BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------------------- MẪN HỒNG PHƯỚC
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC-XIN BẤT HOẠT
PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ
(Epinephelus spp.)
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Mã số : 942 02 01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
Hà Nội - 2023
Công trình được hoàn thành tại:
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS)
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Thị Tâm
2. PGS.TS. Đồng Văn Quyền
Phản biện 1: PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy
Phản biện 2: PGS.TS. Kim Văn Vạn
Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại:
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) ...... ngày .. tháng...
năm............
Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư Viện Quốc gia
2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngành nuôi trồng thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam và liên tục tăng trưởng trong những năm gần đây cả về diện tích và sản lượng. Tổng sản lượng thủy sản năm 2022 ước đạt 9.026,3 nghìn tấn, tăng 2,7% so với năm 2021, trong đó sản lượng thủy sản nuôi trồng ước đạt 5.163,7 nghìn tấn, tăng 6,3% so với năm 2021. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới cũng như ở Việt Nam luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt trong những năm gần đây, các bệnh do vi rút trên động vật thủy sản như bệnh xuất huyết cá trắm cỏ, bệnh vi rút mùa xuân trên cá chép, bệnh Iridovirus trên cá mú, bệnh hoại tử tụy truyền nhiễm, hoại tử lách và thận truyền nhiễm, hoại tử cơ quan tạo máu truyền nhiễm, tụ huyết trùng do vi rút gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho nuôi trồng thủy sản.
Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) được phát hiện ở hầu hết các nước trên thế giới, gây ảnh hưởng đến hơn 120 loài cá biển, trong đó có nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao. Bệnh đã được xác định là do vi rút hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây ra. Cá mắc bệnh hoại tử thần kinh xuất hiện các triệu chứng đặc trưng: bơi lội không định hướng, thân sẫm màu, bỏ ăn, 80 -100% cá bị bệnh có thể chết sau 3-5 ngày.
Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ngày càng có xu hướng gia tăng qua các năm, phạm vi lây nhiễm rộng, tỷ lệ mắc cao, chủng loại đa dạng, thời gian khởi phát kéo dài, vì thế, việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản là vấn đề cấp thiết. Kiểm soát dịch bệnh bằng chế phẩm vi sinh, chất kích thích miễn dịch, vắc-xin ngày càng được ứng dụng nhiều trong các mô hình canh tác sinh thái. Trong đó, sử dụng vắc-xin là một biện pháp phòng bệnh hiệu quả và an toàn để ngăn ngừa dịch bệnh gây ra bởi vi rút, vi khuẩn.
Hiện tại, hầu hết các loại vắc-xin thủy sản thương mại vẫn là loại vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn. Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh nghiêm trọng ở giai đoạn ấu trùng, cá bột, cá hương, cá giống với tỷ lệ chết lên tới 100%, vì vậy, vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh thường được dùng cho cá bằng đường ngâm.
2
Xuất phát từ cơ sở lý luận và nhu cầu thực tiễn trên, đề tài: “Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (Epinephelus spp.)” được tiến hành nhằm tạo được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoạt tử thần kinh ở cá mú. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung:
Nghiên cứu được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho
cá mú từ chủng vi rút phân lập tại miền Bắc, Việt Nam. Mục tiêu cụ thể:
Phân lập và lựa chọn được chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.
Sản xuất được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho
cá mú.
Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3.1. Ý nghĩa khoa học:
Luận án đã chế tạo được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú với các bước: phân lập, tuyển chọn chủng giống làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin, đánh giá chủng giống gốc, nhân nuôi vi rút trên tế bào, bất hoạt vi rút, xác định các điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm và đánh giá chất lượng của vắc-xin bán thành phẩm. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu khoa học, cung cấp thêm tư liệu tham khảo cho các nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh cho các đối tượng cá biển có giá trị kinh tế cao. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn:
Luận án đã nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt keo phèn đạt chỉ
tiêu an toàn và hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu:
Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ một số loài
cá mú nuôi ở một số tỉnh khu vực miền Bắc. 4.2. Phạm vi nghiên cứu:
Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ cá biển nuôi tại các vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định).
3
5. Những đóng góp mới của luận án
Luận án đã nghiên cứu một cách toàn diện về các đặc điểm của chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú, bao gồm tính thuần khiết, tính sinh miễn dịch bảo hộ, tính ổn định về mặt di truyền và năng suất sau khi nhân nuôi trên tế bào GS01.
