Đồ án tốt nghiệp: Góp phần xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:74

Thêm vào BST

Báo xấu

59
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập, thu thập vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase từ nhiều nguồn; định danh các chủng vi khuẩn; kiểm tra hoạt tính enzyme lactase của những chủng vi sinh vật phân lập được; bước đầu bảo quản giống vi khuẩn có hoạt tính lactase. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Góp phần xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GÓP PHẦN XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP LACTASE Ngành : Công nghệ Sinh học Mã ngành : 111 GVHD : PGS TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH : PHẠM NGUYÊN HIẾU MSSV : 0851110082 Lớp : 08DSH2 -Tp.HCM, tháng 7 năm 2012-
Chương 1 MỞ ĐẦU Xu hướng của con người ngày nay là quay về sử dụng các sản phẩm mang tính thiên nhiên, khai thác những kinh nghiệm cổ truyền kết hợp với kỹ thuật hiện đại và hạn chế tối đa việc đưa hoá chất vào cơ thể. Đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm có bổ sung các chủng vi sinh vật giúp con người tăng cường sức đề kháng, cải thiện hệ tiêu hoá và giúp chống lại rất nhiều bệnh tật phát sinh từ bên trong cơ thể. Tuy nhiên các sản phẩm thực phẩm này không phải là thuốc, mà được xếp vào nhóm thực phẩm chức năng. Chính vì những lợi ích trên và theo quan điểm phòng bệnh hơn chữa bệnh, ở các nước phát triển có xu hướng sử dụng các loại thực phẩm có lợi ích cho sức khỏe nhiều hơn là sử dụng thuốc điều trị. Sữa là thực phẩm chính của trẻ em và người già, do thói quen không sử dụng sữa nên enzyme lactase bị mất dần, dẫn đến bệnh không dung nạp lactose. Sự thiếu hụt lactase phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới. Trong cơ thể người, lactase hoạt động khoảng năm năm. Ở Bắc Châu Âu và những người sống ở phía Tây Bắc của tiểu lục địa Ấn Độ, lactase có xu hướng bảo tồn ở người lớn, do việc sử dụng các sản phẩm từ sữa như pho mát trong suốt mùa đông khi nguồn cung cấp lương thực có thể bị hạn chế. Chúng ta có thể kết luận rằng việc thiếu hụt lactase (được gọi là không dung nạp lactose hoặc alactasia) không phải là một bệnh, nhưng sự tồn lưu của lactase vào tuổi trưởng thành là sự thích ứng sinh học với việc sử dụng các sản phẩm từ sữa. Lactase là một enzyme được tìm thấy ở mép của ruột non. Nó phân hủy lactose thành đường glucose và galactose. Tần số thiếu hụt lactase trên toàn thế giới khác nhau. Mức độ lactase trong ruột và các triệu chứng không có sự hòa hợp. Hình ảnh điển hình là khó chịu ngay sau khi dùng sữa hoặc các sản phẩm từ sữa. Điều này có thể thấy từ việc bị đau bụng, buồn nôn, cảm giác đầy hơi ngắn, nhanh, chảy nước mắt và tiêu chảy [57]. Khi bị tiêu chảy, các tác nhân gây bệnh hoặc độc tố của chúng gây tổn thương niêm mạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị mất đi, và hậu quả là 1
đường lactose không tiêu hoá được tích luỹ trong lòng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy [57]. Ngoài ra, trình trạng kém hấp thu lactose do bệnh đường tiêu hóa tại một số quốc gia là khá chính xác, có thể gây kém hấp thu lactose - hội chứng ruột ngắn, kém hấp thu đường galactose bẩm sinh. Trong thực tế, trạng thái bất thường hoặc sai lệch là việc duy trì hoạt động lactase trong suốt giai đoạn trưởng thành. Có 3 nguyên nhân cơ bản dẫn đến bất dung nạp lactose: (A) nguyên phát, (B) thứ phát, (C) bẩm sinh [58]. (A) Nguyên phát: Đây là nguyên nhân thường gặp nhất của bất dung nạp lactose do thiếu lactase tương đối, xuất hiện ở trẻ em vào những độ tuổi khác nhau trong những nhóm chủng tộc khác nhau. (B) Thứ phát: Do tổn thương ruột non sau viêm dạ dày ruột do siêu vi (Rotavirus), trẻ bị bất dung nạp lactose thoáng qua, có thể hồi phục sau khi vấn đề bệnh viêm dạ dày ruột đã được giải quyết hoặc trẻ bị tiêu chảy kéo dài dẫn đến niêm mạc ruột tổn thương, men lactase không sản sinh đủ nên cơ thể trẻ không thể hấp thu được lactose dẫn đến triệu chứng bất dung nạp. Khi ấy sẽ khiến cho tình trạng tiêu chảy kéo dài và trầm trọng hơn là trẻ bị suy dinh dưỡng. Khi trẻ bị suy dinh dưỡng thì lượng men lactase càng giảm, vì vậy suy dinh dưỡng và tiêu chảy là vòng luẩn quẩn khó giải quyết. (C) Bẩm sinh: Nguyên nhân này rất hiếm gặp, biểu hiện ngay sau sinh do rối loạn nhiễm sắc thể, gây ngăn cản sản xuất men lactase. Trong hệ tiêu hóa của chúng ta có một hệ vi sinh vật với số lượng rất lớn, trong đó có hơn 400 loài vi sinh vật khác nhau (Melissa peterson et al., 2002), chúng được xếp vào 2 loại: vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật có ích. Các loài vi sinh vật sống chung với nhau tạo thành hệ sinh thái ổn định, cân bằng và là hàng rào bảo vệ, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh đường ruột cũng như duy trì một số hoạt động chuyển hóa của cơ thể. Vi sinh vật có ích càng nhiều thì cơ thể càng khỏe mạnh. Để tăng dung nạp lactose trong sữa, lý tưởng nhất là tăng sinh tổng hợp được enzyme này ngay trong cơ thể người. Tuy nhiên con đường này rất khó khăn. Enzyme từ nguồn vi sinh vật vẫn là nhu cầu trước mắt. Do đó lựa chọn nguồn 2
enzyme vi sinh là hiệu quả hơn tuy nhiên phải chọn loại enzyme có hoạt động pH tối ưu tương tự như sữa để tránh hiện tượng đông tụ sữa. Trên thế giới, lactase được nghiên cứu khá đầy đủ và sản phẩm lactase thương mại hiện nay chủ yếu là sản xuất từ nấm men. Các loài nấm men như Kluyverromyces lactics, Kluyverromyces marxianus, Torulopsis spherical, Torulautilis sp, Saccharomyces fragilis, Candida pseudotropicalis. Ngoài ra lactase còn được sản xuất từ: vi khuẩn (chủ yếu là Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactoccoccus, Bacillus và vi khuẩn Gram âm là E.coli ), nấm sợi (Trichoderma sp, Fusarium sp, Asperigillus sp)… Trong khi ở Việt Nam, việc nghiên cứu enzyme lactase chưa thật sự được quan tâm và còn nhiều hạn chế. Đề tài: “Góp phần xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase” - Phân lập, thu thập vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase từ nhiều nguồn. - Định danh các chủng vi khuẩn. - Kiểm tra hoạt tính enzyme lactase của những chủng vi sinh vật phân lập được. - Bước đầu bảo quản giống vi khuẩn có hoạt tính lactase. 3
Chương 2 TỔNG QUAN 2.1. Enzyme lactase 2.1.1. Lactose Lactose (β-D-galactopyranosyl –(1Æ 4)-α-D-glucopyranose) là đường đôi có ở động vật có vú, ngoại trừ một vài loài, nồng độ trong khoảng 2 – 10%. Hàm lượng lactose trung bình ở sữa bò khoảng 4,8%, khoảng 4,4 – 5,2% (theo Ganzle, 2008). Trong quá trình sản xuất phomai, phần lớn lactose trong sữa có trong dịch whey. Khác với trước đây, whey không được xem như phụ phẩm. Ngày nay, whey được sử dụng hiệu quả hơn. Whey có thể được sấy khô để sản xuất các loại bột whey khác nhau hoặc phân đoạn bằng kỹ thuật lọc màng để sản xuất sản phẩm whey protein và phần đi qua màng giàu lactose (theo Fox 2009; Lifran, 2009). Lactose là một loại đường có nhiều trong sữa. Để cơ thể hấp thu được thì đường lactose phải được phân tách thành đường glucose và galactose trước. Quá trình này xảy ra ở phần trên của ruột non bởi men lactase. Vì thế, bất dung nạp đường lactose thật ra là trong cơ thể chúng ta thiếu men lactase để chuyển lactose thành hai loại đường như đã trình bày trên. Nếu thiếu men lactase ở ruột non thì đường lactose không được phân tách và sẽ không được hấp thu vào máu mà bị tồn đọng ở ruột, dẫn đến những rối loạn tiêu hóa, gọi là bất dung nạp đường lactose. Đây là nguyên nhân làm cho ta không uống được sữa. Nhiều người nhầm lẫn giữa bất dung nạp đường lactose và dị ứng sữa. Bản chất của dị ứng sữa là do hệ miễn dịch của cơ thể phản ứng với protein có trong sữa dẫn đến những rối loạn. Lactase được mã hóa bởi một locus gen trên nhiễm sắc thể số 2, thể hiện độc quyền trong ruột động vật có vú nhỏ, và ở mức độ rất thấp trong ruột kết của quá trình phát triển thai nhi. Con người được sinh ra với mức lactase cao. Sau khi cai sữa gen sinh tổng hợp lactase ở trạng thái bất hoạt vì vậy lactase trong ruột non giảm. Việc giảm lactase đồng nghĩa với việc gây ra các triệu chứng phổ biến như không dung nạp hypolactasia hoặc không dung nạp lactose. 4
