  những thay đổi nồng độ các chất chuyển hóa trên có thể gặp trong u tuyến yên   và u vỏ thượng thận [27], [28]. ­ Định lượng 17­ OHP: 17­ OHP là chỉ số đặc trưng để chẩn đoán TSTTBS  do   thiếu   enzym   21­   OH   và   tăng   nồng   độ   trong   máu   hoặc   tăng   nồng   độ   qua   nghiệm pháp ACTH [28]. 3.1.2. Chẩn đoán phân biệt ­ Dậy thì sớm thật đồng giới, trẻ  trai có tinh hoàn phát triển cùng với   dương vật, thể tích tinh hoàn > 4 ml. Nồng độ FSH và LH tăng cao, không có các   rối loạn hormon khác. ­   Dậy   thì   sớm   giả   khác   giới   ở   trẻ   gái   do   u   thượng   thận   nam   hóa  (Carcinome). U thường lớn 3­ 6 cm. Phát hiện u nhờ các chẩn đoán hình ảnh. 17­   CS nước tiểu tăng cao. Dehydroepiandosterone (DHEA) huyết tương tăng. 17­  OHP máu không tăng. Khi làm test  ức chế  bằng dexamethason, nồng độ  DHEA   huyết tương và nồng độ 17­ CS niệu đều không giảm, giúp chẩn đoán phân biệt  với TSTTBS [28].  ­ U buồng trứng gây nam hóa: Ít gặp, DHEA huyết tương và 17­ CS niệu   không tăng. ­   Buồng   trứng   đa   nang:   Nguyên   nhân   thường   gặp   nhất   do   tăng   tiết  androgen do buồng trứng, triệu chứng nam hóa ít gặp. Hay gặp nhất là triệu   chứng rậm lông, bệnh nhân có thể mập phì, tăng insulin máu, rối loạn dung nạp  glucose. FSH và LH tăng, testosterol tăng ít, andostenedion huyết tương tăng cao   [28]. 3.2. Các phương pháp sinh học phân tử  phát hiện đột biến gen CYP21A2   gây bệnh TSTTBS 7
  12. 3.2.1. Kỹ thuật PCR   Nguyên  tắc  của  PCR   dựa  vào  đặc   điểm  của   quá  trình  sao chép DNA.  Enzym Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn mạch đơn làm  khuôn   để   tổng   hợp   nên   sợi   DNA   mới   bổ   sung   và   cần   phải   có   các   mồi  oligonucleotid để khởi đầu quá trình tổng hợp. Mỗi chu kỳ phản  ứng gồm 3 giai   đoạn khác biệt nhau và điều hòa bởi nhiệt độ. Giống   như   nhiều   bệnh   lý   di   truyền,   PCR   được   sử   dụng   rộng   rãi   để  khuếch đại gen CYP21A2 xác định các đột biến xoá đoạn và phối hợp với các kỹ  thuật sinh học phân tử khác để xác định đột biến đặc hiệu. Tuy nhiên do gen giả  CYP21A2P có tính tương đồng cao với gen thật CYP21A2 nên việc khuếch đại   gen CYP21A2 không dễ thực hiện do đó việc thiết kế mồi phải có trình tự  đặc  hiệu với gen CYP21A2 mà không đặc hiệu CYP21A2P [22]. 3.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) Đoạn DNA cần giải trình tự  được sử  dụng như  trình tự  mẫu cho phản   ứng   khuếch   đại   gen   (PCR)   bắt   đầu   từ   vị   trí   gắn   mồi.   Hỗn   hợp   của   cả  deoxynucleotid và dideoxynucleotid được sử  dụng trong phản  ứng với nồng độ  sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn  trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự  gắn các dideoxynucleotid sẽ  làm gián  đoạn quá trình kéo dài các DNA được tổng hợp, kết quả sẽ  tạo ra hỗn hợp các  sợi DNA có kích thước khác nhau. 3.2.3. Kỹ thuật Souther blot Souther blot là phương pháp được sử  dụng rộng rãi nhất để  phát hiện đột biến  xóa đoạn gen lớn, đột biến lặp đoạn… Đây là phương pháp mất nhiều thời gian  và công sức nhưng lại rất hiệu quả.  3.2.4. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) 8
