Dự án tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu luận án là phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam. Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự án tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Phạm Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG LÚA CHUYỂN GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 (DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2017
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Xuân Hội Phản biện 1: ............................................. Phản biện 2: ............................................. Phản biện 3: ............................................. Luận án sẽ đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi......giờ......., ngày.......tháng.......năm 2017. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Dƣới tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, là nguyên nhân chính làm giảm sản lƣợng cây trồng. Trong khi đó, dân số toàn cầu tăng nhanh, ƣớc tính năm 1950 sẽ tăng lên 9 tỷ ngƣời, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến an ninh lƣơng thực, tạo ra một áp lực lớn cho việc đảm bảo lƣơng thực. Vì vậy, an ninh lƣơng thực là vấn đề then chốt của nền khoa học nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lƣơng thực quan trọng nhất của con ngƣời. Trên thế giới, cây lúa đƣợc xếp vào vị trí thứ 2 sau cây lúa mì về diện tích và sản lƣợng. Ở Việt Nam, một đất nƣớc từ lâu đời đã gắn liền với nền văn minh lúa nƣớc, vai trò cây lúa đặc biệt quan trọng. Cây lúa đóng vai trò chính trong sản xuất lƣơng thực, đóng góp sản lƣợng cao nhất (60%) và đƣợc canh tác với diện tích lớn nhất (xấp xỉ 3,8 triệu ha). Chính vì vậy, việc tạo ra các giống lúa có năng suất cao, đồng thời chống chịu đƣợc với điều kiện bất lợi ngoại cảnh đặc biệt là hạn có ý nghĩa quan trọng đối với việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia. Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phƣơng pháp lai tạo, chọn giống truyền thống nên hiệu quả đạt đƣợc không thực sự cao. Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng nhƣ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến... tuy đã đạt đƣợc một số kết quả nhất định nhƣng vẫn có những hạn chế. Phƣơng pháp chuyển gen ra đời đƣợc ví nhƣ “chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn 1
gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng đƣợc kết hợp với nhau. Với hƣớng nghiên cứu này, các gen quy định những tính trạng quan tâm đƣợc chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra các giống lúa mang các đặc tính nhƣ mong muốn của con ngƣời. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen mà sự biểu hiện của mỗi gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Vì vậy, nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã tham gia điều khiển quá trình phiên mã đang là trọng tâm trong các nghiên cứu chọn tạo giống nhằm tăng cƣờng tính chống chịu của cây trồng với điều kiện hạn. Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật. Nhiều nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã vào lúa đã đƣợc chứng minh tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen. Nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC (tên gọi đƣợc bắt nguồn từ tên gọi của ba protein đầu tiên đƣợc phát hiện có chứa vùng NAC là NAM - no apica meristem, ATAF - trancription activation factor và CUC - cup shaped cotyledon) là họ nhân tố phiên mã lớn nhất đặc trƣng của thực vật. Nhân tố phiên mã NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý, sinh hóa khác nhau trong tế bào, bao gồm các quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp và đáp ứng chống chịu stress môi trƣờng nhƣ hạn, mặn và lạnh của tế bào. Một số gen đáp ứng stress thuộc nhóm NAC ở lúa nhƣ SNAC1/OsNAC9, SNAC2/OsNAC6, OsNAC5 và OsNAC10 đã đƣợc chứng minh có liên quan tới quá trình đáp ứng hạn ở cây lúa. Cây lúa chuyển gen 2