Bất dung nạp đường lactose không liên quan đến hệ miễn dịch, chỉ vì cơ thể chúng ta thiếu lactase để tiêu hóa lactose vì thế lactose bị tống ra ngoài dưới dạng tiêu chảy. Ở người, vấn đề khó khăn trong tiêu hóa lactose tăng theo lứa tuổi, ở độ tuổi thanh thiếu niên chiếm khoảng 70% số thanh thiếu niên thế giới (Paige 2005). Enzym thương mại có xu hướng phát triển mạnh, β-galactosidase cho phép sản xuất sản phẩm chứa hàm lượng lactose thấp (Gekas và Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama và Amach 1999; Rehman 2009). Khi đó, lactose ít hòa tan và ít ngọt, sự thủy phân lactose làm giảm các tinh thể lactose ở các sản phẩm giàu lactose trong quá trình bảo quản và làm tăng độ ngọt (Gekas và Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama và Amachi 1999; Rehman 2009). 2.1.2. Lactase và chức năng Enzyme thủy phân lactose có tên lactase thuộc nhóm β-galactosidase (E.C.3.2.1.23). Enzyme này có hoạt tính chủ yếu là thủy phân liên kết β 1-4 glucosidic của phân tử đường đôi lactose để tạo thành 2 phân tử đường đơn có độ ngọt cao hơn đường lactose. Do vậy, enzyme lactase chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp các sản phẩm từ sữa để giảm hàm lượng lactose, một thành phần cacbonhydrat chính trong sữa mà phần lớn người trưởng thành có khả năng dung nạp rất kém và đặc biệt một số ít người lớn kể cả trẻ sơ sinh có dị ứng mạnh với đường lactose. Hơn nữa, phân tử lactose dễ dàng bị kết tinh dạng hạt cát ở nhiệt độ lạnh nên gây khó khăn cho sản xuất một số sản phẩm sữa lạnh như kem, vì vậy người ta sử dụng enzyme này để giảm hàm lượng lactose đồng thời tăng độ ngọt của sản phẩm nhờ các đường đơn tạo thành [49]. Enzyme lactase trong một số trường hợp còn có hoạt tính transgalactosyl hóa, trước tiên enzyme phá vỡ liên kết β 1-4 glucosidic tạo thành galactosyl và sau đó chuyển cho phân tử một hợp chất chứa nhóm hydroxyl. Do vậy người ta đã sử dụng hoạt tính này để tổng hợp galactooligosaccharide, có hoạt tính dược học [49]. Lactase có thể được tìm thấy ở nhu động ruột non người và động vật, trong một số thực vật (dưa hấu, trái mơ…) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm sợi). Tùy theo nguồn gốc lactase sẽ có kích thước phân tử khác nhau, các chuỗi peptide (tiểu phần theo cấu trúc bậc 4) dài ngắn và số lượng cũng rất khác nhau. Mặc dù vậy 5
nhưng chuỗi peptide chính mang hoạt tính lactase thông thường có trọng lượng phân tử khoảng 120kDa và chứa tâm xúc tác và tâm này có cấu trúc tương tự giữa các loài (được bảo tồn qua tiến hóa) và trong đó là vai trò không thể thay thế của các “tay” Glu trong phản ứng xúc tác axit – base hoặc tấn công vào nhân [49]. Hình 2.1. Enzyme lactase ở ruột non người [53]. Hoạt tính phân hủy lactose được xác định bằng 2 cách, hoặc là thông qua sự mất đi của cơ chất là lactose, hoặc là thông qua sự tạo thành của sản phẩm đặc trưng do phá vỡ liên kết glycosidic, thông thường dùng cơ chất đặc hiệu ONPG (o- nitrophenyl-β-D-glucoside) và xác định lượng ONP (o-nitrophenyl) tạo thành [49]. Các lactase khác nhau có dải hoạt động pH từ axit yếu đến trung tính từ khoảng 4.0 – 6.5 tùy thuộc vào nguồn gốc. Lactase của nấm sợi có pH hoạt động gần axit hơn, còn lactase của các vi khuẩn và nấm men ưa pH gần trung tính hơn [49]. Bảng 2.1. Một số đặc trưng của chuỗi peptide đóng vai trò xúc tác trong enzyme lactase ở một số loài vi sinh điển hình Nguồn gốc enzyme K.lactic E.coli E.coli A.niger Trọng lượng phân tử 117618 116351 118016 119160 Chiều dài 1025 1023 1031 1006 Nguyên tử proton Glu482 Glu461 Glu449 Glu200 Nucleophile/bazơ Glu551 Glu537 Glu512 Glu298 [49] 6
