Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Ứng dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:84

Thêm vào BST

Báo xấu

164
lượt xem 26
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Ứng dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố ứng dụng các quy trình và bộ KIT PCR nói trên để phát hiện e. coli, s. aureus, salmonella, b. cereus và c. perfringens trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Ứng dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM THỊ HỮU KIỀU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ĐỂ KHẢO SÁT SỰ NHIỄM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC Thành Phố Hồ Chí Minh - 2007
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và chân thành, em xin cảm ơn: Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại Học Sư Phạm TP. HCM đã cung cấp cho em những kiến thức quý báu trong cả khóa học, dặc biệt là TS. Trần Thanh Thủy và TS. Trần Thị Thanh đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn, động viên em trong suốt quá trình học tập. Em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS. Trần Linh Thước đã luôn tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn này. Xin cảm ơn các bạn Nhân, Linh, Vân, Dung, Na, Ánh và tất cả các thành viên của Lab A, đặc biệt là Ths. Nguyễn Thị Bạch Huệ, đang công tác tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh học Phân tử, Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh họcTrường ĐHKHTN, ĐHQG TP. HCM, đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực nghiệm. Xin cảm ơn các bạn lớp cao học K.15 - VSV và các thành viên Cao học khóa 15 đã cùng gắn bó với tôi. Cảm ơn Anh! Người đã luôn sát cánh và ở cạnh tôi. Lời cảm ơn cuối cùng, con xin gởi đến tất cả “Ba Mẹ” và đại gia đình thân yêu của con đã luôn yêu thương, đùm bọc con, là điểm tựa vững chắc và niềm tin của con trong suốt cuộc đời. TP. HCM, nam 2007 Phạm Thị Hữu Kiều
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AC : Relative Accuracy (Độ chính xác tương đối) AOAC : Association of Official Analytical Chemists ATP : Adenosine triphosphat bp : base pair (cặp base) BPW : Buffer Pepton Water (đệm pepton) cAMP : cyclic Adenosine Monophosphate cGMP : cyclic Guanosine Monophosphate DNA : Deoxyribose nucleic acid dNTP : deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ELISA : Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) FN : False Negative (âm tính giả) NC : nuôi cấy FP : False Positive (dương tính giả) HUS : Haemolytic-Uraemic Syndrome (hội chứng tan huyết) LDC : Lysine Decarboxylase MMC : Microbiological Methods Committee MR : Methyl Red MYP : Mannitol - Egg York - Polymycin NordVal : Nordic System for Validation of Alternative PCR : Polymerase Chain Reaction SE : Relative Sensitivity (Độ nhạy tương đối) SP : Relative Specificity (Độ đặc hiệu tương đối) TAE : Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-Acetate-EDTA TSB : Tryptone Soya Broth TSI : Triple Sugar Iron Agar
VP : Voges - Proskauer WHO : World Health Organization XLD : Xylose Lysine Desoxycholate ISO : International Standards Organization EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Bảng 1.1. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm do một số vi khuẩn ...........8 Bảng 1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và năm 2006 ........................................................................................................9 Bảng 1.3. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và năm 2006 .....................................................................................10 Bảng 1.4. Thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM từ năm 2001 đến 2006.......................................................................11 Bảng 1.5. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát ..............14 Bảng 1.6. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm thực phẩm chế biến từ sữa ......................................................................................................14 Bảng 1.7. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm sữa chua..........................15 Bảng 1.8. Tiêu của Bộ Y tế đối với nhóm kem, nước đá.............................15 Bảng 1.9. Bảng phân loại độc tố của C. perfringens ....................................22 Bảng 2.1. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm sữa.............44 Bảng 2.2. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát ..............................................................................44 Bảng 2.3. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm kem ...........44 Bảng 2.4. Kích thước vạch khuếch đại của các vi khuẩn nghiên cứu ..........49 Bảng 2.5. Trình tự các mồi được sử dụng trong phản ứng PCR...................50 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm sữa tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ..................................63 Bảng 3.2. Thống kê kết quả kiểm tra trên mẫu sữa tại TP. HCM bằng phương pháp PCR và nuôi cấy ................................................................66 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ...........................68 Bảng 3.4. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm nước giải khát tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ...........................70
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy .....................72 Bảng 3.6. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm kem tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy ............................................73 Bảng 3.7. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu Salmonella, E. coli và S. aureus ...........77 Bảng 3.8. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu B. cereus và C. perfringens77
DANH MUÏC CAÙC HÌNH Trang Hình 2.1. Thang DNA 100bp ...........................................................37 Hình 2.2. Các bước của phản ứng PCR ..................................................... 38 Hình 2.3. Số bản sao DNA tăng theo từng chu kỳ trong phản ứng PCR .. .39 Hình 2.4. Đưa mẫu vào máy PCR ............................................................. 48 Hình 3.1. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Salmonella ............................ 58 Hình 3.2. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định E. coli.................................... 58 Hình 3.3. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định S. aureus ............................... 59 Hình 3.4. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định B. cereus ............................... 59 Hình 3.5. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định C. perfringens ....................... 59 Hình 3.6. Kết quả phát hiện E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens bằng kỹ thuật PCR ......................................... 59 Hình 3.7. Khuẩn lạc B. cereus ................................................................... 60 Hình 3.8. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định B. cereus ............................... 60 Hình 3.9. Thử nghiệm sinh hóa khẳng định C. perfringens ...................... 60 Hình 3.10. Khuẩn lạc C. perfringens ........................................................... 61 Hình 3.11. Kết quả phát hiện E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus và C. perfringens bằng kỹ thuật PCR .................................................. 62
DANH MUÏC CAÙC BIEÅU ÑOÀ Trang Biểu đồ 3.1. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong mẫu sữa trên địa bàn TP. HCM ..................................................................................63 Biểu đồ 3.2. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại địa bàn TP. HCM .................................................................................66 Biểu đồ 3.3. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại địa bàn TP. HCM ...................................................................................................68
