ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) (part 1)

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:34

Thêm vào BST

Báo xấu

130
lượt xem 22
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ngày nay việc khai thác các nguồn lợi thủy sản biển đã làm cho trữ lượng của các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ngày càng trở nên cạn kiệt. Do đó nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) (part 1)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 ii
LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn và giải đáp những khó khăn, vƣớng mắc trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. CN. Phạm Văn Điền và CN. Hứa Đức Quới đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này. TS. Lý Thị Thanh Loan và ThS. Đinh Thị Thủy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại Viện. Các anh chị làm việc tại phòng Mô Học, phòng Sinh Học Phân Tử và phòng Chất Lƣợng Nƣớc tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Cô Linh, chị Lan thuộc Chi Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Phú Yên đã giúp tôi thu mẫu hoàn thành đề tài. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Thành phố HCM, tháng 9 năm 2005 Sinh viên Phạm Thị Tuyết Anh iii
TÓM TẮT PHẠM THỊ TUYẾT ANH, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 9 – 2005. ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei). Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO. Đề tài đƣợc thực hiện từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005, tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, trên hai đối tƣợng là TSV trên P. vannamei (Postlarvae và thƣơng phẩm) và WSSV trên P. monodon (Postlarvae và thƣơng phẩm). Hai loại virus này có mức độ nguy hiểm và khả năng tạo dịch bệnh lớn ở tôm nuôi tại Việt Nam. Do đó, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) hay lai tại chỗ nhằm mục tiêu phát hiện nhanh và chính xác các mẫu tôm nhiễm bệnh Taura và đốm trắng, để có biện pháp xử lý kịp thời, góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát hai loại dịch bệnh này. Đề tài gồm các thí nghiệm sau: 1. Các thí nghiệm trên P. vannamei Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán TSV trên P. vannamei. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán TSV trên P. vannamei. Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ƣu, thực hiện trên 5 nghiệm thức. Kết quả nhiệt độ biến tính mẫu theo nghiệm thức thứ ba (probe đƣợc biến tính trƣớc ở 950C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 40C; khi lai thì cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên mẫu và thực hiện biến tính mẫu ở 700C trong 6 phút, sau đó ủ mẫu qua đêm ở 420C) là tốt nhất trên postlarvae và tôm thƣơng phẩm.  Thí nghiệm tìm thời gian cắt tối ƣu với Proteinase K, thực hiện trên 5 nghiệm thức: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút. Kết quả thời gian cắt với Proteinase K tối ƣu trên postlarvae là 15 phút và trên tôm thƣơng phẩm là 17 phút.  Thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp, thực hiện trên 3 nghiệm thức: 100µl, 75µl và 50µl. Kết quả thể tích dung dịch lai thích hợp nhất trên tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm là 75µl. 2. Các thí nghiệm trên P. monodon Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán WSSV trên P. monodon. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy iv
rằng phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán WSSV trên P. monodon. Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm thay đổi một số hóa chất thông dụng nhƣ cồn tuyệt đối, xylene và paraformaldehyde do Việt Nam và Trung Quốc sản xuất, nhằm giảm chi phí chẩn đoán. Kết quả thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt so với thí nghiệm dùng các hóa chất nhƣ bộ kit đã khuyến cáo sử dụng.  Thí nghiệm dùng quy trình xử lý mẫu nhanh: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm, kết quả lai thực hiện theo quy trình này không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.  Thí nghiệm biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.  Thí nghiệm kết hợp xử lý mẫu nhanh với biến tính probe và mẫu đồng thời trên lame: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn. 3. Thí nghiệm so sánh phƣơng pháp ISH với mô học và PCR Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên P. vannamei (postlarvae và tôm thƣơng phẩm) và P. monodon (postlarvae và tôm thƣơng phẩm). Kết quả thí nghiệm cho thấy phƣơng pháp ISH có độ ổn định, độ chính xác và nhạy hơn mô học và PCR. Từ các kết quả thực nghiệm nhƣ trên, chúng tôi đã đƣa ra quy trình ISH có độ nhạy, độ ổn định, độ chính xác cao và thời gian chẩn đoán nhanh, đáp ứng đƣợc việc kiểm tra các mầm bệnh do WSSV và TSV gây ra trên tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong các hệ thống nuôi tôm ở Việt Nam. v
MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa ............................................................................................................................ i Trang tựa............................................................................................................................ ii Lời cảm tạ .......................................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................................... iv Mục lục .............................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. xi Danh sách các hình và các sơ đồ ....................................................................................... xii Danh sách các bảng ........................................................................................................... xiv CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU ............................................................................................. 1 I.1 Đặt vấn đề..................................................................................................................... 1 I.2 Mục tiêu đề tài .............................................................................................................. 2 I.3 Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................ 2 I.4 Nội dung của đề tài ...................................................................................................... 2 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ................................................................................. 3 II.1.1 Hiện trạng chung ...................................................................................................... 3 II.1.2 Các hình thức nuôi ................................................................................................... 3 II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới ..................................................................... 3 II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam ................................................................................ 4 II.2.1 Hiện trạng chung ...................................................................................................... 4 II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang đƣợc áp dụng .............................................................. 5 II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam .................................................................... 5 II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng ................................. 5 II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P. monodon và tôm thẻ chân trắng P. vannamei.......... 5 II.3.2 Đặc điểm phân bố của tôm sú và thẻ chân trắng ..................................................... 6 vi
