zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Y Tế - Sức Khoẻ

» Y khoa - Dược

Xây dựng phương pháp định lượng patulin trong táo và các sản phẩm từ táo bằng LC-MS/MS

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Báo xấu

1
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này nhấn mạnh những rủi ro về sức khỏe do nhiễm patulin, đồng thời khuyến nghị cần theo dõi thường xuyên và áp dụng các biện pháp kiểm soát chất lượng chặt chẽ hơn để đảm bảo an toàn thực phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng phương pháp định lượng patulin trong táo và các sản phẩm từ táo bằng LC-MS/MS

Journal of Pharmaceutical Research and Drug Information 2025; 00(00); 000–000 Journal homepage: jprdi.vn/JP Journal of Pharmaceutical Research and Drug Information An official journal of Hanoi University of Pharmacy Research article DEVELOPING A METHOD FOR QUANTITATIVE PATULIN IN APPLES AND APPLE PRODUCTS USING LC-MS/MS Nguyen Thị Thuy Linh1, Nguyen Thu Huong1, Phung Cong Ly2, Nguyen Thị Hong Ngoc2, Tran Nguyen Ha1* 1 Faculty of Analytical Chemistry and Drug Quality Control, Hanoi University of Pharmacy, 13-15 Le Thanh Tong, Hoan Kiem, Hanoi, Vietnam. 2 National institute for food control, 65 Pham Than Duat, Mai Dich, Cau Giay, Hanoi, Vietnam. * Corresponding author: hatn@hup.edu.vn Article history: Received 08 October 2024 Resived 17 January 2025 Accepted 18 January 2025 ABSTRACT A LC-MS/MS method was developed for quantifying patulin in apples and apple-based products. The method used a Symmetry C18 chromatographic column (150 mm × 3.0 mm, 3.5 µm) and a gradient mobile phase with solvents (A) 10 mM CH3COONH4 in H2O and (B) 10 mM CH3COONH4 in MeOH, at a flow rate of 0.4 mL/min and an injection volume of 20 µL. The ion source was operated in negative electrospray ionization (ESI) mode, with Multiple Reaction Monitoring (MRM). The method was validated according to the guidelines of the Association of Official Analytical Chemists (AOAC), demonstrating good specificity, a linear concentration ranges from 6 to 400 µg/kg, a limit of detection of 2.0 µg/kg, and a limit of quantification of 6.0 µg/kg; both repeatability and accuracy met the requirements of AOAC. This method was applied to analyze the Patulin content in 27 apple and apple-based product samples from Hanoi and e-commerce platforms, revealing 4 positive samples. One sample, intended for intended for children under 36 months, exceeded the European Commission’s safety limit for patulin content (15.1 µg/kg compared to the maximum allowable 10 µg/kg). The study highlights the health risks of patulin contamination, recommending routine monitoring and stricter quality control measures to ensure food safety. Keywords: Patulin, LC-MS/MS, apples, apple products. 1 http://doi.org/10.59882/1859-364X/244
Bài Nghiên cứu Xây dựng phương pháp định lượng patulin trong táo và các sản phẩm từ táo bằng LC-MS/MS Nguyễn Thị Thùy Linh1, Nguyễn Thu Hường1, Phùng Công Lý2, Nguyễn Thị Hồng Ngọc2, Trần Nguyên Hà1* 1 Khoa Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội, 13-15 Lê Thánh Tông, Hoàn Kiếm, Hà Nội, Việt Nam 2 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam * Tác giả liên hệ: hatn@hup.edu.vn Ngày nhận bài: 08/10/2024 Ngày nhận bản sửa: 17/01/2025 Ngày chấp nhận đăng: 18/01/2025 TÓM TẮT Phương pháp LC-MS/MS đã được xây dựng để định lượng patulin trong táo và các sản phẩm từ táo sử dụng cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm × 3,0 mm, 3,5 µm), chương trình gradient dung môi pha động (A) CH3COONH4 10 mM trong H2O và (B) CH3COONH4 10 mM trong MeOH, tốc độ dòng 0,4 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl. Chế độ nguồn ion hóa phun điện tử ion âm ESI(-) theo dõi ion đa phản ứng (MRM - Multiple reaction monitoring). Phương pháp đã được thẩm định theo hướng dẫn của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (AOAC) có tính đặc hiệu tốt, khoảng nồng độ tuyến tính từ 6-400 µg/kg, giới