Phần lớn lactase hoạt động trong khoảng nhiệt độ 35-450C (ưa nhiệt độ trung bình), một số khác từ 45-650 C (ưa nhiêt), dạng cá biệt có lactase hoạt động xúc tác ở nhiệt độ lạnh 40C. Dưới đây là tổng hợp một số đặc tính của lactase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau (Bảng 2.2). Đặc biệt một số enzyme đòi hỏi ion kim loại để hoạt hóa [49]. Người và động vật có khả năng dung nạp lactose là do trong thời kỳ trẻ mới sinh, ruột non có khả năng tổng hợp lactase để tiêu hóa lactose trong sữa mẹ, thành phần chính cho trẻ sinh trưởng. Đến tuổi trưởng thành các gen này hầu như ngưng hoạt động do vậy cơ thể tiêu hóa lactose rất kém. Điều này cũng đúng cho động vật. Nghiên cứu chỉ ra rằng sự dung nạp latose có thể được hỗ trợ bởi hệ vi sinh niêm mạc ruột non, trong đó có vai trò của các vi sinh vật lên men lactose như Lactococcus và Bifidobacterium. Đây chính là cơ sở của việc đưa các vi sinh vật này vào một số dòng sản phẩm sữa chua uống có men sống để hỗ trợ tiêu hóa [49]. Bảng 2.2. Một số đặc trưng của enzyme lactase ở một số loài vi sinh điển hình Giá trị pH Giá trị nhiệt Trọng Hoạt hóa ion. Nguồn lượng Chú Chú thích Tối ưu độ tối ưu phân tử khác A.niger 3,0-4,0 55-60 124 A.oryzae 5,0 50-55 90 Mn+2 , K+ K.fragilus 6,9-7,3 37 201 Mn+2 , Na+ K.lactic 7,2 35 135 K+ , Na+ E.coli 6,2-7,1 40 540 L.thermophilus 3,4-4,3 55-57 530 C.inaegualis 6,0 30-55 Hoạt động cao B.circulans 6,8 60-65 ở sữa không béo Bacillus sp 6,5-7,5 65 L.bulgaricus 42-45 S.thermophilus 55 500-600 [49] 7
2.1.3. Cơ chế, cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp Lactase có thể thủy phân một loạt các chất nền. Trong đó đáng chú ý nhất là lớp enzyme β –galactosidase, lactase cũng có glucosidase và glycosylceramidase hoat động. Trong quá trình trao đổi chất, β-glycosidic trong D-lactose thủy phân để tạo thành D-galactose, D-glucose, có thể được hấp thu qua thành ruột vào máu. Phản ứng xúc tác lactase tổng thể là : C 12 H 22 O 11 + H 2 O → C 6 H 12 O 6 + C 6H 12 O 6 + Q Lactase cũng xúc tác chuyển đổi phlorizin phloretin và glucose. Cơ chế xúc tác thuỷ phân lactose D – giữ lại cấu hình chất nền anomeric trong các sản phẩm. Trong khi các chi tiết của cơ chế là không chắc chắn, để đạt được phải thông qua một phản ứng chuyển đổi. Các nghiên cứu về lactase của vi khuẩn E.coli đã đề xuất rằng: quá trình thủy phân được bắt đầu khi một tác nhân nucleophin glutamate tấn công enzyme từ phía bên trục carbon galactosyl của β-glycosidic. Vì Mg phụ thuộc vào axit xúc tác nên việc loại bỏ các nhóm rời D-glucose có thể được thuận lợi, enzyme được giải phóng từ phân nửa α-galactosyl khi tấn công nucleophin sẽ sản xuất D- galactose. Hình 2.2. Cơ chế thủy phân lactose [54]. Các nghiên cứu về chất nền đã chứng minh rằng 3’-OH và 2’-OH trên vòng galactopyranose là rất cần thiết để thủy phân enzyme. Nhóm 3'- hydroxy được tham gia ngay từ ban đầu trong khi nhóm 2’ là không cần thiết, nhưng cần thiết trong các bước tiếp theo. Điều này được chứng minh bởi thực tế rằng 2-deoxy là một chất ức 8
