ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (part 3)

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

90
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

47 Tuy nhiên sự khác biệt về màu sắc của tế bào nhiễm virus còn phụ thuộc vào trạng thái nhiễm WSSV của tế bào. Có 4 pha nhiễm của tế bào ứng với 4 pha của virus: Pha sớm (tế bào mới nhiễm virus), pha tăng sinh (lượng virus trong hạch nhân tăng nhanh chiếm hết nhân, dùng cơ chất trong nhân để sao chép vật liệu di truyền), pha cấp (virus phá vỡ màng nhân xâm nhiễm vào tế bào chất, sử dụng cơ chất trong tế bào chất để hoàn chỉnh cấu trúc), pha phóng thích (tế...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (part 3)

47 Tuy nhiên sự khác biệt về màu sắc của tế bào nhiễm virus còn phụ thuộc vào trạng thái nhiễm WSSV của tế bào. Có 4 pha nhiễm của tế bào ứng với 4 pha của virus: Pha sớm (tế bào mới nhiễm virus), pha tăng sinh (lượng virus trong hạch nhân tăng nhanh chiếm hết nhân, dùng cơ chất trong nhân để sao chép vật liệu di truyền), pha cấp (virus phá vỡ màng nhân xâm nhiễm vào tế bào chất, sử dụng cơ chất trong tế bào chất để hoàn chỉnh cấu trúc), pha phóng thích (tế bào vỡ và phóng thích virus). Nếu tế bào ở pha sớm, hạch nhân sẽ có màu vàng đến nâu nhạt. Nếu tế bào ở pha tăng sinh, hạch nhân trương to chiếm hết nhân và bắt màu nâu. Nếu tế bào ở pha cấp sẽ nhận thấy tế bào trương to và nâu sậm. Nếu tế bào ở pha phóng thích sẽ thấy có màu vàng, lan ra. Vì vậy ở bất kì nồng độ kháng thể nào cũng có những tế bào bắt màu vàng hay nâu nhạt, chỉ tuỳ vào lượng mAb nhiều hay ít, kết hợp đủ với kháng nguyên thì tín hiệu khuyếch đại sẽ nhiều, có thể giảm lượng tế bào có màu vàng hay nâu nhạt. C. Về độ sắc nét: Ở các nồng độ 0,5X, 1X và 1,5X, độ sắc nét của màu nhuộm thể hiện trên tế bào nhiễm không cao. Nồng độ 2X khác hẳn 3 nồng độ còn lại, trên tất cả các mẫu dương tính (8/10), phần lớn nhân tế bào trương to và tròn, có thể nhận thấy rõ mép nhân (25 - 75% tế bào có trên mẫu), những tế bào không có hình dạng đặc trưng là tròn to thì vẫn sắc nét (Bảng 4.4, Hình 4.2). Nồng độ 0,5X; 1X và 1,5X: Kết quả được ghi nhận chủ yếu ở vật kính 40x và - 100x vì ở vật kính 10x gần như tất cả các tế bào nhiễm đều không thể hiện được độ sắc nét. Nồng độ 2X: Nhiều tế bào thể hiện sự sắc nét ngay ở vật kính 10x. - Nguyên nhân: Thời gian giữ mẫu sau khi đúc trong nến và điều kiện lưu giữ ảnh hưởng lớn đến độ sắc nét. Những mẫu thí nghiệm do được thu, cố định và vùi trong nến cách đây khá lâu nên hình dạng tế bào và nhân tế bào không còn rõ nét. Tuy nhiên ở nồng độ 2X do lượng mAb quá cao, có thể đã kết hợp với toàn bộ kháng nguyên nên hình ảnh tế bào nhiễm sắc nét hơn. Ngoài ra độ sắc nét cũng phụ thuộc vào giai đoạn nhiễm WSSV của tế bào. Nếu tế bào ở pha sớm, hạch nhân trương lên nhưng chưa to. Ở pha tăng sinh và pha cấp thì
48 nhân sẽ có hình dạng đặc trưng. Ở pha phóng thích, hình dạng tế bào không rõ do có sự vỡ tế bào. A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 E1 E2 E3
49 Hình 4.2. Kết quả nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau và không có mAb trên mẫu 103 (tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một mang). A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 0X (100x), (400x), (1000x). Hình A1: Không thể nhận ra tế bào nhiễm - Hình A2: Vị trí mũi tên có thể là tế bào nhiễm - Hình A3: Tế bào nhiễm có nhân trương to và bắt màu hematoxylin. - B1, B2, B3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 0,5X (100x), (400x), (1000x). Hình B1: Nhận thấy những vị trí bắt màu vàng đến nâu nhạt trên mẫu - Hình B2, B3: Tế bào nhiễm có màu sắc khá rõ ràng, chỉ có tế bào ở vị trí mũi - tên mới có hình dạng đặc trưng. C1, C2, C3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 1X (100x), (400x), (1000x). Hình C1: Có thể nhận thấy rõ vi trí tế bào nhiễm có màu nâu. - Hình C2, C3: Tế bào nhiễm bắt màu đẹp, sắc nét. - D1, D2, D3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 1,5X (100x), (400x), (1000x). Tế bào nhiễm biểu hiện rõ ràng, dễ nhận biết E1, E2, E3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 2X (100x), (400x), (1000x). Hình E1: Các tế bào nhiễm bắt màu nâu rất đậm, gần như đen. - Hình E2, E3: Màu DAB quá đậm, hình dạng nhân sắc nét - 4.2. Kết quả nội dung so sánh phƣơng pháp IHC với phƣơng pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả. 4.2.1. So sánh độ chính xác và độ nhạy của 3 phƣơng pháp PCR, mô học và IHC.