Luận án đã chế tạo được vắc-xin bất hoạt keo phèn bằng chủng vi rút TB05 phân lập tại tỉnh Thái Bình, vắc-xin bất hoạt keo phèn được sử dụng cho cá bằng phương pháp ngâm, tỷ lệ an toàn 100%, tỷ lệ bảo hộ đạt 75,8% sau 3 tháng. 6. Bố cục của luận án
Luận án gồm (1) Mở đầu 5 trang, (2) Tổng quan 27 trang, (3) Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 16 trang, (4) Kết quả nghiên cứu 53 trang, (5) Kết luận và kiến nghị 1 trang, 250 TLTK, 22 bảng, 18 hình.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú
Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers. Có tất cả 87 loài được liệt kê trong chi Epinephelus (E.), riêng khu vực Ấn Độ, Thái Bình Dương đã phát hiện được 63 loài thuộc giống Epinephelus, cá mú là loài cá sống dưới đáy tại những rạn san hô, đá cứng, vùng nước ấm, phân bố chủ yếu ở những vùng biển nhiệt đới, á nhiệt đới và ít thấy ở vùng biển ôn đới. Nhiệt độ thích hợp cho các loài cá mú phát triển là 25-300C, độ mặn từ 11- 41‰. Hầu hết tất cả các loài cá mú đều là loài lưỡng tính nguyên sinh. Tuyến sinh dục ban đầu chưa được biệt hóa sau đó chúng được biệt hóa thành buồng trứng ở tất cả các cá thể. Sau khi trưởng thành thành con cái, chúng trải qua quá trình thay đổi giới tính thành con đực, biến đổi buồng trứng thành tinh hoàn. Sự thay đổi giới tính tự nhiên ở các loài cá mú xảy ra từ 3 đến 11 tháng tuổi tùy theo loài. Cá mú có xu hướng đẻ trứng vào đầu mùa xuân và mùa hè. Mặc dù một số loài như cá mú sinh sản quanh năm, còn lại hầu hết các loài cá mú sinh sản trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 5. 1.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam
Bệnh hoại tử thần kinh đã được báo cáo chính thức trên toàn thế giới, ngoại trừ Nam Mỹ. VNN xuất hiện ở các quốc gia khu vực châu Á như Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam; Châu Đại Dương như Úc, Tahiti; vùng Địa Trung Hải như Pháp, Hy Lạp, Ý, Malta, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Tunisia hoặc
4
các quốc gia khác như, Vương quốc Anh, Na Uy, Quần đảo Caribe và Bắc Mỹ.
Ở châu Á, tỷ lệ tử vong hàng loạt được ghi nhận ở giai đoạn ương giống cá mú ở Singapore, cá mú chấm đỏ (E. akaara) và cá háo sọc (Pseudocaranx dentex) ở Nhật Bản, cá đối đầu dẹt (Mugil cephalus) ở Trung Quốc, cũng như cá hồng mỹ (Sciaenops ocellatus) ở Israel. Ở Bắc Mỹ, bệnh VNN được phát hiện trên cá chẽm trắng (Atractoscion nobilisthe) và cá tuyết Đại Tây Dương. Ngoài ra, bệnh bệnh hoại tử thần kinh không chỉ lây nhiễm trên cá biển mà còn ở nhiều loại động vật thủy sinh nước ngọt.
Ở Việt Nam đã phát hiện một số loài cá mú nhiễm bệnh hoại tử thần kinh, bao gồm các loài: E. coioides, E. fuscogutatus, E. tauvina, E. lanceolatus, E. malabaricus ở Khánh Hòa, E. coioides ở Cát Bà (Hải Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An). Bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2002 ở các lồng nuôi tại Vân Đồn, Quảng Ninh. 1.3. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá được xác định là Betanodavirus, Vi rút không có vỏ bọc, hình cầu, đường kính từ 25-30 nm, có đối xứng hình tứ diện, vỏ protein bao gồm 180 protein với khối lượng 42 kDa. Hệ gen của Betanodavirus có cấu trúc ARN mạch đơn, sợi dương gồm 2 tiểu phần: Tiểu phần lớn của hệ gen chứa ARN1 (3.1 kb) và Tiểu phần nhỏ của hệ gen chứa ARN2 (1.4 kb), trên ARN2 chứa một khung đọc mở (ORF) cho một protein vỏ đồng thời chứa hai vùng bảo thủ cao là T2 (870 bp) và T4 (420 bp). Giống Betanodavirus được phân thành 4 kiểu gen chính, bao gồm: vi rút hoại tử thần kinh ở cá bơn sọc (SJNNV), vi rút hoại tử thần kinh ở cá nóc hổ (TPNNV), vi rút hoại tử thần kinh ở cá mú đốm đỏ (RGNNV) và vi rút hoại tử thần kinh ở cá bơn (BFNNV)
Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng phương thức lây truyền theo chiều ngang và chiều dọc và tạo ra sự lây nhiễm chính thức bằng cách xâm nhập vào các tế bào nhạy cảm của hệ thống thần kinh trung ương bao gồm não, tủy sống và võng mạc dẫn đến các biểu hiện lâm sàng của cá khi mắc bệnh như: bơi không định hướng, thân thẫm màu, mắt lồi, cong thân. 1.4. Tổng quan về vắc-xin thủy sản
Vắc-xin trong nuôi trồng thủy sản được xem là một biện pháp phòng
5
ngừa hiệu quả đối với nhiều bệnh và gần đây đã trở nên phổ biến. Theo tác nhân gây bệnh, vắc-xin thủy sản có thể được phân loại thành vắc-xin vi khuẩn, vắc-xin vi rút và vắc-xin ký sinh trùng, chúng cũng có thể được phân loại theo thành phần bao gồm vắc-xin đơn giá, vắc-xin đa giá hoặc vắc-xin hỗn hợp, hoặc phân loại theo bản chất chẳng hạn như vắc-xin sống giảm độc lực, vắc-xin bất hoạt hoặc vắc-xin tiểu đơn vị, vắc-xin axit nucleic, vắc-xin tái tổ hợp. Cần lưu ý rằng mỗi loại vắc-xin đều có những ưu điểm và nhược điểm, các loại vắc-xin khác nhau cần được phát triển và sử dụng cho các tác nhân gây bệnh và động vật khác nhau.