hạn phát hiện là 2,0 µg/kg, giới hạn định lượng là 6,0 µg/kg; độ lặp lại và độ đúng đáp ứng yêu cầu theo AOAC. Phương pháp đã được sử dụng để phân tích hàm lượng patulin trong 27 mẫu táo và sản phẩm từ táo trên địa bàn Hà Nội và các sàn thương mại điện tử. Kết quả cho thấy có 04 mẫu dương tính với patulin trong đó có 01 mẫu sản phẩm từ táo dành cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi có hàm lượng patulin 15,1 µg/kg vượt quá giới hạn tối đa cho phép theo Quy định số 2023/915 của Ủy ban châu Âu và Bộ Y tế Việt Nam (ngưỡng tối đa 10 µg/kg). Nghiên cứu này nhấn mạnh những rủi ro về sức khỏe do nhiễm patulin, đồng thời khuyến nghị cần theo dõi thường xuyên và áp dụng các biện pháp kiểm soát chất lượng chặt chẽ hơn để đảm bảo an toàn thực phẩm. Từ khoá: Patulin, LC-MS/MS, táo, sản phẩm từ táo. Đặt vấn đề Patulin là một loại độc tố nấm mốc được tạo ra bởi một số loại nấm (Penicillium, Aspergillus, Byssochlamys). Nấm mốc Penicillium expansum xâm nhập vào những quả táo bị thương, gây ra nấm mốc xanh phân hủy và sau đó sản sinh ra patulin-một loại độc tố nấm mốc ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người. Patulin có thể xuất hiện trong nhiều loại trái cây, ngũ cốc và các thực phẩm khác bị mốc, tuy nhiên nguồn cung cấp patulin chính là táo và các sản phẩm từ táo như nước táo, giấm táo, mật táo… [1]. Việc sử dụng các thực phẩm có chứa patulin có thể dẫn đến một số biến chứng về sức 2 http://doi.org/10.59882/1859-364X/244
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 khỏe như ức chế miễn dịch, gây ung thư, viêm, loét và chảy máu đường tiêu hóa, gây đột biến và nhiễm độc phôi và gây quái thai [2]. Để đảm bảo an toàn sức khỏe con người, việc giám sát dư lượng patulin trong các sản phẩm từ táo là một nhiệm vụ hết sức quan trọng. Liên minh Châu Âu (EU) số 2023/915 và Bộ Y tế Việt Nam đưa ra quy định về mức giới hạn tối đa của patulin là 50 µg/kg trong nước táo và rượu táo, 25 µg/kg trong các sản phẩm táo dạng rắn và 10 µg/kg trong các sản phẩm dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (trẻ dưới 36 tháng tuổi) [3,4]. Trên thế giới đã có nhiều phương pháp xác định hàm lượng patulin trong táo và sản phẩm từ táo như sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [5], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-UV) [6] và sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) [7,8]. Ở Việt Nam đã có nghiên cứu sử dụng kỹ thuật HPLC để định lượng patulin trong nền mẫu đơn giản là nước trái cây [9] mà chưa có phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Tuy nhiên giới hạn tối đa cho phép của patulin nhỏ (µg/kg) và trên thị trường có nhiều dạng sản phẩm chứa táo, cả dạng rắn và dạng lỏng như: quả táo, thức ăn trẻ em làm từ táo, giấm táo, rượu táo...nên cần phải có một phương pháp phân tích có độ nhạy cao và độ chọn lọc tốt. Vì vậy việc xây dựng phương pháp xác định hàm lượng patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng LC-MS/MS là rất cần thiết. Kết quả nghiên cứu được sử dụng để xác định hàm lượng patulin trong táo và sản phẩm từ táo trên thị trường Việt Nam. Nguyên liệu và Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là patulin Các mẫu táo và sản phẩm từ táo được mua ngẫu nhiên tại các chợ, siêu thị trên địa bàn Hà Nội và các sàn thương mại điện tử. Hóa chất và chất chuẩn - Chất chuẩn đối chiếu: Patulin (Pribolab, 99,3%, lot.2C0C16). - Dung môi, hóa chất tinh khiết dùng cho LC-MS: acetonitril, methanol, amoni acetat (Merck, Đức), ethyl acetat, acid acetic, natri carbonat, natri sulfat (Merck, Đức); nước cất 2 lần. - Mẫu trắng: là mẫu táo và nước táo được tìm thấy không có chất phân tích. Thiết bị và dụng cụ Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực AB Sciex Triple Quad 5500. Một số thiết bị phụ trợ khác bao gồm cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg) XS105 (Metter Toledo); máy ly tâm lạnhMikro 200R (Hettich); máy lắc xoáy HS260 (IKA); máy siêu âm Elma S 180H; hệ thống