50 Bảng 4.4. Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của ba phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thƣơng phẩm. Tôm post-larvae Tôm thương phẩm Kí hiệu Mô học Kí hiệu Mô học PCR IHC PCR IHC + 7683 - - - + 101 + 7787 - - - + 97 7661 + - - ++ 98 ++ 7781 - - - + 99 + 7536 + - - ++ + 336 7786 - - - ++ + 341 7718 - - - ++ + 342 7769 - - - + 340 + 7768 - - - + 339 ++ 7764 - - - + + 338 7684 - - - + + 103 + 7691 - - - 44 ++ + ++ 7650 + - - 55 +++ ++ + 7722 - - - 57 - - - 7725 - - - 49 - - - 2682 + - - + + 94 + 2741 + - - - 136 - - 2708 + - - - 134 - - 3122 - - - - 137 - - 2752 + - - - 135 - - 2745 + - - 159 +++ ++ +++ 12964 - 5%(+) 20%(++) 161 - - - 2794 - 10%(++) 10%(+++) ++ ++ 152 + 2746 + - - + + 153 ++ 7755 ++ - - + + 156 + 178 - - - 179 - - - 181 - - - 182 - - - - - - 185
51 Bảng 4.5. Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phƣơng pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC Trung bình có ý Lượng mẫu Nhóm giống nhau nghĩa nhỏ nhất Loại xét Tôm Tôm Tôm Tôm Tôm Tôm nghiệm thương thương thương post- post- post- phẩm phẩm phẩm larvae larvae larvae PCR 25 20 0,84 1,59167 X X Mô học 25 30 0,2 1,46667 X X IHC 25 30 0,28 1,36667 X X Khác biệt +/- Giới hạn So sánh đối chiếu Tôm post-larvae Tôm thương phẩm PCR – Mô học 0,64 0,50112 * 0,125 0,25026 PCR – IHC 0,56 0,50112 * 0,225 0,25026 Mô học - IHC -0,08 0,50112 * 0,1 0,25026 Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê A. Trên đối tượng tôm post-larvae: Bảng kết quả (Bảng 4.2) cho thấy không có sự khác biệt về khả năng phát hiện tế bào nhiễm virus giữa phương pháp IHC và phương pháp mô học nhưng sự khác biệt này lại rất rõ nét giữa phương pháp PCR và 2 phương pháp còn lại. Như vậy, độ nhạy của PCR là khá cao và độ nhạy của IHC và mô học khác nhau không đáng kể. Theo quan sát dưới kính hiển vi, các mẫu nhuộm IHC biểu hiện nhân nhiễm WSSV rất rõ ràng, có thể nhận biết ngay ở vật kính 10x, nhưng với phương pháp Mô học cần phải tập trung và tìm thật kĩ mới nhận biết được những tế bào nhiễm. Trên 2 mẫu 12964 và 2794, IHC và mô học đều cho kết quả dương tính với tỷ lệ cảm nhiễm thấp và cường độ cảm nhiễm khá cao nhưng PCR lại cho kết quả âm tính. Khi xét nghiệm bằng IHC, cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm của 2 mẫu này cao hơn xét nghiệm bằng Mô học. Có 10 mẫu (7661, 7536, 7650, 2682, 2741, 2708, 2752, 2745,
52 2746, 7755) PCR cho kết quả dương tính nhưng IHC và Mô h ọc đều cho kết quả âm tính. Nguyên nhân: Phương pháp PCR: - Tôm post-larvae do chưa phải tuổi mẫn cảm nên thường nhiễm WSSV ở dạng tiềm ẩn, lượng virus trong mẫu rất ít, chỉ có phương pháp PCR với khả năng khuyếch đại một lượng rất nhỏ DNA của virus mới nhận biết được. Hơn nữa, trong quá trình xét nghiệm bằng PCR mẫu được đồng nhất nên tất các các bộ phận của cá thể tôm trong mẫu đều được kiểm tra, lượng tôm trong mẫu xét nghiệm có thể nhiều nên khả năng phát hiện mầm bệnh cao hơn. Vì vậy trên đối tượng tôm post-larvae phương pháp PCR có độ nhạy cao nhất (phát hiện ra 10 mẫu dương tính trong khi Mô học và IHC không thể phát hiện được). Tuy nhiên, tính chính xác của phương pháp PCR lại phụ thuộc rất nhiều vào tính đặc hiệu của primer và nhiều yếu tố khách quan và chủ quan khác như chất lượng hoá chất, thao tác của