chế cạnh tranh hiệu quả (K i= 10mM), loại bỏ các nhóm hydroxyl trên phân nửa glucopyranose, không hoàn toàn loại bỏ chất xúc tác. Pre-pro-lactase có cấu trúc polypeptide chính duy nhất bao gồm 1927 axit amin chia thành 5 nhánh: (1) 19 amino axit chia tín hiệu theo thứ tự, (2) chuỗi miền lớn không hiện diện lactase ở giai đoạn trưởng thành, (3) các phân khúc lactase ở giai đoạn trưởng thành, (4) một mảng trải dài kị nước, (5) một đoạn ngắn ưa nước ở cacboxyl cuối. Chuỗi tín hiệu được phân tách trong lưới nội chất, pro-LHP đạt chiều dài 215kDa được chuyển sang bộ máy Golgi, nơi có nhiều glycoxyl hóa và protein thủy phân. Các prodomain được hiển thị để hoạt động như một chaperone intramolecular trong ER, ngăn ngừa sự phân tách trypsin và cho phép LPH áp dụng các cấu trúc 3-D cần thiết để vận chuyển đến bộ máy Golgi. Hình 2.3. Quá trình sản sinh lactase ở người [54]. 2.1.4. Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Lactase được sinh tổng hợp bởi một số loại nấm men (Kluyverromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Torulautilis sp, Torulopsis spherica, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis). Ngoài ra, còn có các vi khuẩn Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, nhóm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, chủng Escherichia coli Nissle 1917. Bên cạnh đó thì nấm sợi cũng được quan tâm nhiều (Trichoderma sp, Aspergillus sp, Fusarium sp) nhưng loài Aspergillus sp được nghiên cứu nhiều hơn cả. Tuy nhiên quá trình tổng hợp lactase ở cả quy mô nghiên cứu và quy mô sản xuất chủ yếu là từ nấm men Kluyveromyces và vi khuẩn lactic. Các enzyme lactase được sinh tổng hợp bao gồm cả ngoại bào và nội 9
bào, loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt, đặc biệt loại lactase chịu lạnh để ứng dụng trong làm kem. Sử dụng lactase (cố định hoặc tự do) chủ yếu để sản xuất sữa tươi và sữa bột không chứa (hoặc chứa rất ít) lactose hoặc sinh tổng hợp các hợp chất galacto-ooligosaccharides. Bảng 2.3. Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Nấm men Vi khuẩn Nấm sợi Kluyverromyces lactic Lactobacillus acidophilus Aspergillus sp Kluyveromyces maxianu Lactobacillus sp Aspergillus niger Kluyveromyces sp Lactococcus lactic Aspergillus oryzea Torulopsis spherical Bacillus subtilis Aspergillus candidus Torulopsis Bacillus curculans Fusarium sp pseudotropicalis Streptococcus salivarius Fusarium moniliforme Torulautilis sp Streptococcus Trichoderma sp Saccharomyces fragilis thermophilus Trichoderma reesei Rut-C30 Candida pseudotropicalis E.coli Zygosaccharomyces lactic [49] Những tế bào niêm mạc ở phần trên của ruột non (là những tế bào sản xuất ra men lactase) bị tổn thương. Hiện tượng này hay gặp ở trẻ em và thường xảy ra sau khi bị tiêu chảy, viêm dạ dày ruột hoặc có thể do hóa trị liệu. Khi trẻ bị tiêu chảy, các tác nhân gây bệnh hoặc độc tố của chúng gây tổn thương niêm mạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị mất đi, và hậu quả là đường lactose không tiêu hoá được tích luỹ trong lòng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy và bệnh ngày càng trầm trọng hơn. Thống kê cho thấy 50% -70% trẻ em nhập viện do tiêu chảy nặng có biểu hiện bất dung nạp lactose. Lactose là đường chủ yếu có trong sữa mẹ và các sữa công thức. Lactose là nguồn cung cấp đường glucose cho sự hoạt động của não và cơ thể, làm phân mềm, tạo sự vượt trội của các Bifidus và Lactobacillus là những vi khuẩn 10
có lợi giúp cho sự phát triển hệ miễn dịch và tiêu hoá trong cơ thể trẻ. Men lactase ở màng ruột là men tiêu hoá biến đường lactose trở thành đường glucose. Khi trẻ bị tiêu chảy cấp, màng ruột bị tổn thương bởi vi khuẩn, virút hoặc độc tố của chúng sẽ làm thiếu men lactase. Do thiếu men lactase làm đường lactose không tiêu hoá được trong ruột gây bất dung nạp lactose. Đường lactose không được tiêu hoá sẽ ứ đọng lại trong ruột, hút nước làm tiêu chảy tăng thêm và kéo dài. Trường hợp này gọi là thiếu lactase thứ phát, khác với thiếu men lactase tiên phát thường xuất hiện ngay sau khi trẻ sinh và rất hiếm gặp (chỉ 1 trong số 1000 trẻ). Bất dung nạp lactose thứ phát thường kéo dài trong 1-2 tuần nhất là ở trẻ tiêu chảy kéo dài. Hậu quả là trẻ bị suy dinh dưỡng nặng, kém ăn cộng thêm tập quán kiêng ăn làm chậm hồi phục niêm mạc ruột. Bất dung nạp lactose có thể gặp trong những trường hợp tiêu chảy do nhiễm vi khuẩn, virút, đặc biệt tiêu chảy do Rota virút, dị ứng sữa bò… là những bệnh lý rất thường xảy ra ở trẻ nhỏ dưới 3 tuổi [57]. 