II.3.2.1 Đặc điểm phân bố của tôm sú ............................................................................... 6 II.3.2.2 Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng ............................................................ 7 II.3.3 Vòng đời phát triển của tôm sú và thẻ chân trắng ................................................... 7 II.3.3.1 Vòng đời phát triển của tôm sú ............................................................................. 7 II.3.3.2 Vòng đời phát triển của tôm thẻ chân trắng.......................................................... 7 II.3.4 Dinh dƣỡng .............................................................................................................. 7 II.3.4.1 Dinh dƣỡng của tôm sú ......................................................................................... 7 II.3.4.2 Dinh dƣỡng của tôm thẻ chân trắng ...................................................................... 8 II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú và thẻ chân trắng phát triển ................... 8 II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) và bệnh Taura (Taura syndrome TS) 8 II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD .............................................................................................. 8 II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................................................ 8 II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................................... 11 II.4.1.3 Lịch sử phân bố và lan truyền bệnh ...................................................................... 11 II.4.1.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ............................................................................... 12 II.4.1.5 Phòng bệnh ........................................................................................................... 12 II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) ................................................................ 12 II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................................................ 12 II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................................... 13 II.4.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh ................................................................................... 14 II.4.2.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ............................................................................... 14 II.4.2.5 Phòng và trị bệnh .................................................................................................. 14 II.5 PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ......................................................... 14 II.5.1 Sơ lƣợc về phƣơng pháp In situ hybridization......................................................... 14 II.5.2 Khái niệm về sự lai phân tử .................................................................................... 15 II.5.3 Cơ sở của sự lai phân tử ........................................................................................... 16 II.5.3.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA ......................................................... 16 II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA ..................................... 16 II.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự lai phân tử ................................................................. 17 vii
II.5.5 Probe ........................................................................................................................ 17 II.5.5.1 Khái niệm .............................................................................................................. 17 II.5.5.2 Các loại probe ............................................................................................ 18 II.5.5.3 Các phƣơng pháp đánh dấu probe ............................................................. 18 II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe và cách phát hiện các phân tử lai ........................... 19 II.5.6 Các phƣơng pháp lai tại chỗ ISH ............................................................................. 23 II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc ................................................................................................. 23 II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể .......................................................................................... 23 II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô ............................................................................................ 24 II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH ...................................................................................... 25 II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản.............................. 25 II.5.8.1 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng và Taura .................................. 25 II.5.8.2 Ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản .............................................................................................................................. 26 II.5.9 Xu hƣớng phát triển của phƣơng pháp này.............................................................. 26 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ...... 27 III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm .............................................................................. 27 III.2 Vật liệu sinh học ........................................................................................................ 27 III.3 Hóa chất thí nghiệm................................................................................................... 27 III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ ................................. 27 III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng không có trong bộ kit chẩn đoán ................................... 28 III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .................................................................................. 28 III.4.1 Thiết bị thí nghiệm ................................................................................................. 28 III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm ................................................................................................ 29 III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit ................................... 29 III.5.1 Chuẩn bị hóa chất ................................................................................................... 29 III.5.2 Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................... 30 III.5.2.1 Cố định mẫu ........................................................................................................ 30 viii