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), hàng năm có tới 30% dân số ở các nước phát triển bị bệnh do thực phẩm, chủ yếu là ngộ độc thực phẩm (NĐTP), ở các nước đang phát triển các trường hợp ngộ độc thực phẩm lại cao hơn nhiều [25]. Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên và đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Ở các nước phát triển, tình hình ngộ độc thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm vì những tổn thất lớn về kinh tế và con người do ngộ độc thực phẩm gây ra. Tại Mỹ, theo thống kê của trung tâm Kiểm soát và Phòng chống bệnh (CDC), hàng năm có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm và 5.000 trường hợp tử vong. Thiệt hại do các trường hợp ngộ độc thực phẩm ước tính khoảng từ 5 đến 17 tỉ USD [34]. Cũng như nhiều quốc gia khác, tại Việt Nam vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, đặc biệt trong hai năm gần đây hiện tượng này càng phổ biến hơn. Mỗi năm, nước ta có 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Nhà nước cũng phải chi trên 3 tỉ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và truy tìm nguyên nhân [50]. Theo thống kê chưa đầy đủ của cục Vệ sinh an toàn thực phẩm từ năm 2000 đến năm 2006, cả nước đã xảy ra 988 vụ ngộ độc thực phẩm với 23.190 người bị ngộ độc và 263 người chết [44]. Trong đó, có 155 vụ ngộ độc tại bếp ăn tập thể với 14.653 người bị ngộ độc bao gồm: 97 vụ NĐTP tại các khu công nghiệp, khu chế xuất với 9.989 người bị ngộ độc; 58 vụ NĐTP trong các trường học với 3.790 cháu bị ngộ độc và 2 cháu tử vong. Riêng tại TP. HCM có 113 vụ NĐTP với 7.688 người bị ngộ độc và 7 người tử vong. Tại Hà Nội xảy ra 37 vụ NĐTP với 370 người ngộ độc và 2 người tử vong [49]. Trong tổng số 988 vụ ngộ độc thực phẩm của cả nước (từ năm 2000 đến năm 2006), có 161 vụ NĐTP do thức ăn đường phố (thực phẩm chế biến sẵn bán trên vỉa hè trước các chợ, công viên, trường học) với 3.759 người bị ngộ độc và 7 người tử vong. Thực trạng vấn đề ngộ độc do thức ăn đường phố hiện nay ở nước ta ngày càng gia tăng, hiện tượng vi phạm quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm đối với nhóm thực phẩm đường phố phổ biến. Trong khi đó, tình hình kiểm tra, giám sát của cơ
quan chức năng đối với nhóm thực phẩm này gặp nhiều khó khăn và chưa đạt hiệu quả [48]. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm như nhiễm vi sinh, nhiễm các hóa chất độc hại hoặc dư lượng thuốc trừ sâu và thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm quá mức cho phép, nhưng phần lớn các trường hợp có nguồn từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật gây bệnh [46]. Ngày nay, yêu cầu an toàn vệ sinh thực phẩm nhất là về phương diện vi sinh trở thành một trong những tiêu chuẩn không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm. Việc phân tích, phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và thực hiện các biện pháp đảm bảo đạt tiêu chuẩn về an toàn vi sinh trong sản xuất chế biến thực phẩm, đặc biệt là nhóm thực phẩm đường phố ngày càng được quan tâm [43]. Chính vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố” 2. Sơ lược vấn đề nghiên cứu Tại Việt Nam, việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu dựa vào phương pháp nuôi cấy truyền thống, tốn nhiều thời gian, thao tác phức tạp và độ nhạy chưa cao. Trong khi đó, nhiều phương pháp mới như: phương pháp ELISA, phương pháp PCR, phương pháp sử dụng mẫu dò, phương pháp phát hiện vi sinh vật dựa trên kỹ thuật phát quang sinh học,… có nhiều ưu điểm về thời gian, độ nhạy và độ chính xác cao đang được phát triển rộng rãi trên thế giới và đang dần thay thế cho phương pháp truyền thống. Cũng như các nước, nhu cầu thực tế tại Việt Nam hiện nay là cần ứng dụng những kỹ thuật mới này vào việc kiểm tra, giám sát tình hình nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm để nhanh chóng phát hiện các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và ngăn ngừa một cách có hiệu quả các tác hại từ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật gây ra. Với nhu cầu thực tiễn như trên, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TP. HCM đã tiến hành xây dựng các quy trình và bộ kit PCR phát hiện nhanh các vi sinh vật gây ngộ độc trên thực phẩm như: Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và Clostridium
perfringens. Để được công nhận như một phương pháp chuẩn và được phép lưu hành rộng rãi tại các phòng thí nghiệm phân tích vi sinh trong cả nước, các quy trình này đã được tiến hành đánh giá hiệu lực bằng việc phân tích và so sánh kết quả thu nhận được giữa phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR tại các phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam. Đồng thời, để có thể sử dụng vào thực tế, các quy trình này đã được ứng dụng để khảo sát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trên các mẫu thực tế và so sánh với kết quả theo phương pháp nuôi cấy truyền thống. Tuy nhiên, trong thực phẩm đường phố chưa