Phương pháp sử dụng vắc-xin trong thủy sản thường được dùng bằng đường tiêm, vắc-xin ngâm và vắc-xin cho ăn. Mỗi loại cũng có ưu và nhược điểm và phù hợp với từng đối tượng các khác nhau.
Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Cá bệnh
Mẫu cá mú được thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh
đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân
Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng
biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định).
2.1.2. Cá thí nghiệm
Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 2-2,5 cm, cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) dài 2-2,5 cm và mú chuột (Cromileptes altivelis) dài 5,5-6 cm được cung cấp bởi Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Bắc, Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phòng. 2.1.3. Tế bào
Tế bào GS01 (tế bào lách cá mú) do trường Đại học Wageningen, Hà
Lan cung cấp. 2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Phân lập và lựa chọn được chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.
2.2.2. Sản xuất được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho
cá mú.
6
2.2.3. Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin.
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.3.1. Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội và phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
2.3.2. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2016 đến tháng 04/2020.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu 2.4.2. Kỹ thuật phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01 2.4.3. Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số 2.4.4. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 2.4.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 2.4.6. Phương pháp điện di trên gel agarose 2.4.7. Phương pháp giải trình tự ADN 2.4.8. Phương pháp xác định TCID50, LD50 của NNV 2.4.9. Xác định điều kiện nhân giống vi rút 2.4.10. Phương pháp bất hoạt vi rút 2.4.11. Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn 2.4.12.Phương pháp trung hòa trên tế bào 2.4.13. Phương pháp gây miễn dịch 2.4.14. Phản ứng ELISA gián tiếp 2.4.15. Phương pháp thử thách cường độc 2.4.16. Đánh giá độ an toàn vắc-xin 2.4.17. Đánh giá hiệu quả vắc-xin ở điều kiện thực nghiệm 2.4.18. Phương pháp xử lý số liệu
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập, lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 3.1.1. Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh ở 4 tỉnh miền Bắc, Việt Nam.
Trong tổng số 60 mẫu cá mú có các triệu chứng của bệnh hoại tử thần kinh được thu thập từ các vùng biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định).
7
Hình 3.1. Mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh A: cá mú khỏe mạnh; B và C: mẫu cá mú nghi mắc VNN
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc gen T4 trong các mẫu cá nghi nhiễm NNV
Địa điểm Số lượng mẫu Tỷ lệ dương tính (%)
Số mẫu dương tính gen T4 8 6 8 10 32 50,00 40,00 57,14 66,67 53,33 QN HP NĐ TB Tổng số 16 15 14 15 60
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của một số mẫu
nghi nhiễm NNV
8
Giếng 1-5: các mẫu nghi nhiễm NNV; M: thang ADN
chuẩn 1kb 420 bp
Kết quả sàng lọc bằng sinh học phân tử từ 60 mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh thì có 32 mẫu phát hiện thấy đoạn gen có kích thước 420 bp, tương ứng với kích thước của đoạn gen T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh. Các mẫu dương tính với gen T4 được sử dụng để phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01.
Vi rút nhân lên trong tế bào và được đánh giá bằng hiệu ứng huỷ hoại
tế bào (cytopathic effects - CPE).