  13. Nguyên tắc của MLPA là sử dụng các đoạn dò DNA (probe) có khả  năng   lai đặc hiệu với các phân tử DNA đích. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotid dài   và ngắn [32].               Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC­ Holland): Kit gồm các probe sử  dụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2. Hỗn hợp probe này  bao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tương đương với  các đột biến mất đoạn 8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X. Hỗn hợp probe này còn  bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổ  thể  (C4A, C4B). Ngoài ra, có 22 probe đặc trưng cho gen của người cũng được   sử  dụng trong hỗn hợp để  làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y   để xác định giới tính.  9
  14. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh  thể thiếu enzym 21­hydroxylase được  chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết ­ Chuyển hóa ­ Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung   ương; các thành viên trong gia đình bệnh nhân bao gồm bố, mẹ, anh, chị, em ruột của   bệnh nhân. 2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị ­ Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA). ­ Máy điện di: Mupid (Nhật Bản). ­ Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ­Bio­Rad (USA). ­ Máy giải trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ). 2.2.2. Hoá chất Hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử như để tách chiết DNA, điện di  DNA được cung cấp từ hãng invitrogen). Hóa chất để thực hiện phản ứng MLPA:    ­ SALSA MLPA Kit P050­ B2­ CAH. ­ Hãng MRC ­ Holland, Amsterdam, HàLan.  ­ Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC­ Holland): Kit này gồm các Probe  sử dụng trong chẩn đoán đột biến gene CYP21 gọi là P050­ B2. 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu  ­ Đề tài được tiến hành tại Khoa Nội tiết ­ Chuyển hóa ­ Di truyền Bệnh viện Nhi   Trung ương. ­ Các  xét nghiệm  sinh học   phân tử   thực  hiện tại Trung  tâm Nghiên  cứu Gen  ­  Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. ­ Thời gian nghiên cứu 1 năm: từ tháng 9 năm 2014 đến 9 năm 2015. 10
  15. 2.4. Đạo đức trong nghiên cứu Trước khi tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm phải có sự đồng ý của đối   tượng nghiên cứu: Tham gia tự nguyện vào nghiên cứu. Các thông tin của bệnh nhân và gia đình sẽ được đảm bảo bí mật.  Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ  các quy định đạo đức trong nghiên cứu Y­ sinh   h ọc . 2.5. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả, cắt ngang. 2.5.1. Thiết kế nghiên cứu 10 bệnh nhân và 22 thành viên gia đình bệnh nhân TSTTBS Xây dựng phả hệ Thu thập mẫu máu ngoại vi Tách chiết DNA Kỹ thuật MLPA xác định đột biến và xác định người lành mang gen bệnh Phân tích kết quả Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.5.2 Tiến hành xét nghiệm   11
  16. 2.5.2.1. Quy trình thu thập mẫu nghiên cứu và tách chiết DNA Bệnh nhân và các thành viên của gia đình bệnh nhân lấy 2 ­ 5 ml máu ngoại vi. Tách   chiết DNA bằng Phenol  Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform:  Bước 1: Phá vỡ hồng cầu Bước 2: Rửa bạch cầu Bước 3: Phá vỡ bạch cầu Bước 4: Loại bỏ protein Bước 5: Tủa DNA và thu DNA 2.5.2.5. Kỹ thuật  MLPA xác định đột biến xóa đoạn  ­ Tiến hành phản ứng MLPA        + Bước 1: Biến tính DNA.     + Bước 2: Gắn (lai) probe vào gen đích.        + Bước 3: Nối 2 đầu probe        + Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (probe). Sản phẩm khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản huỳnh quang trên máy giải   trình tự gen để phân tích kết quả. 12