được nghiên cứu và khảo sát để đưa ra kết luận cụ thể về mức độ nhiễm vi sinh ở nhóm thực phẩm này. Vì thế, đề tài luận văn này phần nào đáp ứng được nhu cầu thực tế về kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện nay ở nước ta. 3. Mục đích nghiên cứu Mục đích nghiên cứu của đề tài luận văn này là ứng dụng các quy trình và bộ kit PCR nói trên để phát hiện E. coli, S. aureus, Salmonella, B. cereus và C. perfringens trong thực phẩm đường phố tại TP. HCM, đồng thời so sánh với kết quả theo phương pháp nuôi cấy. Từ đó, khảo sát được tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố trên địa bàn TP. HCM so với chỉ tiêu cho phép của nhà nước. Nội dung của luận văn này là một phần thuộc đề tài khoa học và công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước của Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc kiểm tra, giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm” mã số KC. 04. 30 do Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG, TP. HCM chủ trì và PGS. TS. Trần Linh Thước chủ nhiệm đề tài. 4. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu sự hiện diện của E. coli, Salmonella, S. aureus, B. cereus và C. perfringens trong nhóm thực phẩm đường phố (thực phẩm được chế biến sẵn bán trên vỉa hè trước các chợ, trường học, công viên,…), bao gồm: nhóm sữa như sữa tươi, sữa đậu nành, sữa đậu xanh và sữa chua; nước sâm, nước mía và nước rau má thuộc nhóm nước giải khát và các loại kem: kem tươi, kem ký, kem ly, kem cây, kem chiên và kem marino. 5. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu trên thực phẩm đường phố thuộc nhóm sữa, nước giải khát và kem tại các Quận: 3, 5, 8, 10 và quận Tân Bình thuộc địa bàn TP. HCM. 6. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu thực phẩm đường phố bằng phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy truyền thống. - Đánh giá tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong nhóm thực phẩm đường phố trên so với chỉ tiêu cho phép của Bộ Y tế. - So sánh, đánh giá kết quả phân tích của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. - Rút ra kết luận của đề tài - Đề nghị và hướng phát triển của đề tài 7. Phương pháp nghiên cứu - Các phương pháp phân tích chỉ tiêu vi sinh: phương pháp PCR, phương pháp nuôi cấy, phân lập, các phương pháp thử nghiệm hóa sinh - Xử lí kết quả bằng phương pháp thống kê toán học đơn giản 8. Dự kiến cấu trúc luận văn Luận văn gồm các phần: Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và biện luận Kết luận và đề nghị
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Thực trạng vấn đề ngộ độc thực 1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là khái niệm chung để chỉ các triệu chứng gây ra do sử dụng thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, các chất độc từ môi trường hoặc chất độc tự nhiên có trong bản thân thực phẩm [27]. Theo Bộ Y tế, ngộ độc thực phẩm là hội chứng cấp tính xảy ra do ăn, uống phải thức ăn có chứa chất độc, biểu hiện bằng những triệu chứng dạ dày - ruột, thần kinh hoặc những triệu chứng khác tuỳ theo tác nhân gây ngộ độc [73]. 1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi hai nguyên nhân chính 1.1.2.1. Ngộ độc do hóa chất Là những trường hợp ăn phải thức ăn có chứa hóa chất độc như: chất phụ gia, kim loại nặng hoặc dư lượng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học còn sót lại trên thực phẩm [45]. Ước tính có khoảng 11 - 27% vụ ngộ độc thực phẩm (so với tổng số các vụ NĐTP) có nguyên nhân là do thực phẩm bị nhiễm các loại hóa chất chẳng hạn: CN, As, Hg, Pb, hóa chất bảo quản thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật [50]. 1.1.2.2. Ngộ độc do vi sinh vật Là ngộ độc do ăn phải thức ăn có chứa vi sinh vật gây bệnh hoặc độc tố của chúng [45], bao gồm các trường hợp sau: - Ngộ độc thực phẩm do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật (chiếm 33 - 49% so với tổng số các vụ NĐTP), chủ yếu do các chủng Salmonella, E. coli, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes [50]. Ngộ độc do ăn phải thức ăn có chứa vi sinh vật thường xảy ra khoảng 16 - 30 giờ sau khi ăn thức ăn nhiễm khuẩn. Các vi khuẩn được nhân lên trong cơ thể và gây bệnh thông qua quá trình xâm nhiễm hoặc do nội độc tố được tạo ra trong tế bào vi khuẩn và được phóng thích ra ngoài môi trường khi tế bào vi sinh vật bị phân hủy.
