Đánh giá HER2 trong ung thu vú bằng phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang và lai tại chỗ gắn bạc

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ HER2 TRONG UNG THU VÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP <br /> LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG VÀ LAI TẠI CHỖ GẮN BẠC <br /> Đoàn Thị Phương Thảo*, Phan Đăng Anh Thư*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung* <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Giới  thiệu:  Tình trạng HER2 trong ung thư vú giữ vai trò rất quan trọng trong việc đưa ra quyết định <br /> điều trị, giúp cho các nhà lâm sàng tiên đoán đáp ứng hóa trị liệu, có hoặc không đáp ứng nội tiết và là yếu tố chỉ <br /> định  cho  điều  trị  kháng  thể  đơn  dòng  trastuzumab.  Phương  pháp  lai  tại  chỗ  huỳnh  quang  (FISH),  được <br /> ASCO/CAP xác định là tiêu  chuẩn  vàng  để  khảo  sát  tình  trạng  HER2.  Bộ  môn  Giải  Phẫu  Bệnh  Đại  Học  Y <br /> Dược triển khai phương pháp này từ năm 2009 đến nay. Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp FISH đòi hỏi <br /> phòng xét nghiệm phải rất chuyên biệt, phải có kính hiển vi huỳnh quang, hơn nữa thời gian lưu trữ tiêu bản <br /> quá  ngắn  nên  không  thể  xem  xét  lại  khi  cần  thiết.  Song  song  với  phương  pháp  FISH,  từ  năm  2012  Bộ  môn <br /> chúng tôi đã ứng dụng thêm phương pháp lai tại chỗ gắn bạc hai màu (D‐ISH), với phương pháp này các tiêu <br /> bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học và đặc biệt tiêu bản có thể lưu trữ lâu dài. Phương pháp này cũng <br /> đã được FDA chấp thuận cho khảo sát HER2 vào tháng 6/2011. Mục tiêu của nghiên cứu này, chúng tôi khảo <br /> sát đối chiếu kết quả D‐ISH với kết quả FISH (tiêu chuẩn vàng) để có thể phát triển thêm một kỹ thuật mới với <br /> nhiều  ưu  điểm  hơn.  Đây  là  kết  quả  bước  đầu  khi  thực  hiện  phương  pháp  D‐ISH  để  khảo  sát  tình  trạng  gen <br /> HER2 trong ung thư vú. <br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang: dùng bộ kít PathVysion <br /> HER‐2  DNA  Probe.  Phương pháp lai tại chỗ  gắn bạc (D‐ISH): dùng bộ  INFORM  HER2  Dual  ISH  DNA <br /> Probe.  Dùng  trên  máy  nhuộm  tự  động.  Phương  pháp  Hóa  Mô  Miễn  Dịch:  bộ  Pathway  (Ventana  Medical <br /> Systems Inc, Tucson, Ariz) dùng trên máy nhuộm tự động. <br /> Kết quả: Khảo sát 67 mẫu ung thư vú xâm lấn, trong đó có 47 mẫu được thực hiện đồng thời D‐ISH, <br /> FISH và HMMD. 20 mẫu thực hiện D‐ISH và HMMD. Tương hợp giữa kết quả của hai phương pháp lai <br /> với kết quả HMMD gần như tuyệt đối trong nhóm HER2(‐) và HER2(3+), nhóm HER2(2+) thì tỉ lệ khuếch <br /> đại  dưới  20%.  