III.5.2.2 Cách xử lý mẫu .................................................................................................... 30 III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin ....................................................................................... 31 III.5.2.4 Cắt mẫu ................................................................................................................ 31 III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit ............................................................................. 31 III.5.3.1 Ngày thứ nhất ...................................................................................................... 31 III.5.3.2 Ngày thứ hai ........................................................................................................ 32 III.6 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 34 III.6.1 Phƣơng pháp thu mẫu ............................................................................................. 34 III.6.2 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................... 34 III.6.2.1 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei ............................................................................................................. 35 III.6.2.2 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú Penaeus monodon ............................................................................................................................ 36 III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phƣơng pháp ISH với mô học và PCR............... 39 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 41 IV.1 Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P. vannamei ........................................................... 41 IV.1.1Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phƣơng pháp ISH ............. 41 IV.1.2 Kết quả thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH trên P. vannamei ......................... 43 IV.1.2.1 Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu khi lai ............................. 43 IV.1.2.2 Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K ............. 46 IV.1.2.3 Kết quả thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp ..................................... 49 IV.2 Kết quả trên tôm sú P. monodon ............................................................................... 52 IV.2.1 Kết quả thí nghiệm theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp ........................ 52 IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng trong phòng thí nghiệm ............................................................................................................... 54 IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhƣng có thay đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit..................................................................... 54 IV.2.2.2 Trƣờng hợp xử lý mẫu nhanh .............................................................................. 56 IV.2.2.3 Trƣờng hợp biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai ............................................... 59 ix
IV.2.2.4 Trƣờng hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai........................................................................................................................ 61 IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa ISH với mô học và PCR ....................................... 65 IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei ............................................................................. 65 IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae ................................................................................ 65 IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thƣơng phẩm............................................................................ 66 IV.3.2 Kết quả trên Penaeus monodon .............................................................................. 68 IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae .............................................................................................. 69 IV.3.2.2 Đối với tôm thƣơng phẩm ................................................................................... 70 IV.5 Nhận xét chung .......................................................................................................... 73 IV.6 Những thuận lợi và khó khăn .................................................................................... 74 IV.6.1 Thuận lợi ................................................................................................................ 74 IV.6.2 Khó khăn ................................................................................................................ 74 IV.7 Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp In situ hybridization............................................ 75 IV.7.1 Ƣu điểm ................................................................................................................. 75 IV.7.2 Nhƣợc điểm ........................................................................................................... 75 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 76 V.1 Kết luận ....................................................................................................................... 76 V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do TSV trên P. vannamei ............................................................................................................................ 76 V.1.2 Phƣơng pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do WSSV trên P. monodon ............................................................................................................................ 76 V.2 Đề nghị........................................................................................................................ 77 CHƢƠNG VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 79 x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid WSD : White Spot Disease WSSV : White Spot Syndrome Virus TS : Taura Syndrome TSV : Taura Syndrome Virus Bp : base pair : Ultra – Violet UV ISH : In Situ hybridization PCR : Polymerase Chain Reaction ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay RT – PCR : Reverse – transcription polymerase chain reaction PBS : Phosphate Buffered Saline TBS : Tris Buffered Saline SSC : Sodium Chlorua/Sodium Citrate NTB/BCIP : Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate. : Thẻ chân trắng TCT TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ : Kính hiển vi KHV FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations RT : Room temperature ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long OD : Optimal density xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC SƠ ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1: Virus WSSV gây bệnh đốm trắng .................................................................... 10 Hình 2.2: Tôm sú bị nhiễm bệnh đốm trắng ..................................................................... 11 Hình 2.3: Tôm bị nhiễm virus Taura TSV ........................................................................ 13 Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin ..................... 21 Hình 2.5: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu huỳnh quang .................. 21 Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe đƣợc đánh dấu với DIG ....................... 22 Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc ............................................................................................. 23 Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc thể của nấm Thinopyrum ponticum .................................... 23 Hình 4.1: Đối chứng dƣơng trên phụ bộ tôm lớn, X10 .................................................... 42 Hình 4.2: Đối chứng âm trên mang tôm lớn, X10 ............................................................ 42 Hình 4.3: Mẫu lai đƣợc thực hiện theo nghiệm thức thứ III, quan sát trên phụ bộ X10 và X40 .............................................................................................................. 46 Hình 4.4: Hiện tƣợng dƣơng tính giả trên phụ bộ tôm lớn, X10 ...................................... 51 Hình 4.5: Đối chứng âm trên gan tụy tôm lớn, X40 ......................................................... 53 Hình 4.6: Đối chứng dƣơng trên mang tôm lớn, X10....................................................... 53 Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10...................................... 53 Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV trên mẫu mang tôm lớn, X40......................................... 53 Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh ....................................... 58 Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame, quan sát ở X40 ................................................................ 63 Hình 4.11: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán TSV đồng thời bằng ba phƣơng pháp .................................................................................................................. 68 Hình 4.12: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán WSSV đồng thời bằng ba phƣơng pháp .................................................................................................................. 72 xii
Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trƣớc khi thực hiện chẩn đoán ........................................ 30 Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ nhất ............................................. 32 Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ hai ............................................... 33 Sơ đồ 3.4: Quy trình xử lý mẫu nhanh .............................................................................. 38 Sơ đồ 4.1: Quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện ................ 64 xiii
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Các thông số tối ƣu cho tôm phát triển............................................................. 8 Bảng 2.2: Các tên gọi khác nhau của virus gây bệnh đốm trắng ...................................... 9 Bảng 3.1: Các thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV trong phòng thí nghiệm 38 Bảng 3.2: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P. vannamei ...................... 40 Bảng 3.3: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P. monodon ....................... 40 Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng ISH .................................. 41 Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm postlarvae ................ 44 Bảng 4.3: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm thƣơng phẩm ........... 45 Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K trên postlarvae ... 47 Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K trên tôm thƣơng phẩm ................................................................................................................. 48 Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm postlarvae ............... 50 Bảng 4.7: Kếtquả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm thƣơng phẩm ........... 50 Bảng 4.8: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và hóa chất của bộ kit ................ 52 Bảng 4.9: Kếtquả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất ............... 55 Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae ............................. 56 Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thƣơng phẩm ........................ 57 Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên postlarvae ...... 59 Bảng 4.13: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm ................................................................................................................. 60 Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm postlarvae ................................................................................ 61 Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm ........................................................................... 62 xiv
Bảng 4.16: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae ............ 65 Bảng 4.17: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng phẩm 66 Bảng 4.18: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae ............ 69 Bảng 4.19: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng phẩm 70 xv
1 CHƢƠNG I GIỚI THIỆU I.1 Đặt vấn đề Ngày nay việc khai thác các nguồn lợi thủy sản biển đã làm cho trữ lƣợng của các đối tƣợng thủy sản có giá trị kinh tế cao ngày càng trở nên cạn kiệt. Do đó nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết. Ở nƣớc ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới thực sự phát triển từ năm 1988 nhƣng do lợi nhuận cao của nghề này và do sự ƣu đãi của thiên nhiên nên nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh ở một số tỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long nhất là các tỉnh Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Diện tích nuôi ngày càng đƣợc mở rộng hiện có hơn 260.000 ha dùng để nuôi tôm với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kỹ thuật đã đƣợc áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, nuôi tôm tăng sản…với mục tiêu đạt sản lƣợng cao nhất trong thời gian ngắn nhất. Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm đƣợc nuôi với mật độ cao. Do đó nếu kỹ thuật nuôi chƣa đƣợc đảm bảo, việc áp dụng khoa học kỹ thuật trong các công đoạn nuôi chƣa đƣợc đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trƣờng nƣớc, phá vỡ môi trƣờng sinh thái, bùng nổ dịch bệnh…là một thực tế không thể tránh khỏi và gây ra nhiều thiệt hại lớn cho ngƣời nuôi và cho nền kinh tế. Dịch bệnh vào cuối năm 1993 đầu 1994 lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ đồng (Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể. WSSV (White Spot Syndrome Virus) là virus gây bệnh đốm trắng, một trong những bệnh quan trọng xảy ra trên rất nhiều các đối tƣợng tôm nuôi. Đặc trƣng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi. Còn TSV (Taura Syndrome Virus) là một trong những virus gây bệnh nghiêm trọng trên tôm thẻ chân trắng (TCT) là chủ yếu nhƣng cũng có khả năng lây lan và gây bệnh cho các loài tôm khác. Hiện nay, hai loại virus này đang gây nhiều trở ngại cho ngành nuôi tôm trên thế giới và gây nhiều thiệt hại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chƣa có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Do đó, ngoài biện pháp kỹ thuật nuôi tốt, còn phải có phƣơng pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả nhằm giám sát hai mầm bệnh này từ lúc thả
2 giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử lý thích hợp. Việc ứng dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử trong đó có phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm là nguồn công cụ rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và đƣợc sự đồng ý của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh do WSSV (White Spot Syndrome Virus) trên tôm sú Penaeus monodon và TSV (Taura Syndrome Virus) trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei”. I.2 Mục tiêu đề tài Phát triển phƣơng pháp ISH để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú Penaeus monodon và mầm bệnh TSV trên thẻ chân trắng (TCT) Penaeus vannamei trong điều kiện phòng thí nghiệm nhằm xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán ổn định, có độ nhạy và độ chính xác cao. So sánh độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định và hiệu quả kinh tế của phƣơng pháp ISH so với phƣơng pháp mô học truyền thống và PCR. I.3 Yêu cầu của đề tài Xem xét khả năng ứng dụng vào thực tế để chẩn đoán bệnh của phƣơng pháp này. Đánh giá đƣợc hiệu quả của phƣơng pháp chẩn đoán này so với phƣơng pháp mô học và PCR. I.4 Nội dung của đề tài Phát triển phƣơng pháp ISH để phát hiện mầm bệnh do WSSV trên tôm sú. So sánh độ ổn định, độ chính xác và độ nhạy của phƣơng pháp này với các phƣơng pháp chẩn đoán bằng mô học và PCR để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm sú. Phát triển phƣơng pháp ISH để phát hiện mầm bệnh do TSV trên tôm TCT. So sánh độ ổn định, độ chính xác và độ nhạy của phƣơng pháp này với các phƣơng pháp chẩn đoán bằng mô học và PCR để phát hiện mầm bệnh TSV trên tôm TCT.