- NĐTP do thực phẩm bị nhiễm độc tố của vi khuẩn (chiếm 20 - 30% tổng số các vụ NĐTP) là nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm tập thể. Trong số này, vi khuẩn Staphylococcus aureus hiện diện trong các món ăn làm bằng tay (bánh ngọt), Clostridium perfringens hay phát sinh trong các món được nấu nướng và hâm nóng [20]. Ngộ độc do ăn phải thức ăn chứa độc tố là do một số vi khuẩn có khả năng tạo độc tố và tiết ra ngoài môi trường gọi là ngoại độc tố. Ngoại độc tố rất độc và gây ra những rối loạn điển hình, ngộ độc thực phẩm do độc tố thường xảy ra sau 1 - 6 giờ tùy thuộc vào lượng độc tố có trong cơ thể. Các vi sinh vật sinh độc tố điển hình là: C. botulinum, C. perfringens và S. aureus [50]. Ngoài ra, các vụ ngộ độc còn do thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc tự nhiên (6 - 17,5% so với tổng số các vụ NĐTP) [45]. 1.1.3. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra ở nhiều người, có những triệu chứng giống nhau sau khi tiêu thụ thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau tùy thuộc vào khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng của từng người. Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là: tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau nhức người, sốt và đau đầu. Những triệu chứng này có thể thay đổi tùy thuộc vào tác nhân gây ngộ độc là tế bào hay độc tố của vi khuẩn [28]. Triệu chứng ngộ độc thực phẩm do một số vi khuẩn cũng như các loại thực phẩm thường chứa các vi khuẩn này được trình bày tóm tắt ở Bảng 1.1. Bảng 1.1. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm do một số vi khuẩn Tác nhân Nguồn gây bệnh Triệu chứng Sốt,tiêu chảy, đau Salmonella Trứng, thịt gia cầm nấu chưa chín bụng, nôn V. cholerae Dùng nước ô nhiễm làm kem, đá, tưới rửa Tiêu chảy, nôn, đau (phẩy khuẩn tả) rau quả, ăn sống cá, nhuyễn thể bụng Clostridium Thực phẩm đóng hộp bị ô nhiễm trong quá Giảm trương lực cơ perfringens trình chế biến: cá, thịt, các loại rau (mắt mờ, khó thở) Thịt, cá, rau, sữa tươi, nước bị ô nhiễm Tiêu chảy (lỵ) Escherichia Coli phân người phân có máu Staphylococcus Sản phẩm từ sữa, thịt gia cầm nấu chưa Buồn nôn, tiêu aureus (tụ cầu) chín. Nhiễm trùng từ mũi, tay và da lây chảy, đau bụng,
sang thức ăn chín mất nước nặng Tiêu chảy, phân có Shigella (lỵ) Sữa và thực phẩm bị ẩm ướt, nhiễm phân máu, sốt Đau bụng, tiêu Bacillus cereus Ngũ cốc, rau, sữa, thịt quay hoặc rán chảy, buồn nôn Nguồn [69] 1.1.4. Thực trạng vấn đề ngộ độc thực phẩm 1.1.4.1. Thực trạng vấn đề ngộ độc thực phẩm trên thế giới Các cuộc khảo sát gần đây cho thấy, các bệnh do ngộ độc thực phẩm xảy ra có thể nhiều hơn 300 đến 350 lần số trường hợp được báo cáo. Ước tính hàng năm có khoảng 1,5 tỉ lượt trẻ em dưới 5 tuổi mắc bệnh tiêu chảy do thực phẩm và hơn 3 triệu trẻ em chết vì bệnh này, hầu hết các trường hợp trên là ở các nước đang phát triển [33]. Theo thống kê của FOODHACCP, năm 2005, trên thế giới có 940 vụ ngộ độc thực phẩm lớn, trong đó có 381 vụ ngộ độc do vi sinh vật, đứng đầu vẫn là do: E. coli, S. aureus, Salmonella và L. monocytogenes [35]. Vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc, vi khuẩn này có trong nhiều loại thực phẩm (đồ nguội, thịt nguội, nghêu, sò, gà, chế phẩm từ sữa sống, nhất là các món ăn chế