Tương  hợp  giữa  kết  quả  FISH  và  Kết  quả  D‐ISH  là  100%  cả  nhóm  không  khuếch  đại  và <br /> khuếch đại gen HER2. <br /> Kết  luận: Trong nghiên cứu này, sự phù hợp giữa IHC và D‐ISH, FISH là trung bình. Sự phù hợp <br /> giữa kết quả FISH và D‐ISH là 100% cho cả trường hợp khuếch đại và không khuếch đại. Phương pháp D‐<br /> ISH là phương pháp được chấp nhận để đánh giá HER2, kết quả nghiên cứu này đã cho thấy phương pháp <br /> D‐ISH  có  thể  xác  định  được  tình  trạng  HER2  với  tỉ  lệ  tương  hợp  hai  kết  quả  FISH  và  D‐ISH  là  100%. <br /> Ngoài ra, xét nghiệm D‐ISH dễ sử dụng vì khảo sát được dưới kính hiển quang học, tín hiệu màu không <br /> phân hủy theo thời gian, mẫu có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài. Phương pháp FISH <br /> hoặc D‐ISH nên được thực hiện cho tất cả các bệnh nhân cần điều trị bằng trastuzumab. <br /> Từ  khóa:  hóa  mô  miễn  dịch,  lai  tại  chỗ  huỳnh  quang  (FISH),  lai  tại  chỗ  gắn  bạc  hai  màu  (D‐ISH), <br /> HER2. <br /> *Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh – Đại Học Y Dược TP.HCM <br /> Tác giả liên lạc: TS Đoàn Thị Phương Thảo ĐT: 0938008418 <br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh <br /> <br /> Email: thaodtpdhyd@gmail.com <br /> <br /> 75<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br /> <br /> ABSTRACT <br /> EVALUATION OF HER2 STATUS IN BREAST CANCER BY FLUORESCENCE IN SITU <br /> HYBRIDIZATION, DUAL IN SITU HYBRIDIZATION AND IMMUNOHISTOCHEMICTRY <br /> Doan Thi Phuong Thao, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung <br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 76 ‐ 82 <br /> Introduction: The application of FISH and D‐ISH methods to determine HER2 status in breast cancer in <br /> order to provide the most accurate results for patients receiving treatment most appropriate. <br /> Methods:  FISH:  Human  epidermal  growth  factor  receptor  2  (HER2)  fluorescence  in  situ  hybridization <br /> (FISH) is a quantitative assay for selecting breast cancer patients for target therapy. D‐ISH: Our objective was to <br /> apply  an  automated  dual  in  situ  hybridization  (D‐ISH)  application  for  HER2  gene  and  chromosome  17 <br /> centromere (CEN 17) in invasive breast carcinomas. (1) HER2 copies via silver in situ hybridisation (SISH) and <br /> (2) Chromosome 17 (CEN17) copies via chromogenic Red in situ hybridisation (Red ISH) on a single slide. The <br /> recognition  of  amplified  HER2  copies  which  may  require  microscopic  examination  using  objectives  as  high  as <br /> 40X to 60X. <br /> Result: 67 invasive breast cancer samples performed simultaneously IHC and FISH or D‐ISH. Including 47 <br /> samples were carried out simultaneously D‐ISH, FISH and IHC. 20 samples performed simultaneously D‐ISH <br /> and  IHC.  The  concordance  between  results  of  the  two  methods  ISH  with  results  IHC  almost  absolute  among <br /> HER2(‐)  and  HER2(3  +).  However,  in  HER2(2  +),  the  amplification  rate  of  HER2  gene  below  20%.  The <br /> correlation between D‐ISH and FISH assays are 100%. <br /> Conclusions:  In this study, the  concordance between IHC and D‐ISH, FISH assays is intermediate. The <br /> concordance between FISH and D‐ISH was 100% for amplified and nonamplified cases. D‐ISH has become an <br /> accepted method for HER2 testing, in this study, have shown that D‐ISH is an effective test for the determination <br /> of HER2 status, with generally excellent concordance with FISH analysis. In addition, D‐ISH assays are easy to <br /> use because they require only a standard bright‐field microscope and stained samples do not decay over time, that <br /> we can be stored at room temperature. D‐ISH is, therefore, a viable alternative to FISH in laboratories in which <br /> FISH testing is not, or cannot be, established. FISH or D‐ISH should be done for all patients in need of treatment <br /> with Trastuzumab. <br /> Keywords: IHC, FISH, D‐ISH, gene HER2 <br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> Khuếch  đại  gen  HER2  là  nguyên  nhân  của <br /> 25% đến 30% ung thư vú(9,12), biểu hiện quá mức <br /> của  quá  mức  HER2  và/hoặc  khuếch  đại  gen  là <br /> yếu  tố  tiên  lượng  xấu,  thường  kèm  với  thụ  thể <br /> nội tiết âm tính, tỉ lệ phân bào cao, nhân dị dạng, <br /> đột biến gen p53 cho cả các trường hợp ung thư <br /> vú di căn hoặc chưa. Tình trạng HER2 giúp cho <br /> các nhà lâm sàng tiên đoán đáp ứng hóa trị liệu, <br /> có hoặc không đáp ứng nội tiết và là yếu tố chỉ <br /> định  cho  điều  trị  kháng  thể  đơn  dòng <br /> trastuzumab(1,7).  Vì  tình  trạng  HER2  giữ  vai  trò <br /> rất quan trọng trong việc đưa ra quyết định điều <br /> trị, những bệnh nhân có kết quả dương tính giả <br /> <br /> 76<br /> <br /> không những không được hưởng lợi từ các liệu <br /> pháp điều trị mà còn có nguy cơ bị gây độc cho <br /> cơ tim khi điều trị kháng thể đơn dòng(10) ngược <br /> lại, những bệnh nhân âm tính giả sẽ không nhận <br /> được điều trị thỏa đáng. Điều này, đã khiến các <br /> nhà nghiên cứu tập trung chú ý vào độ nhạy và <br /> độ đặc hiệu của các xét nghiệm khác nhau dùng <br /> để  xác  định  tình  trạng  HER2.  Các  xét  nghiệm <br /> đánh  giá  HER2  phải  là  định  lượng  hoặc  bán <br /> định  lượng,  có  khả  năng  lặp  lại  và  phải  là  xét <br /> nghiệm  phân  biệt  rõ  ràng  giữa  các  tế  bào  ung <br /> thư vú xâm lấn có hoặc không khuếch đại/biểu <br /> hiện quá mức HER2(5,8). <br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Để xác định tình trạng HER2, phương pháp <br /> lai  tại  chỗ  huỳnh  quang  được  xem  như  là  tiêu <br /> chuẩn vàng, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi <br /> phải có kính hiển vi huỳnh quang và phòng xét <br /> nghiệm  chuyên  biệt,  hơn  nữa  là  các  tiêu  bản <br /> huỳnh quang không thể lưu trữ được lâu dài để <br /> xem xét lại vì tín hiệu huỳnh quang sẽ mất dần. <br /> <br /> Administration) chấp thuận để đánh giá thụ thể <br /> HER2. <br /> <br /> Hiện  nay,  phương  pháp  lai  tại  chỗ  gắn  bạc <br /> dựa trên nguyên tắc phản ứng men có thể thay <br /> thế  được  kỹ  thuật  FISH  để  đánh  giá  cả  gen <br /> HER2  và  centromere  của  nhiễm  sắc  thể  17  trên <br /> cùng  một  tiêu  bản.  