thổi khô N2 và các thiết bị, dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện khối phổ Trên cơ sở tham khảo tài liệu [7,8], lựa chọn ion hóa nguồn bằng kỹ thuật ESI, xác định và chọn ion mẹ và ion con phù hợp. Sử dụng chế độ ion âm tạo ion mẹ (M-H)- và chế độ theo dõi đa phản ứng (MRM) để xác định tín hiệu. Tối ưu hóa các điều kiện MS/MS. − Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: Tiến hành khảo sát lựa chọn cột sắc ký và thành phần, chương trình pha động để tách patulin ra khỏi nền mẫu phân tích. − Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: Tham khảo tài liệu [6,7] quy trình xử lý mẫu được dự kiến như sau: Cân chính xác 10,0 g mẫu táo đã được xay nhuyễn hoặc nước táo đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml. Thêm 10 ml acid acetic 2%, mẫu được lắc xoáy trong 2 phút. Tiếp theo, thêm 20 ml ethyl acetat và lắc xoáy trong 5 phút, siêu âm ở nhiệt độ thường trong 15 phút. Sau đó, ly tâm 5 phút ở 6000 vòng/phút, lớp dịch chiết phía trên được chuyển vào ống ly tâm 50 ml. Chiết lần 2 với 20 ml ethyl acetat. Gộp dịch chiết 2 lần, 3
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 thêm 5 ml Na2CO3 1,5% và lắc kỹ. Mẫu được ly tâm trong 3 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút. Lọc dịch phía trên qua giấy lọc chứa Na2SO4 khan để loại nước. Chuyển dịch lọc sang một ống ly tâm 50 ml khác và làm bay hơi đến khô bằng bộ thổi khô nitơ, hoà cắn trong 1 ml CH3COOH 0,1% (pH=4). Lọc dịch qua màng 0,22 µm và phân tích trên LC-MS/MS. Sử dụng mẫu táo/nước táo đã được xác định là có chứa hàm lượng patulin để thực hiện các khảo sát, cụ thể như sau: + Khảo sát dung môi chiết: Ethyl acetat; ethyl acetat: n-hexan (95:5, v/v). + Khảo sát thể tích dung môi chiết: Chiết 2 lần × 20ml/lần; chiết 1 lần × 50 ml/lần. + Khảo sát điều kiện làm bay hơi dung môi: Cô quay chân không; thổi khô nitơ. + Khảo sát dung môi hòa tan cắn: CH3COOH 0,1% (pH=4), CH3COOH 0,1% (pH=4): MeOH (1:1, v/v) và MeOH. Thẩm định phương pháp: Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của AOAC International 2016 [10]. Các thông số được thẩm định để đánh giá phương pháp bao gồm: Tính đặc hiệu/chọn lọc, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ lặp lại và độ thu hồi, độ phù hợp hệ thống. Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu thống kế được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Nồng độ patulin được tính toán bằng phần mềm Analyst 1.7 trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ. Kết quả nghiên cứu và bàn luận Kết quả nghiên cứu Tối ưu hóa phương pháp phân tích Patulin bằng LC-MS/MS Lựa chọn điều kiện khối phổ Lựa chọn kỹ thuật ion hóa ESI(-) để xác định ion mẹ và các ion con của patulin. Thế đầu vào, năng lượng bắn phá (CE) được tối ưu tự động theo thiết bị. Các kết quả được trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Các điều kiện khối phổ cho mảnh con định lượng và định tính Chất phântích Mảnh Mảnh con định lượng Mảnh con định tính mẹ m/z CE (v) m/z CE (V) Patulin 153 81 - 23 109(50,7%*) - 21 * Tỷ lệ ion định tính so với ion định lượng Dựa vào kết quả khảo sát, mỗi chất phân tích lựa chọn một ion định lượng và một ion định tính, số điểm IP=5 (số điểm IP được tính theo tiêu chuẩn của EC 2021/808) [11] đạt để phân tích trên khối phổ. Như vậy, điều kiện MS/MS đã đạt được độ đặc hiệu cần thiết để có thể sử dụng khảo sát quy trình xử lý mẫu và phân tích patulin. Sau khi xác định được các ion mẹ và các ion con, tiến hành tối ưu các điều kiện của nguồn ion hóa với sự có mặt của hệ dung môi sắc ký. Lựa chọn chế độ tự động để tối ưu các thông số như sau: thế ion hóa (ISV) -4500 V, nhiệt độ nguồn ion (TEM) 450oC, áp suất khí nguồn 1 (GS1) 50 psi, áp suất khí nguồn 2 (GS2) 50 psi, áp suất khí màng (CUR) 20 psi, áp suất khí (CAD) 8 psi. Lựa chọn điều kiện về sắc ký 4