Hình 3.3 Hình ảnh tế bào GS01 A: Tế bào GS01 chưa gây nhiễm mẫu NNV B: Tế bào GS01 sau 120 giờ gây nhiễm NNV Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên tế bào GS01
STT Ký hiệu mẫu
1 QN02 2 QN04 3 QN05 4 QN07 5 QN08 6 QN10 7 QN12 8 QN14 9 HP02 10 HP03 11 HP05 Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ) 192 168 144 120 ++++ ++ ++ + +++ ++++ ++++ ++ +++ ++++ ++++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ + ++++ ++ +++ ++++ ++++ ++ ++ + ++++ ++ +++ ++++ ++++ ++ +++ ++++ ++++ ++ ++ + +++ ++ +++ ++++ ++++ ++ 72 + + + + + + + + + + + 96 + + + + + + + + + + + 24 48 _ _ + _ + _ + _ _ _ + _ _ _ + _ + _ _ _ + _
9
++ ++++ ++
12 HP06 13 HP07 14 HP09 15 HP12 16 HP15 17 NĐ01 18 NĐ03 19 NĐ04 20 NĐ05 21 NĐ07 22 NĐ08 23 NĐ10 24 NĐ12 25 TB02 26 TB03 27 TB05 28 TB07 29 TB08 30 TB10 31 TB11 32 TB13 + + ++ ++ + ++ + + + ++ ++ ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + _ _ + + _ + _ _ _ + + + _ + _ + + + + + _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
+++ ++ ++ + ++ +++ ++ + +++ ++++ ++++ + +++ ++++ ++++ + +++ ++ ++ + +++ ++++ ++++ + ++ ++ + ++ ++ + ++ ++ + +++ ++++ ++ + ++ +++ ++++ + +++ ++++ ++++ + +++ +++ ++ + ++ +++ ++++ + ++ ++++ ++++ + +++ ++++ ++++ + +++ ++++ ++++ + +++ ++++ ++++ + +++ ++++ ++ + +++ ++ ++ + +++ ++++ ++ + Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++: CPE > 50%; +:
CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: không có CPE
Kết quả phân lập vi rút trên tế bào GS01 cho thấy, trong các đĩa nuôi cấy tế bào GS01, các mẫu bệnh phẩm bắt đầu gây ra hiệu ứng hủy hoại tế bào sau 72 giờ gây nhiễm, biểu hiện bệnh tích tế bào tăng trong các ngày tiếp theo và cao nhất từ 168 đến 192 giờ sau gây nhiễm. 3.1.2. Xác định độc lực vi rút (TCID50 và LD50)
STT
TCID 50/mL
Độc lực của vi rút được xác định bằng liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy (Tissue culture infective dose - TCID50) và/hoặc liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal dose- LD50).
Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) (%) theo các độ pha loãng vi rút 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
Bảng 3.3. Kết quả xác định TCID50 trên tế bào GS01 Ký hiệu mẫu
10
QN02 1 QN04 2 QN05 3 QN07 4 QN08 5 QN10 6 QN12 7 QN14 8 9 HP02 10 HP03 11 HP05 12 HP06 13 HP07 14 HP09 15 HP12 16 HP15 17 NĐ01 18 NĐ03 19 NĐ04 20 NĐ05 21 NĐ07 22 NĐ08 23 NĐ10 24 NĐ12 TB02 25 TB03 26 TB05 27 TB07 28 TB08 29 TB10 30 TB11 31 TB13 32
100 100 98 55 60 65 60 70 70 85 80 80 100 100 95 70 80 85 80 80 85 85 90 90 100 100 95 90 95 95 60 70 70 90 85 90 100 100 95 50 60 60 85 90 90 80 95 95 60 70 70 80 80 85 50 60 60 55 60 65 55 50 55 100 100 95 100 100 95 80 80 85 85 90 90 95 90 95 100 100 95 60 70 70 50 55 55 85 90 90 70 80 85 90 95 95
85 40 50 70 80 52 70 60 80 70 50 70 80 40 70 75 50 70 40 40 30 80 80 70 60 70 80 50 30 70 52 70
70 5 20 20 60 20 20 25 60 52 20 25 60 5 25 52 20 20 5 5 5 60 60 20 25 52 60 20 5 25 20 52
50 + 5 10 48 10 10 15 48 35 5 15 48 + 15 35 5 10 + + + 48 48 10 15 35 48 5 + 15 10 35
25 - + 5 25 5 5 5 25 20 + 5 25 - 5 20 + 5 - - - 25 25 5 5 20 25 + - 5 5 20
10 - - - 10 - - - 10 5 - - 10 - - 5 - - - - - 10 10 - - 5 10 - - - - 5