Với  phương  pháp  này,  tiêu <br /> bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học <br /> và  đặc  biệt  là  lưu  trữ  tiêu  bản  được  lâu  dài,  có <br /> thể  chẩn  đoán,  hội  chẩn,  xem  xét  lại  khi  cần <br /> thiết. Chính vì thế, sau một thời gian thực hiện <br /> kỹ  thuật  FISH  để  khảo  sát  sự  khuếch  đại  gen <br /> HER2  hiện  nay  bộ  môn  chúng  tôi  thực  hiện <br /> thêm kỹ thuật D‐ISH để khảo sát sự khuếch đại <br /> HER2  và  công  trình  nghiên  cứu  này  là  kết  quả <br /> bước đầu. <br /> <br /> Người  khảo  sát  HMMD  độc  lập  với  người <br /> khảo sát FISH, D‐ISH. <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Đối tượng <br /> Bệnh nhân được chẩn đoán ung thư vú xâm <br /> lấn tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại Học Y Dược <br /> TP. Hồ Chí Minh. <br /> <br /> Tiêu chuẩn chọn <br /> Chọn  những  trường  hợp  đã  thực  hiện <br /> phương pháp FISH, HMMD trước đó, trong đó, <br /> 15  mẫu  HER2(‐),  17  mẫu  HER2(2+),  15  mẫu <br /> HER2(3+). <br /> Chọn  ngẫu  nhiên  20  các  trường  hợp  bệnh <br /> nhân  bị  ung  thư  vú  được  chẩn  đoán  vào  năm <br /> 2013,  chưa  có  kết  FISH  nhưng  có  kết  quả <br /> HMMD. <br /> <br /> Phương pháp <br /> Hóa  Mô  Miễn  Dịch:  thực  hiện  trên  máy  tự <br /> động  Ventana,  sử  dụng  PATHWAY™  HER2 <br /> (clone  CB11)  là  một  kháng  thể  đơn  dòng  phát <br /> hiện  kháng  nguyên  c‐2erbB  trong  các  mẫu  ung <br /> thư.  Đã  được  FDA  (Food  and  Drug <br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh <br /> <br /> Bộ  môn  Giải  Phẫu  Bệnh  đã  tham  gia  kiểm <br /> định  chất  lượng  xét  nghiệm  HMMD  HER2  với <br /> tổ  chức  United  Kingdom  National  External <br /> Quality  Assessment  Service  (UK  NEQUAS)  và <br /> đã đạt kết quả tốt. <br /> <br /> Đánh giá theo thang điểm của nhà sản xuất: <br /> 0:  màng tế bào u xâm lấn hoàn toàn không <br /> bắt màu. <br /> 1(+): <br /> rác, nhạt. <br /> <br /> màng tế bào u xâm lấn bắt màu rải <br /> <br /> 2(+): <br /> màng  tế  bào  u  xâm  lấn  bắt  màu <br /> hoàn toàn, mỏng, nhạt ≥ 30%. <br /> 3(+): <br /> màng  tế  bào  u  xâm  lấn  màu  hoàn <br /> toàn, dày, đậm ≥ 30%. <br /> Lai tại chỗ  huỳnh quang (FISH)(13): dùng bộ <br /> kít  PathVysion  HER‐2  DNA  Probe.  Đã  được <br /> FDA  (Food  and  Drug  Administration)  chấp <br /> thuận để đánh giá gen HER2. <br /> FISH được thực hiện theo quy trình của nhà <br /> sản xuất với thay đổi nhỏ. Bộ kit bao gồm đoạn <br /> dò PathVysion DNA Spectrum Orange‐đặc hiệu <br /> cho gen HER2 và đoạn dò Spectrum Green đặc <br /> hiệu  cho  các  trình  tự  DNA  tại  tâm  động  của <br /> nhiễm sắc thể 17 (CEP17). <br /> Bộ  môn  Giải  Phẫu  Bệnh  đã  tham  gia  kiểm <br /> định  chất  lượng  xét  nghiệm  FISH  HER2  với  tổ <br /> chức United Kingdom National External Quality <br /> Assessment  Service  (UK  NEQUAS)  và  đã  đạt <br /> kết quả chấp nhận được. <br /> Cách  đánh  giá  tiêu  bản  FISH:  theo  hướng <br /> dẫn  của  ASCO/CAP.  Tín  hiệu  SpectrumOrange <br /> và  SpectrumGreen  được  đếm  trong  20  nhân  tế <br /> bào ung thư xâm lấn không chồng chất, trường <br /> hợp  tỉ  lệ  chưa  phân  định  được  khuếch  đại  hay <br /> không  hoặc  giáp  biên,  chúng  tôi  đếm  thêm  40 <br /> nhân tế bào ung thư. Tổng số tín hiệu màu cam <br /> (HER2)  và  tín  hiệu  màu  xanh  lá  cây  (CEP17) <br /> được ghi nhận và tính tỷ lệ HER2/CEP17. <br /> <br /> 77<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br /> <br /> Tỉ lệ HER2/CEP17