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 Khảo sát dung môi pha động Sau khi lựa chọn được ion mẹ, ion con và các điều kiện tối ưu của khối phổ, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn patulin có nồng độ 1 µg/ml trong MeOH. Một số điều kiện sắc ký được cố định như sau: sử dụng cột Symmetry C18 (150 mm×3,0 mm, 3,5 µm), tốc độ dòng 0,4 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, với chương trình gradient dung môi pha động như Bảng 2. Bảng 2. Chương trình gradient pha động Thời gian (phút) 0-1,5 1,5-4 4-7 7-8 Kênh A (%) 95 95→0 0 0→95 Kênh B (%) 5 5→100 100 100→5 Các hệ dung môi pha động được khảo sát: (1) Kênh A: HCOOH 0,1% trong H2O; Kênh B: MeOH. (2) Kênh A: HCOOH 0,1% và HCOONH4 5 mM trong H2O; Kênh B: MeOH. (3) Kênh A: HCOOH 0,1% và HCOONH4 10 mM trong H2O; Kênh B: ACN. (4) Kênh A: CH3COONH4 40 mM trong H2O; Kênh B: CH3COONH4 40 mM trong MeOH. (5) Kênh A: CH3COONH4 10 mM trong H2O; Kênh B: CH3COONH4 10 mM trong MeOH. Kết quả trên sắc ký đồ Hình 1 cho thấy các hệ pha động đều xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Tuy nhiên, píc của chất phân tích ở hệ pha động (1), (2) và (3) không tách được hoàn toàn, píc bị chẻ, nhiễu nền cao; píc của chất phân tích ở hệ pha động (4) và (5) có hình dáng tương đồng nhau, đã tách khỏi các thành phần khác, tuy nhiên píc bị đổ đầu, không cân đối. Lựa chọn hệ pha động (5) cho khảo sát tiếp theo. Khảo sát dung môi pha chuẩn làm việc Chuẩn gốc patulin pha trong methanol cho dung dịch bền và tăng thời gian bảo quản, tuy nhiên các chuẩn làm việc pha loãng bằng MeOH thì píc bị đổ đầu, không cân đối. Vì vậy sau khi lựa chọn pha động (5) thì tiến hành phân tích chuẩn làm việc patulin pha trong CH3COOH 0,1% (pH=4) thấy có tín hiệu của chất phân tích cao hơn các sắc ký đồ còn lại, píc cân đối và rửa giải thời gian ngắn (tR~ 6,0 phút) (Hình 1f). Vì vậy, lựa chọn hệ pha động (5) để tiến hành phân tích và dùng CH3COOH 0,1% (pH=4) để pha chuẩn làm việc patulin 1 µg/ml cho mỗi ngày phân tích mẫu. (a). Kênh A: HCOOH 0,1% trong nước; Kênh B: Time, min MeOH (b). Kênh A: HCOOH 0,1% và HCOONH 4 5 mM trong nước; Kênh B: MeOH 5
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 Time, min (c). Kênh A: HCOOH 0,1% và HCOONH4 10 mM (d). Kênh A: CH3COONH4 40 mM trong nước; Kênh trong nước; Kênh B: ACN B: CH3COONH4 40 mM trong MeOH Time, min Time, min (e). Kênh A: CH3COONH4 10 mM trong nước; Kênh B: CH3COONH4 10 mM trong MeOH (f). Kênh A: CH3COONH4 10 mM trong nước; Kênh B: CH3COONH4 10 mM trong MeOH, chuẩn patulin/CH3COOH 0,1% (pH=4) Hình 1. Sắc ký đồ khảo sát dung môi pha động Khảo sát cột sắc ký Sau khi lựa chọn được hệ pha động, sử dụng dung dịch chuẩn patulin có nồng độ 100 ng/ml để tiến hành khảo sát cột sắc ký bao gồm: (A) Cột sắc ký Kinetex XB C18 (150 mm×4,6 mm, 3,5µm). (B) Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm×2,1 mm, 3,5µm). (C) Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm×3,0 mm, 3,5µm). Kết quả trên sắc ký đồ Hình 2 cho thấy píc sắc ký thu được khi phân tích bằng cột sắc ký (A) không cân xứng và bị tù, cột sắc ký (B) píc nhỏ, tín hiệu thấp, trong khi đó cột sắc ký (C) cho píc cân đối, nhọn, đáp ứng của patulin cao nhất. Do đó, lựa chọn cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm×3,0 mm, 3,5 µm) cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 2. Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký Khảo sát quy trình xử lý mẫu Trên cơ sở quy trình xử lý mẫu dự kiến nêu trên và điều kiện sắc ký và khối phổ đã khảo sát, tiến hành phân tích mẫu thêm chuẩn patulin nồng độ 0,1 µg/ml. Thực hiện khảo sát ở các 6