người làm thí nghiệm … Độ nhạy và tính chuyên biệt cao của phương pháp PCR vừa là ưu điểm vừa là trở ngại của phương pháp này vì có thể cho kết quả âm tính giả do chất lượng hoá chất, primer giảm trong quá trình bảo quản …hay do mầm bệnh mới xuất hiện, lượng tôm nhiễm ít, ngẫu nhiên không có cá thể bệnh trong số tôm làm xét nghiệm. Phương pháp mô học và IHC: Khả năng phát hiện tế bào nhiễm phụ thuộc rất - nhiều vào quá trình đúc mẫu (lượng tôm được vùi trong nến nhiều hay ít, các cá thể được đúc có nhiễm virus hay không, cơ quan đích của virus có nằm gần mặt cắt hay không), chất lượng lát cắt (cắt có đúng vị trí có nhiều mẫu hay không, cơ quan đích của virus có nằm trên lát cắt hay không). Phương pháp IHC (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) không bằng PCR về độ nhạy (vì không thể khuyếch đại DNA virus) nên không phát hiện mầm bệnh trên 10 mẫu tôm post-larvae. Tuy nhiên, IHC nhờ khả năng hoạt động tốt của kháng thể sơ cấp, kháng thể thứ cấp và HRP nên nếu có mầm bệnh virus với một lượng có ý nghĩa thì chắc chắn sẽ có tín hiệu màu (kháng thể thứ cấp là kháng thể đa dòng sẽ phản ứng với lượng lớn epitope trên kháng thể sơ cấp, từ đó khuyếch đại tín hiệu virus vì nhiều
53 phân tử enzyme được gắn trên một vị trí đích). Với IHC người đọc mẫu dễ d àng nhận biết tế bào nhiễm trên mang và cả trên những cơ quan khác như các phụ bộ gần mang, dạ dày, ruột, biểu mô, cơ quan lymphoid (Hình 4.3, 4.4) do đó phát hiện nhiều cá thể nhiễm và nhiều tế bào nhiễm hơn Mô học (mẫu 12964 và 2794). Phương pháp mô học truyền thống: Tất cả các tế bào nhiễm mầm bệnh đều có những biểu hiện khác biệt (với WSSV, tín hiệu đặc trưng là nhân trương to, t ròn và bắt màu tím đậm) (Hình 4.4) nhưng nếu lượng virus nhiễm ít hay ở dạng tiềm ẩn (trên tôm post-larvae) và tế bào nhiễm chưa có biểu hiện đặc trưng rõ ràng thì rất khó xác định chính xác mầm bệnh (có thể nhầm lần với mầm bệnh khác). Ngoài mang là cơ quan đích chủ yếu của WSSV thì mô học truyền thống khó phát hiện được mầm bệnh ở những cơ quan khác. Vì vậy, mô học kém hơn PCR và IHC về độ nhạy. Độ nhạy của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào khả năng và kinh nghiệm của người đọc mẫu. B.Trên đối tượng tôm thương phẩm: Bảng kết quả (Bảng 4.2) cho thấy trên đối tượng tôm thương phẩm, khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của cả 3 phương pháp là như nhau. Biểu hiện của tế bào nhiễm khi kiểm nghiệm bằng mô học truyền thống và IHC khá rõ ràng. Với IHC, người đọc mẫu có thể dễ dàng phát hiện tế bào nhiễm ngay cả ở vật kính 10x nhờ biểu hiện màu sắc (nâu) khác biệt rõ với màu nền (tím). Với Mô học truyền thống, phải tập trung hơn mới nhận ra tế bào nhiễm nhưng nhờ lượng tế bào nhiễm nhiều, hình dạng đặc trưng nên cũng không quá khó để nhận ra. Nguyên nhân: Tôm sú thương phẩm khi nhiễm WSSV thường mang một lượng lớn virus do ở tuổi mẫn cảm. Vì vậy lượng tế bào nhiễm nhiều và biểu hiện rất rõ trên mang tôm lớn nên rất dễ nhận biết với PCR, mô học và IHC, khó có sự khác biệt do yếu tố con người. Với tôm sú thương phẩm, mẫu được lấy chủ yếu ở mang và gan tụy. Mang và gan tụy của mỗi cá thể được chia làm hai, mỗi phần được cho vào cồn (PCR) hoặc Davidson (mô học và IHC) để thực hiện xét nghiệm nên không có sự khác biệt do cá thể.