2.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB) 2.2.1. Khái niệm Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có sự thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, axit lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong các thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một số chủng LAB có thể sinh bacteriocin ức chế sinh vật gây bệnh (Klnhammer, 1987). Hơn nữa, axit lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần làm tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm. Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), do được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người. 11
Theo bản phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc oval) và hình que, trong đó các giống sau đây là chủ yếu nhất: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leucnostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae, một nhóm vi khuẩn Gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic. Hình 2.4. Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic [26]. Chú ý: - Khoảng cách tiến hóa gần nhau - Trong đó nhóm được đóng khung được xem là nhóm vi khuẩn an toàn Việc phân loại vi khuẩn axit lactic chỉ khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất axit lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được axit hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần axit béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại. 12
2.2.2. Đặc tính chung Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase âm tính và là vi khuẩn vi hiếu khí (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, pepton và axit. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành axit lactic trong môi trường, và sức chịu axit (hay độ bền axit) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit lactic cao hơn (khoảng 2-3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8-4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5-6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25-350C, ưa nhiệt là 40-450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C. Khi gia nhiệt khoảng 6-800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10÷30 phút. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, nước, không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (trên các loại rau, quả, sữa, thịt…). Mặc dù cơ chế vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên LAB được cho là có một số hiệu ứng có lợi cho chức năng miễn dịch. LAB có thể bảo vệ chống lại các mầm bệnh bằng các phương tiện của sự ức chế cạnh tranh, đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr và Martha, 2003) tăng số lượng tế bào plasma sản xuất IgA – kháng thể chính trong chất nhầy cơ thể, hoạt hóa các đại thực bào cũng như tăng tỷ lệ T lympho (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002), kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (mặc dù chưa có cơ chế cụ thể) (O'Toole và Cooney, 2008). 13
Cụ thể như Lacticin 3147 do Lactococcus lactis sinh ra có tác dụng diệt khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào. Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K + và phốt phát vô cơ đi ra khỏi tế bào. Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên trong. Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì những chức năng quan trọng của tế bào như gradient pH tại màng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết. Trong đó bacteriocin có bản chất là các peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng cho con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase. Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacteriocin của vi khuẩn lactic có thể phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản nhưng nó còn dựa trên kiểu hoạt động của chúng. Bacteriocin class I (đại diện: nisin của Lactococcus lactis) gắn vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, đo đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do bám được vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; bacteriocin class II (đại diện sakacin của Lactobacillus sake) là các peptide lưỡng tính có khả năng xuyên màng tế bào tạo kênh/lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin) – protein không bền nhiệt, tác động trực tíêp lên vách tế bào đích (Riley và Chavan, 2007), (Cotter et al., 2005). Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Ở những phần khác nhau của hệ tiêu hóa thì tồn tại các vi khuẩn khác nhau. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có VSV chứa lactase, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn. Giảm thiểu tiêu chảy do kháng sinh: Nguyên nhân là do kháng sinh làm mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột và khi đó Clotridium difficle và Klebsiela oxytoca tăng lên nhanh chóng và giải phóng độc tố gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu để chữa bệnh tiêu chảy do kháng sinh, kết quả cho thấy chủng S. bolardii, 14
S. boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng L. acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thì mang lại hiệu quả (D'Souza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006). Tính hiệu quả của phòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng VSV được sử dụng và liều lượng, có thể giảm đến 50% mức độ của bệnh. Các loại thực phẩm bổ sung LAB được dùng điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp, giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em và tiêu ở người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002). Những lợi ích của chủng LAB là ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, một biến chứng thường gặp khi dùng kháng sinh. Thuốc kháng sinh được cho là làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái "tắt" trong khi LAB lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch và nhiều hơn nữa có thể nhanh chóng phản ứng với lây nhiễm mới. 2.2.3. Đặc điểm hình thái một số chủng LAB Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài. 2.2.3.1. Giống Lactobacillus Phân loại khoa học: (Beijerinck, 1901) Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống : Lactobacillus 15
Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như : L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus … Hình 2.5. Lactobacillus sp [52]. Đặc điểm: Tế bào có dạng hình que thường dài và thon, không di động, Gram dương, hiếm khi tạo sắc tố (màu gỉ sắt và màu đỏ gạch). glucose, các aldehydic hexose tương tự, cacrbohydrate là đường đơn và các rượu đa chức được chuyển hóa bằng con đường lên men lactic đồng hình và cả dị hình tạo ra axit lactic, axit acetic, rượu và CO2. Không có khả năng chuyển hóa nitrate, trừ loài L. plantarum khi ở điều kiện nhất định. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao. Kỵ khí không bắt buộc, không tạo ra catalase, không hóa lỏng gelatin, không phân hủy casein nhưng vài chủng có thể tạo một lượng nhỏ đạm hòa tan. Không tạo indole và H2S. Tế bào còn non cho kết quả Gram dương và trở thành Gram âm khi đã già. Không có khả năng di động. Được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa. Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men đồng hình: Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. plantarum, L. casei… Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình: Lactobacillus brevis, L. pentoaceticus, L. lycopersici, L. fermenti… 16