SNAC1/OsNAC9, OsNAC5 và OsNAC10 có khả năng kháng hạn và năng suất cao hơn so với cây không chuyển gen. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Nghiên cứu tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan đến tính chịu hạn” với mục tiêu thu tạo ra các dòng lúa chuyển gen chống chịu hạn, đồng thời không gây ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển. Các kết quả thu đƣợc sẽ là nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, thiết kế vector chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam. Tạo dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC có khả năng chống chịu hạn. Đối tƣợng v nội dung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn của giống lúa Việt Nam. ác n i ung nghiên cứu ch nh  Nội dung 1: Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5, OsNAC10 liên quan đến tính chịu hạn từ giống lúa Việt Nam;  Nội dung 2: Thiết kế các cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 ở thực vật dƣới sự điều khiển của promoter liên tục (Ubiquitine, 35S)/ cảm ứng (Lip9, Rd29A).  Nội dung 3: Chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC1 vào lúa.  Nội dung 4: Đánh giá sinh trƣởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen. 3
Địa điểm nghiên cứu Luận án đƣợc thực hiện tại 2 địa điểm chính: ộ môn ệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam); Phòng Thí nghiệm tƣơng tác cây trồng - vi sinh vật thuộc Trung tâm nghiên cứu vì sự phát triển tại Montpellier, Pháp. Đóng góp mới của luận án Luận án đã phân lập đƣợc 3 gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC gồm OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ giống lúa bản địa Việt Nam. Luận án đã tạo đƣợc các hệ vector biểu hiện gen trong tế bào thực vật mang gen OsNAC1 đƣợc điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin và 35S) và promoter hoạt động cảm ứng (Lip9 và Rd29A). Luận án đã tạo đƣợc một số dòng lúa chuyển gen biểu hiện gen đích, sinh trƣởng bình thƣờng trong điều kiện không xử lý hạn và có khả năng chịu hạn tốt hơn cây đối chứng không chuyển gen. Ứng dụng thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra đƣợc các dòng lúa T 2 mang một bản sao của gen OsNAC1 ở dạng đồng hợp đặt dƣới sự điều khiển của promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress Lip9 và promoter hoạt động liên tục Ubiquitin. Cây chuyển gen có kiểu hình tƣơng đồng với cây đối chứng không chuyển gen (về khả năng sinh trƣởng, phát triển và năng suất) trong điều kiện bình thƣờng không có stress hạn, trong khi tỷ lệ sống sót cao hơn trong điều kiện xử lý stress hạn ở giai đoạn cây non và các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý, sinh hóa thể hiện khả năng chịu hạn cao hơn ở giai đoạn sinh sản trong điều kiện xử lý stress hạn. Đây là kết quả quan trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen OsNAC1 nói riêng và các gen mã hóa nhân tố phiên mã thuộc nhóm NAC liên quan tới đáp ứng stress nói chung trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn. Trên cơ sở 4
kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNAC1 do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, bông, đậu tƣơng… để tạo ra các giống cây chuyển gen kháng hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu ở Việt Nam. 2. Bố cục của luận án Luận án gồm 144 trang, bao gồm: Phần mở đầu (04 trang); Tổng quan tài liệu (42 trang); Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (15 trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (47 trang); Kết luận (02 trang); Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (22 trang) với 215 tài liệu gồm 2 thứ tiếng: tiếng Việt (11 tài liệu) và tiếng Anh (204 tài liệu); Phụ lục (7 trang). Luận án có 9 bảng, 27 hình. 5