54 A1 A2 B1 B2 C1 C2 Hình 4.3. Tế bào nhiễm WSSV trên các cơ quan khác nhau của tôm sau khi nhuộm IHC Hình A1, A2: Tế bào nhiễm WSSV trên biểu mô tôm thương phẩm (100x), (400x). Hình B1, B2: Tế bào nhiễm WSSV trên phụ bộ tôm post-larvae (100x), (400x). Hình C1, C2: Tế bào nhiễm WSSV trên dạ dày tôm thương phẩm (100x), (400x).
55 A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 Hình 4.4. Tế bào nhiễm WSSV sau khi nhuộm bằng IHC và Mô học truyền thống (Hình A và hình B chụp cùng một vị trí trên mẫu 98. Hình C và hình D chụp cùng một vị trí trên mẫu 12964)
56 A1, A2, A3: Mô học–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm thương phẩm. Hình A1(100x): Nhân tế bào nhiễm bắt màu hồng tím đậm, nhưng hơi lẫn với - màu nền. Hình A2, A3 (400x, 1000x): Có thể nhận thấy rõ nhân tế bào nhiễm trương to, - tròn, màu sắc rõ, đẹp. B1, B2, B3: IHC–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm thương phẩm. Hình B1(100x): Tế bào bắt màu nâu đậm, khác biệt rất rõ với màu nền. - Hình B2, B3 (400x, 1000x): Nhìn rõ hình dạng tế bào nhiễm. - C1, C2, C3: Mô học–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm post-larvae. Hình C1 (100x): Màu nền khá đậm nên khá khó nhận thấy tế bào nhiễm. - Hình C2, C3 (400x, 1000x): Tế bào nhiễm bắt màu rất đẹp, hình dạng đặc trưng - và điển hình. Các tế bào nền rõ ràng D1, D2: IHC–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm post-larvae (100x), (400x). Hình D1: Màu nền khá đậm, tế bào nhiễm có màu nâu nên dễ lẫn với màu nền. - Hình D2, D3: Nhân tế bào nhiễm bắt màu rất đẹp, sắc nét. -
57 4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC. Bảng 4.6. So sánh ƣu khuyết điểm của 3 phƣơng pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC Phƣơng pháp Mô học truyền PCR IHC thống Yếu tố - Độ nhạy và tính - Độ chính xác khá - Độ chính xác và tính chuyên biệt cao. đặc hiệu cao, độ nhạy cao. khá cao. - Ổn định. - Ổn định - Ổn định. - Kiểm tra được nhiều cá thể trong mẫu và - Ít bị tạp nhiễm, - Ít bị tạp nhiễm, trên toàn bộ cá thể. không yêu cầu khắt không yêu cầu khắt - Thời gian thực hiện khe trong thao tác khe trong thao tác. ngắn (vài giờ). - Ít tiếp xúc với hoá - Ít tiếp xúc với hoá - Quy trình thực hiện chất độc hại. chất độc hại. đơn giản - Quy trình thực hiện - Quy trình thực hiện Ƣu điểm - Độ tinh sạch và chất đơn giản đơn giản. lượng của mẫu thí nghiệm không cần cao. - Có khả năng định - Có khả năng định lượng. lượng. - Giá xét nghiệm thấp - Giá xét nghiệm vừa (30.000 đ/mẫu) phải (60.000đ/mẫu) - Hoá chất rẻ tiền, bảo - Vật liệu nhuộm dễ quản dễ dàng, ít bị bảo quản, ít biến tính. biến tính - Có thể xét nghiệm - Kết quả rất rõ ràng nhiều bệnh trên cùng nên không phụ thuộc một mẫu nhiều vào yếu tố con người (khả năng của người đọc mẫu).
58 Phƣơng pháp Mô học truyền PCR IHC thống Yếu tố - Tính chính xác và độ - Chỉ kiểm tra được - Chỉ kiểm tra được tin cậy không cao vì một lượng nhỏ cá thể một lượng nhỏ cá thể rất dễ bị tạp nhiễm. trong mẫu và trên một trong mẫu và trên một số cơ quan nhất định. số cơ quan nhất định. - Hoá chất và thiết bị - Thời gian thực hiện - Thời gian thực hiện đắt tiền. dài (khoảng 15 giờ). dài (khoảng 19 giờ). - Giá xét nghiệm cao - Không chuyên biệt. - Chỉ xét nghiệm được (140000đ/mẫu) một bệnh. Khuyết điểm - Hoá chất dễ biến tính - Phụ thuộc rất nhiều nên yêu cầu bảo quản vào yếu tố con người khắt khe. (khả năng đọc mẫu). - Đòi hỏi cẩn thận tuyệt đối trong thao tác. - Phải tiếp xúc với hoá chất độc. - Phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng hoá chất.