biến từ trứng tươi hoặc còn hơi tươi sống) [45]. Chỉ riêng những tháng đầu năm 2006, đã có hai trận dịch lớn xảy ra tại Angola và Nam Sudan làm 49.627 người mắc bệnh và 1.814 người tử vong. Nguyên nhân được xác định là do nguồn nước nhiễm V. cholerae [26]. Tại Thái Lan, ngày 17/03/2006 cũng đã xảy ra một vụ ngộ độc thực phẩm làm 152 người bị ngộ độc với các triệu chứng: khó nuốt, khó cử động, đau bụng và nhũn cơ. Trong số 100 người nhập viện, có 40 người nhập viện với tình trạng khó thở, suy hô hấp nặng. Nguyên nhân được xác định là do Clostridium botulinum trong măng tây đóng hộp [32]. 1.1.4.2. Thực trạng vấn đề ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam a. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam Thống kê từ trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai, tại khu vực phía Bắc, số người bị ngộ độc thực phẩm năm 2005 là gần 4.000 người, trong đó có 50 trường
hợp tử vong. So với năm 2004, tỉ lệ tử vong ở các trường hợp bị ngộ độc thực phẩm tăng gần 90% [52]. Theo thống kê của cục An toàn vệ sinh thực phẩm, tình hình ngộ độc thực phẩm trong hai năm 2005 và 2006 như sau: Bảng 1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và 2006 Thống kê 2005 2006 Số vụ ngộ độc 127 139 Số người bị ngộ độc 3.410 5.564 Số người tử vong 21 49 Nguồn: [30] Năm 2005 được xem là đỉnh điểm của những vụ ngộ độc thực phẩm so với những năm trước đó, nhưng qua bảng thống kê trên cho thấy năm 2006 tình trạng NĐTP còn cao hơn cả về số vụ, số người mắc và tử vong. Trong “Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm” năm 2007 (từ ngày 15/04 - 15/05/2007), cả nước đã xảy ra 19 vụ ngộ độc thực phẩm, với 534 người mắc, 8 người tử vong, số vụ ngộ độc thực phẩm quy mô trên 50 người là 3 vụ với tổng số 269 người mắc; trong “Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm”, năm 2006 (từ ngày 15/04 - 15/05/2006) xảy ra 17 vụ NĐTP, có 278 người mắc, 4 người tử vong [53]. So với năm 2006, tình hình ngộ độc thực phẩm xảy ra trong “Tháng hành động vì vệ sinh an toàn thực phẩm” năm 2007 tăng cao hơn nhiều cả về số vụ lẫn số người bị ngộ độc, đáng chú ý là số người tử vong tăng gấp đôi so với cùng kỳ năm 2006 (năm 2006 có 4 người tử vong, năm 2007 là 8 người) [52]. Trong các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm năm 2005 và 2006, nguyên nhân do nhiễm vi sinh vật chiếm tỉ lệ cao nhất (năm 2005 là 50,4%, năm 2006 là 31,8%); sau đó là do thực phẩm chứa chất độc tự nhiên (28,3% năm 2005, năm 2006 là 23,7%) còn lại là do hóa chất và không xác định được rõ nguyên nhân [48]. Nguyên nhân gây NĐTP trong năm 2005 và 2006 được thống kê ở Bảng 1.3. Bảng 1.3. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và 2006 Nguyên nhân 2005 2006
Do vi sinh vật 64 vụ (50,4%) 53 vụ (38,1%) Thực phẩm độc 36 vụ (28,3%) 33 vụ (23,7%) Do hóa chất 10 vụ (7,9%) 16 vụ (11,5%) Không xác định 17 vụ (13,4%) 37 vụ (26,7%) Nguồn: [48] b. Tình hình ngộ độc thực phẩm trên địa bàn TP. HCM Trong nhiều năm qua, TP. HCM được xem là một trong những địa phương có số vụ NĐTP cao nhất cả nước, vì đây là nơi tập trung đông dân cư, số dân nhập cư, hộ nghèo còn nhiều, do vậy mà việc quản lý vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm gặp nhiều khó khăn và chưa thật hiệu quả. Ở TP. HCM, theo trung tâm