  17. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA DNA mẫu máu của 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh và 22 thành viên  gia đình sau khi tách chiết theo quy trình Phenol/ Chloroform/ Isoamyl Alcohol được đo   nồng độ và độ tinh sạch đồng thời điện di đánh giá chất lượng DNA. Kết quả đo mật độ quang Các mẫu DNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ  quang học trên máy Nano­drop. Kết quả đo nồng độ của các mẫu DNA giao động trong khoảng 100 ­ 200  ng/µl và độ  tinh sạch giao động trong khoảng 1,8­ 2,0. Kết quả kiểm tra DNA tổng số  Song song với việc đo OD để đánh giá chất lượng của sản phẩm tách chiết thì  DNA tổng số còn được điện di trên gel agarose 0,8%.                  P1        P2         P3        P4        P5        T1        T2       T3         T4       T5    Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số P1­P5: Mẫu bệnh nhân; T1­T5: Mẫu thành viên gia đình bệnh nhân Kết quả  hình 3.2 cho thấy các mẫu DNA cho một băng sáng rõ nét, không băng  phụ, không bị đứt gãy.   13
  18. 3.2. Kết quả phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân và phát hiện người lành   mang gen bệnh Phân tích phả  hệ  của 10 bệnh nhân bệnh TSTTBS thể  thiếu 21­OH, có 22 thành  viên gia đình được phân tích gen. Trong cac thanh viên gia đinh, co 10 ng ́ ̀ ̀ ́ ười mẹ  và 10  người bố  tỷ  lệ: 91%. Em ruôt bênh nhân co 2 ng ̣ ̣ ́ ươi (ty lê 9%) đa đ ̀ ̉ ̣ ̃ ược phân tich gen, ́   trong đo: em trai: 4,5%, em gai: 4,5%.  ́ ́ Tiến hành xác định đột biến gen trên nhóm bệnh nhân bằng kỹ  thuật MLPA, kết   quả  cho th ấy: Đã phát hiện đượ c 6/10 bệnh nhân có đột biến xóa đoạ n exon. Tiến  hành xác đị nh ngườ i lành mang gen b ệnh trên nhóm bố, mẹ  và một số  thành viên gia   đình đã phát hiện đượ c tình trạng mang gen  ở tr ạng thái dị hợp tử. Kết quả  phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh của gia   đình MS01:  Hình 3.3. Phả hệ gia đình số 01 Phả  hệ  của gia đình số  1 có 3 thế  hệ, thế  hệ  thứ  1 và thứ  2 không có người bị  bệnh. Ở thế hệ thứ 3, 1 con trai (III.5), 4 tuổi bị bệnh TSTTBS thể  mất mu ối. Có mang  gen đột biến đồng hợp tử  xóa đoạn exon 1 đến exon 8 gen   CYP21A2. Các anh, chị  họ  (III.1, III.2, III.3, III.4) của bệnh nhân không có biểu hiện bệnh. Bố (II.6) 27 tuổi và mẹ  (II.5) 26 tuổi đều là người lành mang đột biến dị hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 8.                                                                    14
  19. Người bình thường Ex4 C4B C4A E10P Ex1 Ex8 Ex3 I2P Ex6 E1P Y Bệnh nhân Ex3 Ex4 Y Ex1 Ex6 Ex8 Bố bệnh nhân Ex3 Ex4 Y Ex6 Ex8 Ex1 Mẹ bệnh nhân Ex3 Ex4 Ex6 Ex8 Ex1 Y Hình 3.4.  Kết quả MLPA gia đình mã số 01             Hình ảnh phân tich gen băng ky thuât MLPA trên gen ́ ̀ ̃ ̣  CYP21A2 cho thấy ở người  bình thường xuất hiện đủ các đỉnh trong khi đó bệnh nhân không thấy xuất hiện các đỉnh   tương ứng với exon 1 đến exon, vì vậy, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ  exon 1 đến   15
  20. exon 8. Phân tích kết quả ở người bố và người mẹ bệnh nhân cho thấy các đỉnh của exon   1 đến exon 8 chỉ  bằng 1/2 so với người bình thường, chứng tỏ  bố, mẹ  bệnh nhân là   người mang gen bệnh.   Kết quả  phát hiện đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh của gia   đình MS02:  Hình 3.5. Phả hệ gia đình số 02 Gia đình có con gái 2 tuổi bị  bệnh TSTTBS thể  mất muối, kiểu gen đột biến là  đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 đến exon 3. Bố mẹ bệnh nhân có kiểu hình bình thường và   đều mang đột biến dị hợp tử  xóa đoạn exon 1 đến exon 3. Trong gia đình không ai mắc   bệnh giống bệnh nhân. 16
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
14=>2