2.2.3.2. Giống Streptococcus Phân loại khoa học: (Rosenbach, 1884) Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Streptococcaceae Giống : Streptococcus Gồm các loài: S. agalactiae, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. equi, S. iniae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S. peroris, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S. salivarius ssp thermophilus, S. sanguinis… Hình 2.6. Streptococcus [52]. Đặc điểm: Có dạng hình tròn hoặc hình trứng (ovan), ít khi kéo dài thành dạng que. Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn, là loại vi khuẩn không nha bào, Gram dương, không di động, và thường không tạo sắc tố, vỏ tế bào của một số loài có thể nhận thấy trong điều kiện nhất định, đường kính tế bào 0.5-1µm. 17
Trong môi trường lỏng, sinh khối có thể có dạng nhám có dạng hạt và nổi trên mặt nước hoặc là dạng mịn gây đục môi trường. Trên môi trường agar, khuẩn lạc thường nhỏ hơn 1mm, trong cùng 1 loài có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng mịn và tạo chấy nhầy, bề mặt khuẩn lạc lồi. Sau khi lên men đường, sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một lượng đáng kể ethanol, axit acetic, axit formic…khi lên men glucose trong môi trường có tính kiềm (Gunsalus và Niven, 1942). Không có khả năng chuyển nitrate thành nitrite, kị khí không bắt buộc, không sống được trong môi trường với 10% muối mật, những chủng phân hủy protein chỉ có trong nhóm enterococcus. Tất cả các chủng trong Streptococcus đều có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp, một số loài có nhu cầu về vitamin B và các amino axit trong khi số khác có nhu cầu về các axit béo không no và gia tăng lượng CO2. Vì vậy nhu cầu về dinh dưỡng cũng giúp ích trong việc xác định một loài. (Dubos, 1948). Sự phân loại các loài thuộc Streptococcus được đề nghị bởi (Sherman, 1937). Theo đó, chúng được chia ra thành 4 nhóm: nhóm sinh mủ (pyogenic), viridans, Enterococcus và nhóm lactic. Sự phân chia này dựa trên các đặc điểm sinh lý đặc trưng tương ứng với mỗi nhóm, đặc biệt là khoảng nhiệt độ phát triển. Tuy nhiên với các loài mới được công nhận làm cho đặc điểm mỗi nhóm trở nên ít khác biệt nhau vì chúng cùng lúc mang nhiều đặc điểm của hơn 1 nhóm. Ví dụ: Streptococcus tiberis Diernhofer thuộc nhóm viridans, nhưng nó lại mang những đặc điểm mà ta có thể đặt nó vào nhóm Enterococcus. Trong khi Streptococcus acidominimus Ayers và Mudge cũng thuộc nhóm viridans nhưng cũng có thể xem như thuộc nhóm pyogenic. Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình: Steptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophillus, Streptococcus salivarius sub sp thermophilus… Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình: Streptobacterium brassicae fermentati… 2.2.3.3. Giống Leuconostoc Phân loại khoa học: (Van Tieghem, 1878) emend. (Hucker và Pederson, 1930).(Orla-Jensen, 1919). 18
Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Leuconostocaceae Giống : Leuconostoc Gồm các loài như: L. carnosum, L. citreum, L. durionis, L. fallax, L. ficulneum, L. fructosum, L. garlicum, L. gasicomitatum, L. gelidum, L. inhae, L. kimchii, L. lactis… Hình 2.7. Leuconostoc [50]. Đặc điểm: Leuconostoc có tế bào thường có dạng hình cầu hay oval đơn lẻ, cặp đôi hay dạng chuỗi ngắn. Trong môi trường nhất định như nước trái cây hoặc rau quả có tính axit, tế bào có thể kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que. Một số loài tạo chất nhờn đặc trưng khi sống trong môi trường chứa sucrose. Đối với môi trường bình thường, sự tăng trưởng được kích thích nhờ việc bổ sung cao nấm men, nước chiết cà chua hoặc rau củ. Leuconostoc là một loài ky khí không bắt buộc. Khi lên men tạo ra một lượng hạn chế axit lactic. L-lactic axit luôn được tạo ra và đôi khi cũng xuất hiện D-lactic axit. Axit acetic và rượu cũng được tạo thành và khoảng ¼ lượng glucose lên men được chuyển thành CO2. 19