3 CHƢƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới II.1.1 Hiện trạng chung Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nƣớc trên thế giới. Vào những năm cuối của thập kỷ 80, nghề nuôi tôm đã có những bƣớc phát triển nhanh chóng, các trại nuôi tôm đƣợc xây dựng ở gần 40 nƣớc, đƣa sản lƣợng tôm nuôi từ tỷ lệ 2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với tổng sản lƣợng tôm (Latscha, 1989). So với năm 1984, sản lƣợng tôm nuôi năm 1990 tăng 368% với gần 600.000 tấn (FAO, 1992). Năm 1995, sản lƣợng tôm nuôi đạt 712.000 tấn, chiếm 27% tổng sản lƣợng nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Trong đó các nƣớc Đông Bán Cầu chiếm 78% tổng sản lƣợng tôm nuôi, còn lại là các nƣớc Tây Bán Cầu (Rosenberry, 1995). Hiện nay có khoảng 25 loài tôm đang đƣợc nuôi, nhƣng chỉ có 5 loài đạt sản lƣợng trên 10.000 tấn/năm và ba loài đạt sản lƣợng 100.000 tấn/năm (Bộ Thủy Sản, 1994). Trong đó loài tôm sú Penaeus monodon chiếm tới 53% tổng sản lƣợng tôm nuôi ở khu vực Châu Á – Thái Bình Dƣơng. Vùng nuôi tôm sú tập trung chủ yếu ở Châu Á (Fast, 1992) điển hình ở các quốc gia nhƣ Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc, Việt Nam, Đài Loan. II.1.2 Các hình thức nuôi Hiện nay trên thế giới có khá nhiều hình thức nuôi tôm: nuôi quảng canh; nuôi quảng canh cải tiến; nuôi bán thâm canh; thâm canh và nuôi kết hợp với cua, cá…(Liao, 1989). Việc lựa chọn hình thức nuôi phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ kích thƣớc ao, vốn đầu tƣ, kinh nghiệm quản lý, cơ sở vật chất hiện có, thị trƣờng tiêu thụ sản phẩm (Kungvankij và Kongkeo, 1988). II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới Lịch sử phát triển nghề nuôi tôm ở nhiều nƣớc nhất là ở vùng Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại do dịch bệnh trong nghề nuôi tôm biển là điều không thể tránh khỏi, tùy theo mô hình nuôi, sau một thời gian khai thác thì nhất định bệnh sẽ xuất hiện (Nguyễn Mạnh Hùng, 1994). Trung Quốc là nƣớc có sản lƣợng tôm cao nhất thế
4 giới, năm 1992 là 150.000 tấn; năm 1993 do dịch bệnh thiệt hại 50% tổng sản lƣợng. Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm sú nuôi, năm liền sau đó sản lƣợng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bị dịch bệnh. Indonesia cũng đang bị thiệt hại nặng do môi trƣờng xấu và do dịch bệnh. Trong quý ba năm 1994, sản lƣợng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳ giảm 38%. Thái Lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nƣớc bị ô nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bị bệnh. Năm 1994, tôm nuôi ở Thái Lan bị chết gần 30.000 ha, mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD (Phan Lƣơng Tâm, 1994). Để đối phó với dịch bệnh nhiều nƣớc có nghề nuôi tôm phát triển nhƣ Nhật Bản, Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Thái Lan… đã đầu tƣ nhiều kinh phí cho các công trình nghiên cứu cơ bản và ứng dụng về lĩnh vực dịch bệnh tôm cá ở cấp quốc gia và trong khu vực. Thông qua các công trình đƣợc công bố ở trong và ngoài nƣớc, cho thấy có khoảng 30 loại bệnh xảy ra trên tôm. Tuy nhiên, các bệnh chƣa đƣợc tìm hiểu một cách rõ ràng và cặn kẽ. Ngoài các bệnh mà tác nhân là vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm, bệnh do môi trƣờng…thì virus