59 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận  So sánh qui trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb và 3 nồng độ DAB cho thấy: Có sự khác biệt giữa 3 nồng độ mAb 1X; 1,5X; 2X với nồng độ 0,5 X nhưng lại - không có sự khác biệt lớn giữa 3 nồng độ 1X; 1,5X và 2X về cường độ cảm nhiễm, cường độ bắt màu và độ sắc nét. Như vậy khả năng phát hiện tế bào nhiễm WSSV cao với nồng độ kháng thể 1X; 1,5X và 2X. Với nồng độ DAB 1X, cường độ bắt màu và độ sắc nét của tế bào nhiễm rất - kém. Với nồng độ 1,5X và 2X, tế bào nhiễm bắt màu nâu đặc trưng, rõ nét.  So sánh phương pháp IHC với phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả cho thấy: Trên đối tượng tôm post-larvae, phương pháp PCR tỏ ra có ưu thế hơn phương - pháp IHC và Mô học về khả năng phát hiện mầm bệnh. Như vậy PCR có độ nhạy cao hơn (vì trên tôm post-larvae nhiễm virus, lượng virus thường thấp). Trên đối tượng tôm thương phẩm, khả năng phát hiện mầm bệnh là như nhau - giữa 3 phương pháp (vì trên tôm thương phẩm nhiễm virus, lượng virus thường cao). Tính ổn định của IHC khá cao. - Tuỳ đối tượng, yêu cầu và mục tiêu xét nghiệm mà mỗi loại xét nghiệm có - những ưu điểm và khuyết điểm riêng. 5.2. Đề nghị  Cải thiện quy trình nhuộm IHC của Đại học Gent như sau: Chuyển nồng độ DAB từ 0.5 mg/l sang 0.75 mg/l, lượng H2O2 là 9H2O2: 10 - Tris buffer. Ngâm lam trong DAB trong 4 phút. -
60 Ở giai đoạn nhuộm Hematoxylin, nên nhúng lame và dung dịch 2 lần, mỗi lần 3 - giây. Sau đó rửa lại bằng cách nhúng vào nước cất 3 lần. Điều này rất quan trọng vì nếu màu hematoxylin quá đậm thì khó có thể nhìn thấy màu nâu của DAB dẫn đến dễ nhầm lẫn tế bào nhiễm thành không nhiễm.  Ứng dụng phương pháp IHC trong các xét nghiệm phục vụ nghiên cứu khoa học và phục vụ người nuôi tôm.  Tiếp tục nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh đốm trắng bằng phương pháp IHC.  Bổ sung một số thiết bị nhằm tăng hiệu quả phương pháp IHC như: Thiết bị giúp trải đều một lượng nhỏ dung dịch (mAb, HRP…) lên mẫu, bàn ấm có độ phẳng và độ cân bằng cao.  Tiếp tục nghiên cứu tự động hoá quy trình nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện giá thành để có thể ứng dụng phương pháp IHC rộng rãi phục vụ người nuôi tôm.  Kết hợp xét nghiệm IHC và PCR trên cùng một mẫu để tăng độ chính xác và độ nhạy của xét nghiệm.
61 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Minh Anh, 1989. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật nuôi tôm he. Nhà xuất bản 1. TP HCM; 394 trang. Trần Thị Hoàng Dung, 2001. Ứng dụng phương pháp Nested PCR điều tra bệnh 2. đốm trắng trên tôm sú ở một số tỉnh phía nam. Khoá luận tốt nghiệp. Trường Đai Học Nông Lâm TP HCM; 56 trang. Kim Oanh, 2005. Ứng dụng khoa học công nghệ vào nuôi trồng thuỷ sản-Phỏng 3. vấn ông Nguyễn việt Thắng, Thứ trưởng Bộ Thuỷ Sản. Vietnam economy, Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 6/1/2005. http://www.vneconomy.com.vn/vie/index.php?param=article&catid=09&id=050 106095231 Nguyễn Thanh Phương, 2002. Chuyên đề 2: Nuôi tôm biển. Giáo trình kĩ thuật 4. nuôi thủy sản ven biển nhiệt đới (tropical coastal aquaculture). ĐH Cần Thơ http://www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/daotaotuxa/1- coastal/chuong2.htm#2-1 Nguyễn Văn Hảo, Đỗ Quang Tiền Vương, Trình Trung Phi, 1998. Mô hình nuôi 5. tôm sú công nghiệp quy mô nông hộ và trang trại ở ĐBSCL. Báo Cáo Khoa Học, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. Phan Lương Tâm, 1994. Khảo sát nguyên nhân gây chết tôm khu vực phía Nam. 6. Báo Cáo Khoa Học, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. Vũ Thế Trụ, 1995. Thiết lập và điều hành trại sản xuất tôm giống tại Việt Nam . 7. NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh. Tr 23 – 25. Lê Xân, 1996. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và cơ sở khoa học của công 8. nghệ nuôi tôm sú ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Luận án phó tiến sĩ khoa học, Viện Nghiên Cứu Hải Sản thuộc bộ thủy sản Hải Phòng; trang: 14 – 30. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 9. Adams A., and Thompson K., 1990. Development of an ELISA for the detection of Aeromonas salmonicida in fish tissue. Journal of Aquatic Animal Health 2: 281-288. 10. Adams A., Thompson K.D., Morris D, Farias C. and Chen S.C., 1995. Development and use of monoclonal antibody probes for immunohistochemistry, ELISA and IFAT to detect bacterial and parasitic fish pathogens. Journal of Fish and Shellfish Immunology 5: 537-547.