10-6,9 10-3 10-3,9 10-4,9 10-6,8 10-4,3 10-4,9 10-4,8 10-6,8 10-5,9 10-3,9 10-4,9 10-6,8 10-3 10-4,9 10-5,9 10-3,9 10-4,9 10-3 10-3 10-2,7 10-6,8 10-6,8 10-4,9 10-4,8 10-5,9 10-6,8 10-3,9 10-2,7 10-4,9 10-4,3 10-5,9
80 15 35 50 70 45 48 50 70 60 35 50 70 20 50 60 35 50 15 15 15 70 70 50 50 60 70 35 15 50 45 60
11
Bảng 3.4. Kết quả xác định LD50 trên cá mú giống
Tỷ lệ chết tích luỹ sau 120 giờ ở các độ pha loãng vi rút (%)
STT
LD50/ mL
Ký hiệu mẫu
10-1
10-2 10-3
10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
10-9
60
80
15 15 46,7 40
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 QN02 100 2 QN08 100 100 3 HP02 4 HP07 100 5 NĐ08 100 6 NĐ10 100 100 7 TB05 66,7 53,3 30 8 TB08 0 0 0 9
ĐC
53,3 13,3 13,3 10-6,2 100 80 10-5,5 93,3 66,7 53,3 30 10-7,5 73,3 60 80 73,3 66,7 53,3 53,3 13,3 13,3 10-6,2 10-6,5 86,7 86,7 66,7 53,3 30 15 26,6 13,3 10-5,5 93,3 66,7 53,3 30 66,7 53,3 33,3 10-7,5 93,3 93,3 80 10-1,5 6,7 6,7 13,3 6,7 K 0 0 0
0 0
0 0
0
Ghi chú: K không đánh giá Kết quả xác định độc lực của vi rút trên tế bào nuôi cấy và trên cá xác định được 2 mẫu TB05 và HP02 có độc lực mạnh trên tế bào và cá với các liều TCID50 và LD50 tương ứng là 10-6,8TCID50/mL và 10-7,5LD50/mL, 2 mẫu có độc lực cao là TB05, HP02 được lựa chọn để xác định loài bằng phương pháp sinh học phân tử.
Kết quả xác định loài của hai mẫu TB05 và HP02 thông qua trình tự gen T4 với trình tự ARN2 của các chủng vi rút hoại tử thần kinh được công bố trên Genebank. Kết quả này cho phép kết luận các mẫu TB05 và HP02 là vi rút hoại tử thần kinh.
Bảng 3.5. So sánh mức độ tương đồng của trình tự đoạn gen T4
của mẫu HP02 và TB05 với các trình tự của GenBank
Phần trăm
Mức độ
Tên chủng và gen xác định
trình tự được
Mã số GenBank
tương
trình tự
so sánh với
đồng (%)
GenBank (%)
Mẫu TB05
KU705815.1
87
99,19
Mouse nervous grouper necrosis virus isolate VI37 segment ARN2, complete sequence
12
MG874758.1
87
98,64
AF283554.1
87
98,64
MF144241.1
87
98,37
KY930894.1
87
98,37
Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 complete segment ARN2, sequence Yellow nervous grouper necrosis virus major coat protein gene, partial cds Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 segment ARN2, complete sequence Betanodavirus sp. strain KS1 segment ARN2 capsid protein mARN, complete cds
Mẫu HP02
KU705815.1
92
98,47
MG874758.1
92
97,95
MF144241.1
90
98,18
KY930894.1
90
98,18
Mouse nervous grouper necrosis virus isolate VI37 complete segment ARN2, sequence Epinephelus coioides nervous isolate HN1 necrosis virus segment ARN2, complete sequence Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 segment ARN2, complete sequence Betanodavirus sp. strain KS1 segment ARN2 capsid protein mARN, complete cds
3.1.3. Kết quả lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú.
Hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin phụ thuộc vào chất lượng của chủng giống gốc với các đặc tính: đại diện kháng nguyên, hiệu quả kích
13
thích kháng thể bảo hộ, mức độ thuần khiết, hiệu xuất nhân giống trên tế bào mẫn cảm, ổn định về khả năng kích thích sinh kháng thể bảo hộ và di truyền.