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 điều kiện khác nhau, mỗi điều kiện thực hiện lặp lại 3 lần. Kết quả của mỗi lần khảo sát sẽ được so sánh qua thông số là diện tích pic của chất cần phân tích. Khảo sát dung môi chiết Phân tích mẫu thêm chuẩn patulin nồng độ 0,1 µg/ml với dung môi chiết là (1) ethyl acetat và (2) ethyl acetat: n-hexan (95:5, v/v). Từ cấu trúc của patulin cho thấy patulin tan tốt trong dung môi ethyl acetat hơn n-hexan. Khi thêm một lượng nhỏ n-hexan thì độ phân cực của dung môi (2) giảm xuống, hạn chế được một số tạp chất có độ phân cực hoặc phân cực trung bình đồng tan trong ethyl acetat. Mặt khác tăng khả năng tách biệt của dung môi chiết với pha nước, tạo điều kiện dễ dàng tách pha khi chiết xuất. Tuy nhiên kết quả Hình 3(a) cho thấy khi sử dụng 100 % ethyl acetat cho tín hiệu diện tích píc của chất phân tích cao hơn khi chiết bằng ethyl acetat: n-hexan (95:5, v/v) và patulin vẫn tách khỏi các chất khác trong nền mẫu. Do đó, dung môi chiết được lựa chọn cho quy trình xử lý mẫu là ethyl acetat. Khảo sát thể tích dung môi chiết và số lần chiết số lần chiết Sau khi lựa chọn ethyl acetat làm dung môi chiết thì tiến hành khảo sát thể tích dung môi chiết: chiết 2 lần×20 ml và chiết 1 lần×50 ml. Kết quả ở Hình 3(b) cho thấy đáp ứng của chất phân tích khi chiết 2 lần mỗi lần 20 ml cao hơn khi chiết 1 lần 50 ml. Vì vậy, lựa chọn chiết 2 lần mỗi lần 20 ml ethyl acetat cho các khảo sát tiếp theo. Khảo sát điều kiện cô mẫu Nhằm mục đích chiết xuất được lượng chất phân tích lớn nhất từ mẫu ban đầu, điều kiện cô mẫu được khảo sát ở 2 điều kiện: 1) Cô quay: Chuyển 20 ml dịch lọc vào bình cầu 100 ml, sử dụng thiết bị cô quay chân không đến cạn dung môi. 2) Thổi khô Nitơ: Chuyển 20 ml dịch lọc vào ống ly tâm 50 ml, sử dụng thiết bị thổi khô bằng khí Nitơ. Sau khi cô mẫu, cắn được hòa tan trong 1 ml dung môi. Kết quả ở Hình 3(c) nhận thấy, khi cô mẫu sử dụng thiết bị thổi khô bằng khí N2 cho đáp ứng của chất phân tích cao hơn khi sử dụng thiết bị cô quay. Điều này có thể là do thiết bị cô quay sử dụng bình cầu 100 ml, cắn được trải rộng nên bề mặt bình cầu nên việc sử dụng 1 ml dung môi khó hoàn tan hoàn toàn hết cắn. Còn khi sử dụng bộ thổi khô với ống ly tâm thì cắn tập trung ở phần đầu nhọn của ống nên việc hòa tan lượng cắn dễ dàng hơn. Vì vậy thiết bị thổi khô bằng khí Nitơ được chọn cho quy trình xử lý mẫu. Khảo sát dung môi hòa tan cắn Sau khi cô mẫu thì cắn sẽ được hòa tan vào một dung môi để tiêm vào hệ thống LC- MS/ MS. Các dung môi hòa tan được khảo sát lần lượt là CH3COOH 0,1% (pH=4); CH3COOH 0,1% (pH=4):MeOH(1:1, v/v) và MeOH. Kết quả khảo sát được trình bày ở Hình 3(d) cho thấy đáp ứng của chất phân tích khi hòa tan bằng dung môi CH3COOH 0,1% (pH=4):MeOH (1:1, v/v) cao hơn khi hòa tan bằng dung môi CH3COOH 0,1% (pH=4) và MeOH và píc nhọn, cân đối. Do patulin tan tốt trong MeOH hơn CH3COOH 0,1% (pH=4) nên khi hòa tan cắn trong dung môi CH3COOH 0,1% (pH=4) thì patulin không được hòa tan hoàn toàn dẫn đến tín hiệu diện tích píc thấp hơn. Tuy nhiên khi dung môi hòa tan cắn là MeOH thì píc của patulin xấu, bị đổ đầu, không cân đối nên đáp ứng chất phân tích thấp. Do đó, chọn dung môi hòa tan cắn là CH3COOH 0,1% (pH=4):MeOH (1:1, v/v) cho quy trình xử lý mẫu và dung môi này cũng phù hợp với dung môi pha chuẩn làm việc. 7
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 4 3,81 3,71 6.00 4,86 Diện tích pic (x105) Diện tích pic (x105) 3.5 5.00 4,27 3 2.5 4.00 2 3.00 1.5 2.00 1 Ethyl acetat Ethylacetat : n-hexan 1.00 (95:5, v/v) 20mLx2lần 50mLx1lần (a). Khảo sát dung môi chiết (b). Khảo sát thể tích dung môi chiết 6.00 5,32 7.00 6.09 5.34 5.41 Diện tích pic (x105) 6.00 5.00 5.00 Diện tích pic (x105) 4.00 4.00 3.00 3,11 2.00 3.00 1.00 2.00 CH3COOH CH3COOH MeOH 0,1% 0,1% : 1.00 MeOH Cô quay Thổi khô Nitơ (1:1) (c). Khảo sát điều kiện cô mẫu (d). Khảo sát dung môi hòa tan cắn Hình 3. Sắc ký đồ khảo sát quy trình xử lý mẫu Từ các kết quả khảo sát, quy trình xử lý mẫu tối ưu được lựa chọn như sau: Cân chính xác khoảng 10,00 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml, thêm 10 ml dung dịch acid acetic 2%, lắc xoáy trong 2 phút. Chiết lỏng-lỏng bằng 20 ml ethyl acetat, lắc xoáy trong 5 phút,siêu âm trong 15 phút ở nhiệt độ thường. Cho ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút bằng máy ly tâm lạnh và tách riêng pha lỏng vào ống ly tâm 50 ml khác. Chiết lặp lại lần 2 với 20 ml ethyl acetat. Gộp dịch chiết 2 lần. Thêm 5 ml