y tế dự phòng ghi nhận, tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2001 đến 2006 được thống kê như sau: Bảng 1.4. Thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM từ năm 2001 đến 2006 Thống kê Tình hình ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM Năm thống kê 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Số vụ ngộ độc thực phẩm 9 29 22 26 27 39 Số người ngộ độc 796 930 1158 964 1536 1564 Ngộ độc do vi sinh (%) 83,9 75,7 67,7 64,1 39,1 38,1 Số người tử vong 0 2 0 0 3 5 Nguồn: [47] Trong vài năm gần đây, số vụ ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM từ năm 2001 đến 2006 được ghi nhận ngày càng gia tăng cả về số vụ lẫn số người mắc. Cao điểm là năm 2006 tại TP. HCM có 39 vụ ngộ độc với 1.564 người bị ngộ độc, chiếm một tỉ lệ cao về NĐTP của cả nước (chiếm 35,64% so với cả nước), so với năm 2001, năm 2006 số vụ NĐTP tăng hơn 4 lần, số người ngộ độc tăng gấp đôi, đặc biệt số người tử vong tăng 5 lần, nguyên nhân ngộ độc do vi sinh vật vẫn chiếm một tỉ lệ đáng kể (năm 2001 là 83,9%, năm 2006 là 38,1%) [58]. Nguyên nhân của sự gia tăng số vụ NĐTP này là do tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm nói chung không được bảo đảm chẳng hạn: tình hình kinh doanh những mặt hàng nguyên liệu thực phẩm
kém chất lượng, không đảm bảo vệ sinh hoặc sử dụng những phụ gia độc hại; tình trạng chế biến bảo quản thực phẩm không an toàn; cơ sở vật chất, dụng cụ không đạt yêu cầu; vệ sinh cá nhân và ý thức nhân viên chế biến chưa tốt [52]. 1.1.4.3. Tình hình ngộ độc do thức ăn đường phố Đến nay, các cơ quan chức năng vẫn phải thừa nhận việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố đang là vấn đề cần được quan tâm [42]. Hiện tượng vi phạm quy định vệ sinh an toàn thực phẩm ở các dịch vụ thức ăn đường phố ngày càng cao, kết quả trong tháng 8 năm 2005 có 11 ca ngộ độc do thức ăn đường phố với hơn 600 người mắc, trong đó có 3 người tử vong [45]. Cuộc khảo sát của Bộ Y tế, năm 2005 kết luận: ở Hà Nội và Thành Phố Hồ Chí Minh có 88% số cơ sở thức ăn đường phố kém chất lượng. Theo đánh giá của đoàn thanh tra Bộ Y tế sau một tuần hành động thanh tra, kiểm tra thức ăn đường phố tại Thành Phố Hồ Chí Minh (từ ngày 23 - 27/08/05) đã kết luận: “nhiều cơ sở chế biến thực phẩm đường phố còn sử dụng phẩm màu trong chế biến thức ăn, nguồn nước sử dụng chưa đảm bảo vệ sinh, đáng chú trọng hơn là hàm lượng vi sinh cao hơn tiêu chuẩn cho phép trong thực phẩm theo quy định của Bộ Y tế (4/1998)” [55]. Đặc biệt là tình trạng thực phẩm đã chế biến sẵn bán tại các công viên, chợ, trường học rất phổ biến; trong khi đó, điều kiện vệ sinh cơ sở, vệ sinh dụng cụ chế biến và vệ sinh cá nhân người trực tiếp chế biến các loại thực phẩm này vẫn chưa bảo đảm, tình trạng sử dụng phụ gia thực phẩm ngoài danh mục cho phép vẫn còn [29]. Loạt bài: “Thực phẩm đường phố, 1.001 kiểu... mất vệ sinh” của Báo Thanh Niên [33] và cuộc hội thảo về vấn đề này tại TP. HCM vào cuối tuần tháng 8 năm 2006 [41], đã cho thấy thực trạng thức ăn đường phố ở nước ta vượt quá ngưỡng báo động, ngoài tầm kiểm soát của cơ quan chức năng. Hiện tượng thực phẩm đường phố không đảm bảo vệ sinh trong khi chế biến, nguồn nước còn nhiễm bẩn, việc vệ sinh các dụng cụ đựng thức ăn chưa đạt yêu cầu,…vẫn đang diễn ra ở hầu hết các cơ sở bán thức ăn đường phố trong cả nước [54]. Phần lớn ý kiến của các nhà chuyên môn, các nhà quản lý đều cho rằng hiện các văn bản pháp quy về vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố còn thiếu, hình thức xử phạt chưa đủ mạnh để răn đe. Đặc biệt, để đáp ứng nhu cầu ăn uống ngày càng gia tăng nên số lượng cơ sở chế biến kinh doanh thực phẩm quy mô nhỏ, không đảm bảo
