Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 3)

Chia sẻ: Minh Vũ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:32

Thêm vào BST

Báo xấu

110
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Bài 3)" cung cấp cho người học các kiến thức về các phương pháp lai phân tử bao gồm: Cơ sở khoa học, lai giữa các nucleic acid, một số kỹ thuật lai phân tử, lai northern,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 3)

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Các phương pháp lai phân tử  Phương pháp PCR, ứng dụng  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH
CƠ SỞ KHOA HỌC  Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity)  Các dạng phức hợp lai bổ sung: – DNA - DNA Lai giữa các nucleic acid – DNA - RNA – Protein – Protein (thường ở dạng phức hợp kháng nguyên – kháng thể) 8/26/2014 2
LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA hoặc DNA- RNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T (hoặc U) hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. T A U A Lai giữa các nucleic acid C G 8/26/2014 3
LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) 8/26/2014 4
MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ • LAI SOUTHERN (DNA – DNA) • LAI NORTHERN (DNA – RNA) • LAI WESTERN (PROTEIN – PROTEIN) 8/26/2014 5
So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai Southern, Northern và Western 8/26/2014 6
LAI SOUTHERN • Lịch sử – Do Edwin Southern đề xuất năm 1975 và sau đó được tiếp tục hoàn thiện. – Với sự phát triển của kỹ thuật này, Southern đã nhận được giải thưởng Lancaster trong lĩnh vực Y học vào năm 2005. Edwin Southern 8/26/2014 7
LAI SOUTHERN • Nguyên lý – Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa 2 phân tử DNA mạch đơn (DNA-DNA) – Cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn DNA nào đó trong một hỗn hợp các đoạn DNA khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò đã được đánh dấu với đoạn DNA chứa trình tự bổ sung với mẫu dò đó. • Kỹ thuật lai Southern cho biết – Sự có mặt của đoạn DNA (gen) – Số lượng đoạn DNA có mặt (tương ứng với số gen) – Độ lớn của đoạn DNA – Trình tự tương tự giữa đoạn DNA mục tiêu và mẫu dò 8/26/2014 8
Các bước tiến hành Bước1: Chuẩn bị DNA mẫu. Bước 2: Chuyển ssDNA lên màng lai (giai đoạn này gồm nhiều bước) Bước 3: Lai ssDNA với mẫu dò Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. 8/26/2014 9
Bước 1: Chuẩn bị DNA mẫu 1 2 3 1 2 3 Marker Đối chứng Mẫu nghiên cứu 8/26/2014 10
Bước 2: Chuyển DNA mạch đơn lên màng lai DNA Giấy thấm Gel Membrane Gel Membrane Buffer 8/26/2014 11
Bước 3: Lai phân tử Bổ sung chất “khóa” màng lai Bổ sung mẫu dò Màng lai sau khi rửa Màng lai có mang các DNA mạch Phần màng lai đơn không mang DNA Mẫu dò được phủ được phủ bằng trên toàn bộ chất “khóa” màng màng lai nhưng Mẫu dò chỉ còn có lai chỉ liên kết với mặt ở trạng thái liên 8/26/2014 các DNA bổ sung kết bổ sung với12DNA
Bước 4: Thu kết quả Màng mang phân tử lai giữa mẫu dò và DNA Phim X-quang được đặt trên màng lai cho đến khi sự phát Các đoạn bổ sung xạ từ mẫu dò được với mẫu dò xuất 8/26/2014 ghi lên phim hiện như các vạch 13 băng
Bước 4: Thu kết quả Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi 8/26/2014 14
8/26/2014 15
LAI NORTHERN • Lịch sử − Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine và George Stark tại Stanford University. − Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng dụng cho phân tích RNA 8/26/2014 16
LAI NORTHERN • Nguyên lý – Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA – Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA. Các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp Southern blot. • Phương pháp này cho biết – Sự có mặt của mRNA trong mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của mRNA – Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò 8/26/2014 17
Mẫu RNA Vật nặng Giấy Màng lai thấm Khoảng trống Khay chứa Giá đỡ Tập giấy Đặt màng lai lên trên gel, đặt giấy dung dịch đệm thấm thấm, vật nặng lên trên. RNA di Phân tách RNA theo kích chuyển lên màng lai nhờ mao dẫn thước nhờ chạy điện di Bổ sung mẫu dò phóng xạ mạch đơn Túi lai Các bước tiến hành Bước1: chuẩn bị RNA mẫu. (E) Ghi nhận kết quả Bước 2: Chuyển RNA lên màng lai bằng phóng xạ tự ghi - Chạy điện di Vị trí không lai - Chuyển RNA lên màng lai Vị trí xảy ra lai Bước 3: Lai RNA với mẫu dò RNA-DNA Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. 8/26/2014 18
LAI WESTERN • Lịch sử − Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng thí nghiệm của George Stark ở Stanford. Kỹ thuật này đã được W. Neal Burnette đặt tên là Western blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot. 8/26/2014 19
LAI WESTERN • Nguyên lý – Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể • Phương pháp này cho biết – Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của protein 8/26/2014 20