Na2CO3 1,5% vào dịch chiết, lắc xoáy trong 1 phút, ly tâm 6000 vòng/phút trong 3 phút. Lớp dịch phía trên được lọc qua giấy lọc chứa Na2SO4 khan. Chuyển 20 ml dịch lọc vào ống ly tâm 50 ml, làm bay hơi dung môi bằng thiết bị thổi khô bằng khí Nitơ đến cắn. Hòa tan cắn bằng 1,0 ml CH3COOH 0,1% (pH=4): MeOH (1:1, v/v). Lọc qua màng lọc 0,22 µm và phân tích bằng thiết bị LC-MS/MS. Thẩm định phương pháp Độ đặc hiệu Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫu rắn và nền mẫu lỏng qua các tiêu chí: - Tính số điểm IP: Patulin có 1 ion mẹ và 2 ion con, số điểm IP=5, thỏa mãn yêu cầu phân tích trên khối phổ (EC 2021/808) [11]. - Tỉ số ion (IR) và độ lệch (𝑅 𝑑𝑖𝑓𝑓 ) giữa tỉ lệ ion mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu và mẫu chuẩn trong dung môi được trình bày ở Bảng 3, thỏa mãn yêu cầu phân tích trên khối phổ (EC2021/808) [11]. Bảng 3. Bảng so sánh tỉ số ion Chất phân Dung môi Nền mẫu rắn Nền mẫu lỏng Yêu cầu tích IR (%) IR (%) 𝑅 𝑑𝑖𝑓𝑓 (%) IR (%) 𝑅 𝑑𝑖𝑓𝑓 (%) Patulin 50,7 53,5 5,5 52,6 3,7 ± 20% 8
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn trên hai nền mẫu rắn và lỏng: Kết quả sắc đồ đánh giá độ đặc hiệu ở Hình 4 trên nền mẫu rắn và Hình 5 trên nền mẫu lỏng cho thấy, mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu của chất phân tích, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn có tín hiệu tại cùng thời gian lưu chênh lệch không quá 2%. Như vậy, phươngpháp đáp ứng yêu cầu về thông số thẩm định tính đặc hiệu để phân tích patulin (theo AOAC). Time, min Time, min Hình 4. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn patulin Hình 5. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu rắn patulin và mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu lỏng. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ Tiến hành phân tích mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu rắn và lỏng ở các mức nồng độ thấp dần, xác định tỷ lệ S/N dựa trên phần mềm của thiết bị sau đó dựa vào kết quả S/N để xác định và giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). Kết quả tìm được LOD và LOQ của phương pháp lần lượt là 2,0 và 6,0 µg/kg. (a). LOD trên nền mẫu lỏng (b). LOD trên nền mẫu rắn 9
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 (c). LOQ trên nền mẫu lỏng (d). LOQ trên nền rắn Hình 6. Sắc ký đồ giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của patulin trên các nền mẫu. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Trên cơ sở điều kiện tối ưu lựa chọn, phân tích dãy dung dịch chuẩn ở các mức nồngđộ 30; 50; 100; 200; 500; 1000 và 2000 ng/ml trên dịch (tương ứng với các mức nồng độ 6;10; 20; 40; 100; 200 và 400 µg/kg trên nền mẫu). Kết quả cho thấy các phương trình đường chuẩn của chất phân tích trên các nền mẫu rắn (y=0,0079x - 0,0115; R2=0,9997) và nền mẫu lỏng (y = 0,0094 x + 0,3211; R2=0,9996) thể hiện mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và đáp ứng của chất phân tích. Mặt khác độ chệch tại tất cả các điểm nồng độ đều không vượt quá 15%, độ chệch tại LOQ không vượt quá 20%. Vì vậy phương pháp đạt yêu cầu về độ tuyến tính theo AOAC. Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào mẫu đã được xác định không chứa chất phân tích, tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng. Các mẫu được thêm chuẩn ở các mức nồng độ 30 ng/ml, 200 ng/ml và 1000 ng/ml, mỗi mức nồng độ tiến hành 6 lần độc lập. Các kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 4. Bảng 4. Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi của chất phân tích trên các nền mẫu. Nồng độ Nền mẫu rắn Nền mẫu lỏng Yêu cầu AOAC (ng/ml) Độ thu hồi RSD (%) Độ thu hồi (%) RSD Độ thu hồi (%) RSD (%) (%) (%) 30 80,9-103,0 6,5 89,1-103,0 2,5 60-115 < 21 200 95,9-110,0 5,4 97,3-106,0 3,0 80-110 < 15 1000 82,0-110,0 9,5 98,0-102,0 1,4 80-110 < 11 Độ thu hồi của cả chất phân tích nằm trong khoảng từ 80,9-110,0%, độ lệch chuẩn tương đối trong khoảng từ 1,4-9,5%. Phương pháp có độ chính xác đáp ứng theo yêu cầu của AOAC. Độ chính xác trung gian Tiến hành phân tích lặp lại 6 lần mẫu thêm chuẩn patulin trên nền mẫu trắng ở mức nồng độ 200 ng/ml trên nền mẫu rắn và nền mẫu lỏng. Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng và phân tích mẫu theo điều kiện sắc ký và khối phổ đã lựa chọn. Kết quả cho thấy hàm lượng patulin trên nền mẫu rắn từ 19,1-20,3 µg/kg (RSD 2,3%), nền mẫu lỏng từ 17,0-19,8 µg/kg (RSD 6,1%), đáp ứng theo yêu cầu của AOAC (