Bảng 3.6. Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên của
Hiệu giá kháng thể trung hòa Hiệu giá kháng thể trung hòa
các mẫu phân lập Ký hiệu mẫu vi rút
HP02 256 128 128 256 128 256 128 128 256 128 128 32 256 64 64 64 TB05 512 256 256 128 128 512 128 128 512 512 128 128 128 128 128 256 NĐ01 NĐ02 NĐ03 NĐ04 NĐ05 NĐ08 NĐ10 NĐ12 TB02 TB03 TB05 TB07 TB08 TB10 TB11 TB13 HP02 64 64 4 128 64 256 64 4 4 4 256 4 4 64 4 64 TB05 128 128 128 256 256 512 128 128 128 128 512 128 512 128 128 128 Ký hiệu mẫu vi rút QN02 QN04 QN05 QN07 QN08 QN10 QN12 QN14 HP02 HP03 HP05 HP06 HP07 HP09 HP12 HP15
Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra độ thuần khiết của giống gốc
Môi trường đánh giá
Kết luận
Chủng giống gốc
Thạch máu (đĩa)
Thạch nấm (đĩa)
Nước thịt (ống)
Lần kiểm tra
Thời gian theo dõi (ngày)
NNV TB05
- - - -
- - - -
- - - -
PPLO (pleuropneu monia-like organism) - - - -
Đạt Đạt Đạt -
1 2 3 1
7 7 7 7
Đối chứng
Ghi chú: - âm tính
14
Chủng giống gốc
Số lần kiểm tra
Dải pha loãng vi rút
Hiệu giá vi rút (TCID50/mL)
10-6,8
NNV TB05
Đối chứng
1 2 3
10-6,7 10-6,9 10-6,8 Âm tính
Âm tính
10-1 – 10-8 10-1 – 10-8 10-1 – 10-8 10-1 – 10-8 đệm PBS
Bảng 3.8. Kết quả xác định hiệu giá vi rút của chủng giống gốc Hiệu giá vi rút trung bình (TCID50/mL)
Liều gây nhiễm (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1 đệm PBS
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ ổn định của chủng NNV TB05
Chủng giống Lần cấy
Hiệu giá vi rút giống gốc (TCID50/mL) 10-6,8
NNV TB05
chuyển 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 Hiệu giá vi rút (TCID50/mL) 10-6,8 10-6,7 10-6,8 10-6,9 10-6,8 10-6,8 10-6,9 106,8 10-6,7 10-6,8 Âm tính Đối chứng Âm tính
10 20 30 40 50 60 70
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1% M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1-10: Sản phẩm PCR khuếch đại mẫu vi rút trong 10 đời cấy chuyển; 11: đối chứng âm; 12: sản phẩm PCR khuếch đại mẫu vi rút TB05
15
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f2 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f3 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f4 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f5 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f6 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f7 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f8 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f9 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f10AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f2 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f3 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f4 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f5 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f6 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f7 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f8 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f9 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f10CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f2 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f3 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f4 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f5 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f6 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f7 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f8 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f9 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f10GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f2 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f3 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f4 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f5 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f6 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f7 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f8 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f9 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f10CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA 290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f2 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f3 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f4 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f5 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f6 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f7 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f8 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f9 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG
16
f10ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG 360 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f2 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f3 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f4 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f5 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f6 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f7 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f8 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f9 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f10CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG Hình 3.5. So sánh trình tự gen T4 của 10 đời vi rút
Từ các kết quả thu được, nghiên cứu này đã phân lập và tuyển chọn được chủng giống gốc TB05 từ các chủng NNV phân lập từ mẫu bệnh phẩm mắc bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú nuôi tại khu vực miền Bắc, Việt Nam. 3.2. Kết quả chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú quy mô phòng thí nhiệm. 3.2.1. Xác định liều gây nhiễm (multiplicity of infection - MOI) vào tế bào mẫn cảm và thời gian phù hợp để thu hoạch vi rút.
Chủng NNV TB05 có TCID50= 10-6,8/mL được gây nhiễm vào tế bào GS01, với 3 liều gây nhiễm (MOI) là 0,1; 0,01 và 0,001, nhiệt độ nuôi cấy là 250C.
Hình 3.6. Kết quả xác định liều gây nhiễm (MOI), ý nghĩa thống kê được thực hiện bằng cách so sánh giá trị mỗi giá trị MOI với giá trị của MOI 0.1. Giá trị trung bình của ba xét nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,001).
17
Hình 3.7. Tình trạng tế bào nuôi cấy vi rút hoại tử thần kinh ở các thời điểm theo dõi khác nhau
A: tế bào chưa gây nhiễm; B: ngày thứ 3 sau gây nhiễm; C: ngày thứ 4 sau gây nhiễm; D: ngày thứ 5 sau gây nhiễm Từ kết quả thu được trong thí nghiệm cho phép kết luận, giá trị MOI là 0,01 là phù hợp để nhân giống vi rút, thời gian thu hoạch vi rút phù hợp là 5 ngày sau khi gây nhiễm. 3.2.2. Kết quả xác định điều kiện bất hoạt vi rút
Trong nghiên cứu này, chủng NNV TB05 được gây bất hoạt với 3 formaldehyde, binary ethylenimine, β-
loại hóa chất, bao gồm propiolactone.
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá mức độ bất hoạt của NNV Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ)
Hóa chất
12
24
36
48
60
Formaldehyde
+
+
+
-
-
Binary ethylenimine
+
+
-
-
-
β-propiolactone
+
-
-
-
-
Hình 3.8. Kết quả phát hiện kháng thể đặc hiệu với các mẫu vi rút bất hoạt (OD450)
18
Kết quả cho thấy hiệu vi rút bất hoạt bằng β-propiolactone cho hiệu giá kháng thể cao và thời gian dài hơn so với bất hoạt bằng binary ethylenimine và formaldehyde. Do vậy, β-propiolactone 0,1% được chọn làm hóa chất bất hoạt vi rút. 3.2.3. Xác định các điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm 3.2.3.1 Kết quả xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp và thời gian gây miễn dịch cho cá.
lượng kháng nguyên
Liều lượng kháng nguyên và thời gian gây miễn dịch cần được xác định để đạt hiệu quả phòng bệnh và tạo đáp ứng miễn dịch tối ưu nhất. Trong nghiên cứu này, cá mú chuột (kích thước 2-2,5cm) được tắm với các là 10-5TCID50/mL; 10-6TCID50/mL; 10- hàm 7TCID50/mL với liều 1mL/10 cá trong vòng 20 phút, 60 phút và 120 phút, đối chứng dùng PBS.