vệ sinh ngày một nhiều, là nguyên nhân dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm đường phố, hơn nữa, việc quản lý những người bán thức ăn đường phố là rất khó, do số đông họ là những người nhập cư, là thành phần nghèo, khó khăn, điểm bán thường lưu động, khó xử lý, vì vậy mà việc giám sát vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện đang gặp rất nhiều khó khăn và cần sự phối hợp đồng bộ của toàn xã hội để giám sát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện nay ở nước ta [48]. Chính vì những lí do trên mà hiện nay, việc khảo sát để đưa ra kết luận về tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố so với tiêu chuẩn cho phép của nhà nước là điều cần thiết và đang được quan tâm. 1.1.5. Các quy định hiện hành và tiêu chuẩn nhà nước về việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm 1.1.5.1. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm đối với các loại nước giải khát Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát hiện nay ở nước ta rất đa dạng.Trong phần này, chúng tôi chỉ chọn một số quy định về chỉ tiêu vi sinh đối với một vài nhóm nước giải khát thuộc phạm vi nghiên cứu của đề tài. Các tiêu chuẩn này được trình bày ở Bảng 1.5. Bảng 1.5. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát Nước khoáng Nước không Nước Chỉ tiêu thử nghiệm đóng chai có cồn có cồn Tổng vi khuẩn hiếu khí/g GMP/250ml 102 5.104 Coliforms/g 0/250ml 10 102 E. coli/g KQĐ 0 0 S. aureus/g KQĐ 0 10 Clostridium 0/250ml 0 10 perfringens/g Salmonella/25g KQĐ KQĐ 0 Nấm men, mốc/g KQĐ 10 KQĐ Nguồn: [2] 1.1.5.2. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm đối với nhóm sữa Có rất nhiều loại sữa khác nhau hiện đang bán trên thị trường, tuy nhiên, chúng tôi chỉ đề cập đến chỉ tiêu vi sinh của Bộ Y tế đối với các sản phẩm được chế biến từ sữa và nhóm sữa chua. Các chỉ tiêu này được trình bày ở Bảng 1.6 và Bảng 1.7.
Bảng 1.6. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm các sản phẩm chế biến từ sữa Chỉ tiêu thử nghiệm Bơ, phomát Sữa tươi Sữa hoàn nguyên tuyệt trùng tuyệt trùng Vi khuẩn hiếu khí/g 104 5.104 10 Coliforms/g 10 10 0 E. coli/g 0 3 0 S. aureus/g 0 KQĐ 0 Salmonella/25g 0 0 0 C. perfringens/g KQĐ KQĐ 0 Nguồn: [2] Bảng 1.7. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm sữa chua Sữa chua (Yoghurt) Sữa chua (Yoghurt) có Chỉ tiêu thử nghiệm không xử lí nhiệt xử lí nhiệt Vi khuẩn hiếu khí/g 104 10 Coliforms/g 10 0 E. coli/g 0 0 S. aureus/g 0 0 Salmonella/25g 0 0 Nấm men, mốc/g 10 10 Nguồn: [2] 1.1.5.3. Tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm đối với kem, nước đá Các chỉ tiêu vi sinh hiện diện ở nhóm kem, nước đá theo quy định của Bộ Y tế được trình bày ở Bảng 1.8. Bảng 1.8. Tiêu của Bộ Y tế đối với nhóm kem, nước đá Chỉ tiêu thử nghiệm Kem, nước đá Tổng vi khuẩn hiếu khí/g 5.104 Coliforms/g 102 E. coli/g 0 S. aureus/g 10