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 phẩm từ táo được thu thập ngẫu nhiên tại các chợ, siêu thị trên địa bàn Hà Nội và trên các sàn thương mại điện tử. Kết quả được trình bày ở Bảng 5. Hình 7. Sắc ký đồ các mẫu thực dương tính Từ kết quả thu được ở Bảng 5, trong 27 mẫu phân tích, có 4 mẫu phát hiện có patulin, trong đó có 1 mẫu dương tính có nồng độ phát hiện là 15,1 µg/kg. Mẫu dương tính là sản phẩm từ táo dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi với hàm lượng 15,1 µg/kg, vượt quá giới hạn tối đa cho phép theo quy định của EU và Bộ Y tế Việt Nam (tối đa 10 µg/kg). Bảng 5. Kết quả phân tích hàm lượng Patulin trong 27 mẫu táo và sản phẩm từ táo. Mẫu Hàm lượng Mẫu Hàm lượng Mẫu Hàm lượng (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) NET-1 – QT-8 – QT-4 – RT-1 < LOQ QT-9 – QT-5 – RT-2 < LOQ QT-10 – QT-6 – NET-2 – QT-11 – QT-7 – NET-3 – NET-5 – NET-8 – NET-4 – NET-6 – TE-1 – QT-1 – NET-7 < LOQ TE-2 15,1 QT-2 – GT-1 – TE-3 – QT-3 – GT-2 – TE-4 – Ghi chú: (-) mẫu âm tính, NET (nước ép táo), QT: quả táo, RT: rượu táo, GT: giấm táo, TE: đồ ăn trẻ em từ táo Bàn luận Trên thế giới đã có nhiều phương pháp định lượng patulin trong táo và các sản phẩm tử táo bằng LC-MS/MS [7,8] nhưng ở Việt Nam mới chỉ có phương pháp HPLC [9], chưa có nghiên cứu nào bằng LC-MS/MS. Phương pháp định lượng patulin trong táo và các sản phẩm từ táo bằng LC-MS/MS đã xây dựng có độ nhạy và độ chọn lọc cao hơn so với phương pháp HPLC [6,9] vì xác định dựa trên thời gian lưu của chất phân tích, số điểm IP và tỷ lệ ion của hai ion con thu được. Vì vậy, đối với việc phân tích nhiều nền mẫu phức tạp (nền rắn, lỏng) từ 11
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 táo thì phương pháp LC-MS/MS có thể tránh được những trường hợp dương tính giả khi nền mẫu có xuất hiện tạp có cùng thời gian lưu với chất phân tích. So với một số phương pháp LC- MS/MS khác đã có thì phương pháp đã xây dựng có giới hạn phát hiện LOD = 2 µg/kg và giới hạn định lượng LOQ = 6 µg/kg thấp hơn và nghiên cứu của Radicevic T và cộng sự năm 2021 có LOD= 9,85 µg/kg và LOQ=19,7 µg/kg [7]. Mặt khác phương pháp xử lý mẫu patulin phổ biến là chiết pha rắn [8] và chiết lỏng-lỏng [6,7]. Nhóm nghiên cứu đã lựa chọn phương pháp chiết lỏng-lỏng, chiết lặp lại 3 lần để chiết kiệt patulin thay vì chiết pha rắn để xử lý mẫu patulin do chiết lỏng-lỏng có quy trình dễ thực hiện và tiết kiệm chi phí hơn [8] mà vẫn đảm bảo tỷ lệ thu hồi cao (80,9-110,0 %). Mặc dù quy trình xử lý mẫu còn nhiều bước nhưng phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm, phòng kiểm tra chất lượng tại Việt Nam. Vì vậy phương pháp rất phù hợp để phân tích hàm lượng patulin trong các sản phẩm từ táo dành cho trẻ em với ngưỡng tối đa cho phép của EU là 10 µg/kg. Sau khi phân tích 27 mẫu thực phát hiện 04 mẫu dương tính với Patulin, trong đó có 01 mẫu dương tính có hàm lượng vượt quá giới hạn tối đa cho phép theo quy định của EU và Bộ Y tế (Việt Nam). Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng có tính thực tiễn cao, là đóng góp mới trong việc phát hiện patulin trong táo và sản phẩm từ táo. Từ đó, góp phần vào công tác quản lý, kiểm tra chất lượng thực phẩm trên thị trường. Kết luận Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS để xác định hàm lượng patulin trong táo và sản phẩm từ táo. Các điều kiện phân tích gồm: điều kiện khối phổ chế độ ion hóa ESI âm, chất phân tích được phát hiện dựa vào m/z của ion mẹ (153) và hai ion con mảnh định tính (81) và mảnh định lượng (109); pha động theo chế độ gradient gồm kênh A là CH3COONH4 10 mM trong H2O và kênh B là CH3COONH4 10 mM trong MeOH, cột sắc ký Symmetry C18, kết hợp xử lý mẫu bằng chiết lỏng-lỏng… Phương pháp đã được thẩm định và kết quả đáp ứng theo yêu cầu của AOAC (giới hạn định lượng là 6 µg/kg; giá trị độ thu hồi trong khoảng 80,9-110%, độ lệch chuẩn tương đối từ 1,4-9,5%). Trong 27 mẫu táo và sản phẩm từ táo đã phân tích, phát hiện 04 mẫu chứa patulin, trong đó có 03 mẫu có hàm lượng nhỏ hơn LOQ (6 µg/kg) và 01 mẫu là sản phẩm từ táo dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi có hàm lượng 15,1 µg/kg vượt quá giới hạn tối đa cho phép (≤10 µg/kg) theo quy định của EU và Bộ Y tế (Việt Nam). Nghiên cứu sẽ tiếp tục được để phân tích hàm patulin trong táo và sản phẩm từ táo, đặc biệt là các sản phẩm dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ được bán tại nhiều vùng địa phương khác, trên các sàn thương mại điện tử và mở rộng trên nền mẫu khác như sữa, rượu và các loại trái cây khác. Xung đột lợi ích Không. Tài liệu tham khảo 1. Sadok I, Stachniuk, A., & Staniszewska, M. Developments in the Monitoring of Patulin in Fruits Using Liquid Chromatography: an Overview. Food Anal. Methods. 2019;(12):76-93 https://link.springer.com/article/10.1007/s12161-018-1340-9 2. Pal S, Singh N, Ansari KM. Toxicological effects of patulin mycotoxin on the mammalian system: an overview. Toxicol Res. 2017;6(6):764-771. doi: 10.1039/c7tx00138j. 3. Union E. Commission Regulation (EU) 2023/915 of 25 April 2023 on maximum levels for certain contaminants in food and repealing Regulation (EC) No 1881/2006 (Text with EEArelevance). Official Journal of the European Union 2023. p. 119, 22-64. https://eur- 12
Nguyễn Thị Thùy Linh và cs JPRDI 2025; 00(00); 000 - 000 lex.europa.eu/eli/reg/2023/915/oj 4. Bộ Y tế Việt Nam. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm (QCVN 8-1:2011/BYT). Bộ Y tế Việt Nam; 2011. https://vbpl.vn/FileData/TW/Lists/vbpq/Attachments/26964/VanBanGoc_02_2011_TT -BYT.pdf 5. Cunha S, Faria M, Fernandes JJFC. Determination of patulin in apple and quince products by GC–MS using 13C5–7 patulin as internal standard. Food Chem. 2009;115(1):352-359. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.11.074 6. Iqbal SZ, Malik S, Asi MR, Selamat J, Malik NJFC. Natural occurrence of patulin in different fruits, juices and smoothies and evaluation of dietary intake in Punjab, Pakistan. Food Control. 2018;84:370-374. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.08.024 7. Radicevic T, Jankovic S, Simunovic S, Stefanovic S, Petrovic Z, Jelusic V. Determination of patulin in apple juice by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci 854 (2021) 012075. https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1755-1315/854/1/012075/pdf 8. Yang Y, Yang Y, Shao B, Zhang JJFAM. A simple and rapid method for determination of patulin in juice by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Food Anal. Methods. 2017;10(9):2913-2918. DOI: 10.1088/1755- 1315/854/1/012075 9. Ngô Văn Tứ, Hà Thùy Trang, Nguyễn Thị Minh Tươi. Phân tích và đánh giá hàm lượng patulin trong các loại nước uống trái cây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tạp chí khoa học. 2018;(04(48)/2018):47-57. https://vjol.info.vn/index.php/DHSP- DHH/article/view/39219 10. AOAC. (2016). Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements. https://www.aoac.org/wp-content/uploads/2019/08/app_f.pdf 11. Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808 on the performance of analytical methods for residues of pharmacologically active substances used in food-producing animals and on the interpretation of results as well as on the methods to be used for sampling and repealing Decisions 2002/657/EC and 98/179/EC. Official Journal of the European Union 2021:84-109. https://eur-lex.europa.eu/eli/reg_impl/2021/808/oj 13

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.