Hình 3.9. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch với các liều kháng nguyên NNV sau khi thử thách cường độc. Ý nghĩa thống kê được thực hiện bằng cách so sánh giá trị ở các liều lượng kháng nguyên khác nhau với đối chứng PBS. Giá trị trung bình của ba xét nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (*p ≤ 0,05; ***p < 0,001)
19
Hình 3.10. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch trong các mức thời gian. Ý nghĩa thống kê được thực hiện bằng cách so sánh giá trị ở các mốc thời gian lần lượt là 20 phút, 60 phút và 120 phút. Giá trị trung bình của ba xét nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (***p < 0,001)
Với kết quả thu được, liều lượng tối thiểu và thời gian ngâm cá được lựa chọn để đạt hiệu quả tối đa trong việc phòng bệnh và tạo đáp ứng miễn dịch cao nhất tương ứng là 10-6TCID50/mL và 60 phút. 3.2.3.2. Kết quả xác định chất bổ trợ vắc-xin Đối với vắc-xin bất hoạt chất bổ trợ là thành phần không thể thiếu để cải thiện hiệu quả và thời gian bảo vệ của vắc-xin. Hai chất bổ trợ gốc nhôm bao gồm aluminum hydroxide (AH) và aluminum phosphate (AP) được sử dụng để chế tạo vắc-xin.
Bảng 3.11. Xác định mức độ an toàn của vắc-xin
STT
Biểu hiện lâm sàng
Loại vắc- xin
Tỷ lệ chết (%)
Tỷ lệ sống (%)
1
3
97
NNV TB05 + AH
2
2
98
NNV TB05 + AP
3
2
98
Đối chứng (không âm dụng sử
Hai ngày đầu sau khi xử lý vắc-xin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp. Các ngày tiếp theo biểu hiện bình thường. Tăng trưởng của cá không thay đổi so với lô đối chứng âm Hai ngày đầu sau khi xử lý vắc-xin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp. Các ngày tiếp theo biểu hiện bình thường. Tăng trưởng của cá không thay đổi so với lô đối chứng âm Các hoạt động sinh lý và biểu hiện lâm sàng bình thường
20
STT
Biểu hiện lâm sàng
Tỷ lệ chết (%)
Tỷ lệ sống (%)
Loại vắc- xin vắc-xin hoặc chất bổ trợ)
Hình 3.11. Mô não và võng mạc cá nhuộm hematoxylin và eosin A: Mô não cá sử dụng vắc-xin 21 ngày, B: Mô não cá gây nhiễm với chủng NNV TB05, C: Mô võng mạc xá sử dụng văc-xin 21 ngày, D: Mô võng mạc cá gây nhiễm với chủng NNV TB05
Hình 3.12. So sánh mức độ bảo hộ cá với vắc-xin bất hoạt có chất bổ trợ khác nhau giữa các nhóm thử nghiệm. Ý nghĩa thống kê được thực hiện bằng cách so sánh giá trị ở các liều thử thách cường độc TCID50 khác nhau với liều thử thách cường độc 4xTCID50. Giá trị trung bình của ba xét
21
nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,01 và *** p ≤ 0,001)
Kết quả thể hiện cho thấy: cá được gây miễn dịch với dịch vi rút TB05 bất hoạt có bổ sung nhôm hydroxit và nhôm phosphate an toàn với cá mú thí nghiệm, bệnh tích tế bào ở lô sử dụng vắc-xin có chất bổ trợ không thấy xuất hiện bệnh tích, trong khi lô đối chứng xuất hiện không bào trông mô não và võng mạc, tất cả các lô thí nghiệm đều có tỷ lệ bảo hộ trên 75%. Từ kết quả thu được nhôm hydroxit được lựa chọn làm chất bổ trợ vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. 3.2.3.3. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin bán thành phẩm
Trong nghiên cứu này, để đánh giá hiệu quả của vắc-xin trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, chúng tôi theo dõi các chỉ tiêu; số lượng hồng cầu tổng số, bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân, tiểu cầu. Cùng với nghiên cứu làm rõ khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá sử dụng vắc-xin, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu được đánh giá thông qua khả năng hình thành kháng thể bảo hộ
Bảng 3.12. Kết quả theo dõi các tế bào có chức năng miễn dịch