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 1.1.1. Đặc điểm nông sinh học của cây lúa Oryza sativa Lúa Oryza sativa thuộc bộ Hòa thảo (Graminales), họ Hòa thảo (Graminaceae), chi Oryza. Chi Oryza phân bố rộng trên thế giới và có từ 19 – 23 loài, trong đó có loài Oryza sativa L (2n = 24) đƣợc trồng phổ biến ở khắp các nƣớc trên thế giới và tập trung chủ yếu ở châu Á. Loài Oryza gluberrima S. đƣợc trồng một diện tích nhỏ ở một số nƣớc thuộc châu Phi. 1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với ngành sản xuất lúa gạo Việt Nam là một trong số các quốc gia bị tác động nặng nề nhất bởi biến đổi khí hậu. Sự xuất hiện thƣờng xuyên của hạn hán tiếp tục đe dọa nghiêm trọng đến nền sản xuất lúa gạo trong nƣớc. Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa gạo trên thị trƣờng thế giới do Việt Nam là một trong những nƣớc xuất khẩu gạo quan trọng nhất trên thế giới. 1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn tới đặc điểm chịu hạn cuả cây lúa Hạn hán luôn là mối đe dọa nghiêm trọng đối với nền sản xuất lúa gạo. Hạn ảnh hƣởng tiêu cực đến cây lúa ở tất cả các đặc điểm, bao gồm hình thái, sinh lý, sinh hóa, phân tử. 1.2. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN TỚI ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Ở THỰC VẬT Nhân tố phiên mã (Transcription factor - TF) là những protein hoạt động kết hợp với một số yếu tố điều hòa khác, bao gồm các protein cải biến/thay đổi cấu trúc sợi nhiễm sắc, để điều hòa tƣơng tác của RNA polymerase với DNA. NAC là nhân tố phiên mã lớn nhất đặc chƣng của thực vật. Tên gọi NAC bắt nguồn từ tên của ba protein đầu tiên đƣợc phát hiện có chứa 6
vùng liên kết DNA tƣơng tự nhau (domain NAC), bao gồm NAM (no apical meristem), ATAF (Arabidopsis transcription activation factor) và CUC (cup-shaped cotyledon). NAC tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý, hóa sinh khác nhau trong tế bào, bao gồm các quá trình phát triển, già hóa, tạo thành tế bào thứ cấp, đáp ứng các yếu tố stress phi sinh học và hữu sinh. NAC là thành phần rất quan trọng của con đƣờng truyền tín hiệu trong đáp ứng chống chịu stress của thực vật cho thấy tiềm năng ứng dụng của họ gen NAC trong nghiên cứu tạo giống cây trồng chống chịu stress. 1.3. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ CƠ CHẾ CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT Stress sinh học và phi sinh học là nguyên nhân chính làm giảm năng suất trên nhiều đối tƣợng cây trồng quan trọng nhƣ lúa, ngô, bông, lúa mì, cà chua... Và để đối phó với vấn đề này, công nghệ chuyển gen thực vật đƣợc sử dụng và đƣợc coi là một công cụ hiệu quả để chuyển các gen ngoại lai nhằm cải thiện nguồn gen cây trồng. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỐNG CHỊU HẠN Một hƣớng giải quyết đƣợc chính phủ, các tổ chức xã hội và các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đó là nghiên cứu tạo ra các giống lúa mới có năng suất cao, đồng thời có khả năng chống chịu tốt với điều kiện hạn. Định hƣớng nghiên cứu phổ biến và rất đƣợc quan tâm hiện nay đó tăng cƣờng biểu hiện các gen đáp ứng hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa chuyển gen. Ở Việt Nam, định hƣớng chuyển gen vào lúa đã bắt đầu hình thành vào những năm 1995 của thế kỷ trƣớc. Tuy nhiên, chúng ta hầu nhƣ chƣa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào về các gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress, đặc biệt là nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng hạn ở lúa. 7