62 11. Adams A., Thompson K.D., Ewan H.M., Chen S.-C. and Richards R.H., 1996. Development of monoclonal antibodies to Mycobacterium spp. isolated from Chevron snakehead and Siamese fighting fish. Journal of Aquatic Animal Health 8: 208-215. 12. Alday-Sanz V., Rodger H., Turnbull T., Adams A. and Richards R.H., 1994. Immunohistochemical identification of Pickirickettsia salmonis in Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases 17: 189-192. 13. Anil T.M., Shankar K.M., Mohan C.V., 2002. Monoclonal antibodies developed for sensitive detection and comparison of white spot syndrome virus isolates in India. Disease of Aquatic Organisms 51:67-75. 14. Apud E.D., 1984. Extesive and semi-extensive of Sugpo (Penaeus monodon). In: Prawn Industry Development in the Philippines Proceed of the National P.I.D and Workshop, 10 – 13 April SEAFDEC, Aquaculture Depaterment, Iloilo City, 55 – 73. 15. Bakopoulos V., Adams A. and Richards R.H., 1997. The production and characterisation of monoclonal antibodies against the fish pathogen Pasteurella piscicida. Journal of Fish Diseases 20: 307-315. 16. Barnes R., 1987. Invertebrate Zoology. Orlando, Florida: Dryden Press. 17. Bauman R.H., Jamandro D.R., 1990. A practicle method for determining quality of Penaeus monodon Fabricus fry for stocking in grow out ponds. Technical and economic aspect of shrimp farming. Proceeding of Aquatic 90 Conference, INFORFISH Pub. Kualalumpure, Malaysia. p. 124 – 137. 18. Boenisch T., Farmilo A.J., Stead R.H., Key M., Welcher R., Harvey R., and Atwood K.N., 2002. Handbook of Immunochemical Staining Methods. 3rd edition, Carpinteria, California, USA. 65p. 19. Caleb M.C, 2004. White Spot Syndrome Virus – The economic, environmental and technical implications on the development of Latin America shrimp farming. Master of Art and Law thesis. The Fletcher School, Tufts University. 20. Chaivisuchangkura P. Tangkhabuanbutra J., Longyang S., Sithigorngul W., Rukpartanporn S., Menasveta P., Sithigorngul P., 2004. Monoclonal antibodies against a truncated viral envelope protein (VP28) can detect white spot syndrom virus (WSSV) infections in shrimp. Science Asia 30: 359-363. 21. Chamberlain G.W., 1994. Taura syndrome and China collapse chaused by new shrimp viruses. World Aquaculture 25: 22 – 25.