Chỉ tiêu theo dõi Bố trí thí nghiệm ở cá thử nghiệm vắc-xin Tháng thứ 2 Tháng thứ 3 Tháng thứ 4 Tháng thứ 5 Tháng thứ 6
2.639,00 2.598,40 2.208,64 2.186,55 2.142,82 lượng cầu tế
số cầu tế 118,16 116,98 95,92 92,08 91,16 Lô thử nghiệm vắc-xin
tế 82,48 78,36 75,22 74,47 72,24
Số hồng (x103 bào/mL máu) Tổng bạch (x103 bào/mL máu) Lympho (x103 bào/mL máu)
22
2,82 2,54 2,36 2,29 2,27 cầu tính tế
3,35 3,22 2,96 2,84 2,78 cầu nhân tế
cầu tế 21,19 19,07 17,16 16,65 16,31
lượng
2.030,00 2.036,09 2.038,13 2.038,11 2.036,07
số
90,89 90,80 90,62 90,67 90,80
Lô đối chứng
tế 71,72 71,58 71,65 71,65 71,60
2,31 2,32 2,32 2,32 2,32 cầu tính tế
Bạch trung (x103 bào/mL máu) Bạch đơn (x103 bào/mL máu) Tiểu (x103 bào/mL máu) Số hồng cầu/mL máu (x103 tế bào/mL máu) Tổng bạch cầu/mL máu (x103 tế bào/mL máu) Lympho (x103 bào/mL máu) Bạch trung (x103 bào/mL máu)
23
2,68 2,69 2,68 2,68 2,69 cầu nhân tế
cầu tế 16,05 16,19 16,21 16,22 16,19
Bạch đơn (x103 bào/mL máu) Tiểu (x103 bào/mL máu)
24
Hình 3.13. Tỷ lệ sống của cá ở các lô thử nghiệm vắc-xin. Tỷ lệ sống sót được so sánh giữa các nhóm sử dụng thử nghiệm. Dấu hoa thị biểu hiện sự khác biệt thống kê giữa các nhóm trong cùng một thời điểm theo thử nghiệm. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,01 và *** p ≤ 0,001)
Kết quả thí nghiệm chứng tỏ rằng, vắc-xin đã kích thích tạo kháng thể bảo hộ ở cá thí nghiệm, tuy nhiên, lượng kháng thể giảm dần qua thời gian theo dõi. Kết quả này cho thấy, để vắc-xin có hiệu quả theo quy định, cần thực hiện tiêm nhắc lại sau tháng thứ 3.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Lựa chọn được chủng vi rút TB05 làm chủng giống gốc và đạt được tiêu chí sản xuất vắc-xin như: độc lực cao trên tế bào (106,8 TCID50/mL) và trên cá (107,5 LD50/mL), chủng giống gốc độ thuần khiết 100%, an toàn 100% và ổn định nhân nuôi trên tế bào cũng như ổn định về mặt di truyền sau 10 đời cấy chuyển.
Đã nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú với đầy đủ thông số tối ưu như: +) Lựa chọn được điều kiện nuôi cấy tế bào (môi trường L-15 + 10% FBS, pH 7,0-7,4); +) Điều kiện gây nhiễm vi rút vào tế bào GS01 với liều gây nhiễm MOI 0,01 cho hiệu giá vi rút cao nhất tại thời điểm 5 ngày sau nhân nuôi; +) Hóa chất β- propiolactone nồng độ 0,1% được lựa chọn để bất hoạt vi rút; +) Vắc-xin bán thành phẩm được phối trộn với nhôm hydroxit với liều kháng nguyên tối thiểu là 106TCID50/mL.
Vắc-xin đạt tiêu chuẩn về: Tính ổn định, vô trùng, an toàn 100% và tỷ
lệ bảo hộ đạt 75,8% cho cá sau 3 tháng.
2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản vắc-xin và đánh giá tính an toàn, hiệu lực bảo hộ của vắc-xin ở ngoài thực địa sau các thời gian bảo quản, tiến đến có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp nhằm đưa vắc-xin vào phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú tại Việt Nam.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ
CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm, Đồng Văn Quyền, Nguyễn
Thị Thu Hiền, Nguyễn Mạnh Hùng (2018), “Phân lập và xác định đặc tính
của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh NNV (Nervous necrosis virus) ở cá
mú (Epinephelus sp.) tại miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn, số 15, tr.87-93.
2. Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm, Đồng Văn Quyền, Vũ Thị
Bích Huyền, Lê Minh Hải (2022), “Nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt phòng
bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú (Epinephelus sp.) quy mô phòng thí
nghiệm”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 6, kỳ 2, tr. 66-71.