là tác nhân gây tổn thất nặng nề nhất cho nghề nuôi tôm (Phan Lƣơng Tâm, 1995). II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam II.2.1 Hiện trạng chung Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang, là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thuỷ sản nƣớc mặn và nƣớc lợ. Nghề nuôi tôm ở nƣớc ta mà đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chỉ mới phát triển mạnh mẽ vào cuối những năm 1980, dƣới sự phát triển của các hình thức nuôi quảng canh cải tiến và bán thâm canh. Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi còn hạn chế, độ rủi ro về dịch bệnh càng cao. Năm 1997, mô hình nuôi tôm công nghiệp ở qui mô nông hộ 700 – 1.500 m2/ao (Ts. Nguyễn Văn Hảo, 1997) đƣợc làm thí điểm tại Trà Vinh đạt năng suất trung bình 5 tấn/ha/vụ. Năm 1998, mô hình nuôi tôm sú công nghiệp qui mô trại nhỏ 6.000 m2/ao tại Gò Công Đông (Ts. Nguyễn Văn Hảo, 1998) đạt năng suất 7 tấn/ha/vụ. Các mô hình nuôi tôm công nghiệp đạt kết quả cao, tạo tiền đề cho chƣơng trình phát triển thâm canh hóa nghề nuôi tôm ở Việt Nam trong tƣơng lai.
5 II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang đƣợc áp dụng Hiện nay, nƣớc ta cũng áp dụng các hình thức nuôi tôm trên thế giới nhƣ nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến, nuôi bán thâm canh và thâm canh. Ngoài ra nƣớc ta cũng đã phát triển hình thức nuôi sinh thái: nuôi tôm – rừng, tôm – lúa…Trong đó, hình thức nuôi quảng canh đƣợc áp dụng phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là vùng ĐBSCL (Vũ Đỗ Quỳnh, 1992). II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam Tại Việt Nam, từ cuối năm 1993 dịch bệnh tôm đã đƣợc báo động trên toàn quốc, thiệt hại lớn nhất là ở các tỉnh ĐBSCL nhƣ Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng, Minh Hải, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An…Ở các tỉnh này tôm nuôi đã bị bệnh và chết hàng loạt do môi trƣờng nuôi bị nhiễm bẩn, thời tiết diễn biến phức tạp, nguồn giống chƣa đảm bảo chất lƣợng (Phan Lƣơng Tâm, 1994). Tính đến 30 – 9 – 1994, tổng diện tích nuôi tôm bị chết là 84.850 ha với thiệt hại ƣớc tính 5.520 tấn trị giá 294 tỷ đồng (Bùi Quang Tề, 1995). Năm 1995, sản lƣợng tôm nuôi của Việt Nam là 50.000 tấn giảm còn 30.000 tấn năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997). Theo Ts. Nguyễn Văn Hảo và ctv năm 1997, tác nhân chính gây bệnh ở tôm nuôi vùng ĐBSCL ngoài nhóm Vibrios còn có sự xuất hiện của hai tác nhân Virus gây bệnh quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrome Virus). Tác nhân gây bệnh virus hiện nay đƣợc xem là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất, việc chữa trị bệnh do virus không hiệu quả vì hiện nay chƣa có một loại thuốc hay hóa chất nào có thể chữa bệnh virus (Ts. Nguyễn Văn Hảo, 2000). Từ năm 1996 – 1997, bệnh đốm trắng đã xuất hiện khắp các vùng nuôi tôm biển từ Hải Phòng đến các tỉnh miền Trung, các tỉnh ven biển Nam Bộ. Bệnh đốm trắng đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm biển Việt Nam vì chúng lan truyền rất nhanh qua nguồn nƣớc, đƣờng tiêu hóa…với tỷ lệ chết 90 – 100% (Bùi Quang Tề, 1998). II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P. monodon và tôm thẻ chân trắng P. vannamei Đối với tôm sú Ngành chân đốt: Arthropoda