63 22. Chang P.S., Lo C.F., Wang Y.C. and Kou G.H., 1996. Identificaion of white spot syndrom associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimp Penaeus monodon by in-situ hybrilization. Disease of Aquatic Organisms 27: 131 – 139. 23. Chanratchakool P., Turnbull J.F., Funge-Smith S.J., MacRae I.H., and Limsuwan C., 1995. Health management in shrimp pond. 3rd edition, Aquatic Animal Health Research Insitute, Department of Fisheries, Kasetsart University Campus, Bangkok. 80p. 24. Chen L.L., Lo C.F., Chiu Y.L., Chang C.F., Kou G.H., 2000. Natural and experimental infection of white spot syndrome virus (WSSV) in benthic larvae of mud crab Scylla serrata. Disease of Aquatic Organisms 40: 157 – 161 25. Chen L.L., Leu J.H., Huang C.J., Chou C.M., Chen S.M., Wang C.H., Lo C.F. and Kou G.H., 2002. Identification of a nucleocapsid protein (VP35) gene of shrimp white spot syndrome virus and characterization of the motif important for targeting VP35 to the nuclei of transfected insect cells. Virology 293: 44-53. 26. Chiu Y.N., 1992. Water quality management for intensive prawn ponds. Technical consideration for the management and operation of intensive prawn farms (Chiu Y.N., Santos L.M. and Juillano R.O.). CIS Aquaculture Soc. Iloilo, Philippines. p. 122 – 128. 27. CSIRO, 2002. Impact of Infectious Agents on Farming and Food Production: Global Impact of Newly Emergent Pathogens on Shrimp Farm Production. http://ftp.cdc.gov/pub/infectious_diseases/iceid/2002/pdf/walker.pdf 28. Coons A.H., Creech H.J. and Jones R.N., 1941. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 47: 200 – 202. 29. Dieu B.T.M., Marks H., Siebenga J.J., Goldbach R.W., Zuidema D., Duong T.P. 3 and Vlak J.M., 2004. Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam. Journal of General Virology 85: 3607-3618. 30. Durand S., Lightner D. V., Redman R. M. and Bonami J. R., 1997. Ultrastructure and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV). Disease of Aquatic Organisms 29: 205–211. 31. Faulk W.P., Taylor G.M., 1971. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry 8: 1081 – 1083 32. Flegel T.W., 1997. Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand. World Journal of Microbiology and Biotechnology 13: 433 – 442.
64 35. Flegel T.W., 2000. Overview of PCR probes for shrimp diseases of Penaeus monodon. Molecular Diagnosis Training Workshop for Detection of WSSV in Vietnam, 2000. 36. Francki R.I. B., Fauquet C. M., Knudson D.L. and Brown F., 1991. Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch. Virol. 1991(Suppl. 2):1-450. 37. Hall D.N.F., 1962. Observation on the taxonnomy and biology of some Indo – West Pacific Penaeidae (Crustacea, Decapoda). Colo. Off. Fish. Pub. Lond 17: 1 – 229. 38. Hayat M.A., 2004. Handbook of Immunohistochemistry and in Situ Hybridization of Human Carcinomas: Molecular Genetics; Lung and Breast Carcinomas. Elsevier Science and Technology. 400 p. 39. Hiney, M.P. and Smith, P.R., 1998. Validation of polymerase chain reaction - based techniques for proxy detection of bacterial fish pathogens: framework, problems and possible solutions for environmental applications. Aquaculture 162, 41-68. 40. Holthuis L. B., 1980. FAO species catalogue. Shrimps and prawns of the world: an annotated catalogue of species of interest to fisheries. FAO Fish. Synop. 125(1): 1–261. 41. Hőstein T., 2000. Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. Office international des Epizooties. p. 257 - 260 42. Huang J., Song X.L., Yu J. and Yang C.H., 1994. Baculoviral hypodermal and hematopoietic necrosis-pathology of the shrimp explosive epidemic disease. Yellow Sea Fishery Research Insitute, Quingdao, PR China. 43. Inouye K., Miwa S., Oseko N., Nakano H., Kimura T., Momoyama K. and Hikaora M., 1994. Mass mortality of cultured kuruma shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993 – electron-microcospic evidence of the causative virus. Fish Pathology 29: 149 – 158. 44. Inouye K., 1996. Occurence of fish diseases associated with seed improtant – A new virus infection (RV-PJ) of Kuruma shrimp. Nippon Suisan Gakkaishi 62: 831 – 832. 45. Kou G.H., Peng S.E., Chiu Y.L. and Lo L.F., 1998. Tissue ditribution of white spot syndrom virus (WSSV) in shrimp and crab. Advanced in Shrimp Biotechnology 1998: 267 – 276. 46. Kungvankji P. and Chua T.E., 1986. Shrimp culture: pond design operation and management FAO/ NACA. Training manual 2: 56 – 57.
65 47. Lavilla-Pitogo C.R., 1996. Shrimp health research in the Asia-Pacific: present status and future directives. In Health Management in Asian Aquaculture. Proceedings of the Regional Expert Consultation on Aquaculture Health Management in Asia and the Pacific. R.P. Subasinghe, J.R.Arthur & M. Shariff (eds.), p. 41–50. FAO Fisheries Technical Paper 360. Rome, FAO. 142 p. 48. Leu J.H., Tsai J.M., Wang H.C., Wang A.H.J., Wang C.H., Kou G.H., and Lo C.F., 2005. The Unique Stacked Rings in the Nucleocapsid of the White Spot Syndrome Virus Virion Are Formed by the Major Structural Protein VP664, the Largest Viral Structural Protein Ever Found. Journal of Virology 79: 140-149. 49. Lightner D.V., 1996 (Ed.). A handbook of shrimp pathology ang diagnostic procedures for diseases of cultured penaeid shrimp. World aquaculture society, Baton rouge, LA, USA 50. Lightner D.V., Redman R.M., Poulos B.T., Nunan L.M., Mari J.L. and Hasson K.W., 1997. Risk of spread of penaeid shrimp viruses in the Americas by the international movement of live and frozen shrimp. Revue Scientifique et Technique de I’Office International des Epizooties 16: 146 – 160. 51. Lightner D.V. and Redman R.M., 1998. Shrimp diseases and current diagnostic methods.Aquaculture, 164: 201-220. 52. Limsuwan C., 1997. Reducing the effects of White - Spot Baculovirus using PCR Screening and Stressors. The AAHRI Newsletter, Volume 6 Number 1, July 1997. 53. Liu W, Wang YT, Tian DS, Yin ZC, Kwang J., 2002. Detection of white spot syndrome virus (WSSV) of shrimp by means of monoclonal antibodies (MAbs) specific to an envelope protein (28 kDa). Disease of Aquatic Organisms 49:11-8 54. Lo C.F., Leu J.H., Ho C.H.,Chen C.H., Peng S.E., Chen Y.T., Chou C.M., Yeh Y.P., Huang C.J., Chou Y.H., Wang C.H. and Kou G.H., 1996. Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimp using polymerase chain reaction. Diseases of Aquatic Organisms 25: 133 – 141. 55. Lo C.F., Kou G.H., 1998. Virus-associated white spot syndrome of shrimp in Taiwan: a review. Fish Pathology 33: 365 – 371. 56. Lo C.F., Chang Y.S., Chenm C.T. and Kou, G.H., 1998. PCR Monitoring Cultured Shrimp for White Spot Syndrom Virus (WSSV) Infection, Growout Pond In Proceeding to the Special Session on Shrimp Biotechnology 5th Asian Fisheries Forum (Flegel, T., ed., phương pháp. 281 – 286 BIOTEC, Chiengmai, Thailand) 57. Marks H., Goldbach R.W., Vlak J. M. and van Hulten M.C.W. , 2003. Genetic variation among isolates of White spot syndrome virus. Archives of Virology. Springer Verlag Wien 149: 673 – 697.
66 58. Mason D.Y., Sammons R., 1978. Alkaline phosphatase and peroxidase for double immunoenzymatic labelling of cellular constituents. J. Clin. Pathol. 31: 454 – 460. 59. Mayo M.A., 2002. A summary of taxonomy changes recently approved by ICTV. Arch Virol 147/8. 60. Morris D., Adams A. and Richards R.H., 1997. Studies on the PKX myxosporean in rainbow trout via immunohistochemistry and immunogold microscopy. Journal of Aquatic Animal Health 8: 219-235. 61. Murthy H. S., 1997. The collapse of shrimp farming in India: an analysis. INFOFISH International 1/1997. 62. Nadala E.C., Jr., Tapay L.M., Cao S.R. and Loh P.C., 1997. Detection of yellowhead virus and Chinese baculovirus in penaeid shrimp by the Western blot technique. Journal of Virology Methods 69: 39 – 44. 63. Nadala E.C.B. and Loh P.C., 2000. Dot-blot nitrocellulose enzyme immunoassays for the detection of white-spot virus and yellowhead virus of penaeid shrimp. Journal of Virology Methods 84: 175 – 179. 64. Nakane P.K., Pierce G.B., 1966. Enzyme-labelled antibodies: preparation and application to the localization of antigens. J. Histochem. Cytochem. 14: 929 – 931. 65. Nakano H., Koube H., Umezawa S., Momoyama K., Hiraoka M., Inouye K. and Oseko N., 1994. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, Penaeus japonicus, in Japan in 1993 – epizootiological survey and infection trials. Fish pathology 29: 135 – 139. 66. OIE, 2003. Taura Syndrome. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2003 67. Owens L., 1993. Description of the first haemocytic rod-shaped virus from a penaeid prawn. Disease of Aquatic Organisms 16: 217–221. 68. Phianphak W, Rengpipat S, Rukpratanporn S, Longyant S, Chaivisuthangkura P, Sithigorngul W, Sithigorngul P., 2005. Production of monoclonal antibodies for detection of Vibrio harveyi. Disease of Aquatic Organisms. 63(2-3):161-8. 69. Poulos B.T., Pantoja C.R., Bradley-Dunlop D., Aguilar J., Lightner D.V., 2001. Development and application of monoclonal antibodies for the detection of white spot syndrome virus of penaeid shrimp.Disease of Aquatic Organisms. 47:13-23 70. Rajendran K.V., Vijayan K.K., Santiago T.C., and Krol R.M., 1999. Experimental host range and Histopthology of White Spot Syndrome Virus