Chƣơng 2. VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Giống lúa J02 đƣợc mua từ Công ty Cổ phần giống – vật tƣ nông nghiệp công nghệ cao Việt Nam; Các giống lúa nƣơng và IR64 do Trung tâm Tài nguyên môi trƣờng – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. 2.1.2. Chủng vi sinh vật Vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α đƣợc mua từ hãng Thermo Scientifics (Mỹ); vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA4404 đƣợc mua từ Công ty Clontech Laboratories (Mỹ). 2.1.3. Vector và oligonucleotide Vector pBI-Lip9, pBI-Ubi, pBI-35S và pCAM-Rd29A do nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội (Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật – Viện Di truyền nông nghiệp) thiết kế và cung cấp; vector pGEM-T mạch thẳng có đầu T đƣợc đóng gói kèm trong bộ kit pGEM®-T Easy Vector Systems của hãng Promega. Các cặp oligonucleotide sử dụng làm mồi cho PCR đƣợc thiết kế dựa trên các trình tự đã đƣợc công bố trên Gen ank và đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp của Qin (2007), Dubouzet (2003) và Tran (2004). - Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA. - Nhân dòng gen OsNAC1/ OsNAC5/ OsNAC10 vào vector pGEM-T. - Thiết kế vector biểu hiện gen OsNAC1. 8
Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-Rd/OsNAC1 Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế pBI-Lip9/ OsNAC1, pBI-35S/ OsNAC1 và pBI-Ubi/ OsNAC1 - Tạo cây lúa chuyển gen biểu hiện OsNAC1. - Sàng lọc kiểu gen, kiểu hình của các cây chuyển gen - Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen ở điều kiện nhà lƣới bằng các phƣơng pháp định lƣợng sinh lý, sinh hóa ở cây lúa: hàm nƣớc tƣơng đối theo phƣơng pháp của Schonfeld (2002), hàm lƣợng chlorophyll theo phƣơng pháp của Robert J. Porra (2006), hàm lƣợng proline theo phƣơng pháp của Bates (1973), sự sản sinh ROS theo phƣơng pháp Thorda- Christensen (1997). 9
Chƣơng 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NHÓM NAC LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở LÚA 3.1.1. Khảo sát khả năng chịu hạn của một số giống lúa Việt Nam 10 giống lúa Việt Nam và giống lúa đối chứng IR64 khảo sát khả nănng chịu theo phƣơng pháp chuẩn của Viện Lúa quốc tế IRRI, 1996. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở lúa Phƣơng pháp đánh STT Tên giống giá theo IRRI 1 Lúa Tẻ đỏ 1,00 ± 0,6 2 Pê đớ 2,33 ± 0,8 3 Khấu le 2,67 ± 0,5 4 Blue xá 2,67 ± 1,1 5 Lốc nghệ 3,33 ± 1,1 6 Lúa ngoi 3,67 ± 0,8 7 Lúa lốc đỏ 4,33 ± 0,8 8 Nếp khau Pí Pột 4,67 ± 0,5 9 Lúa tẻ nƣơng 5,67 ± 0,8 10 Chành trụi 5,67 ± 0,8 11 IR64 5,67 ± 1,1 Giống lúa Tẻ đỏ đƣợc lựa chọn làm nguồn vật liệu thí nghiệm phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn ở lúa. 3.1.2. Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC liên quan tới tính chịu hạn 3.1.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn Kết quả điện di RNA trên gel agarose 1% cho thấy, các mẫu RNA 10
tinh sạch phục vụ cho thí nghiệm phân lập gen (Hình 3.1). Hình 3.1: Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lúa xử lý hạn Ghi chú: giếng 1 – 4: RNA tổng số tách chiết từ mẫu lá lúa xử lý hạn trong 1, 6, 12 và 24 giờ được điện di trên gel agarose 1%. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb. 3.1.2.2. Phân lập các gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC 3.1.2.2.1. Nhân bản gen mã hóa nhân tố phiên mã nhóm NAC Các đoạn gen đích đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế, sau đó kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Hình 3.2: Nhân bản gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 bằng kỹ thuật PCR từ cDNA lúa Tẻ đỏ xử lý hạn Ghi chú: Sản phẩm PCR nhân gen đích từ cDNA của các mẫu lúa Tẻ đỏ được điện di trên gel agarose 1%. (A) PCR nhân bản gen OsNAC1, giếng 1: mẫu lúa xử lý hạn. giếng 2: đối chứng âm (mẫu lúa không xử lý hạn); (B) PCR nhân bản gen OsNAC, giếng 2: khuôn là cDNA; giếng 1: đối chứng âm. (C) PCR nhân bản gen OsNAC10, giếng 2: khuôn là cDNA; giếng 1: đối chứng âm. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb. 11
Kết quả phân tích trình tự axit amin suy diễn của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 từ lúa Tẻ đỏ cho thấy, cả 3 gen phân lập đƣợc đều mã hóa cho protein với các vùng đặc trƣng của họ protein NAC. OsNAC1, OsNAC5 chứa đầy đủ cả 5 domin bảo thủ A, B, C, D và E, trong khi OsNAC10 thiếu domai E (Hình 3.3). Ngoài ra, cả ba protein này đều chứa một vùng tín hiệu định vị nhân PRDRKYP phổ biến cho các nhân tố phiên mã, nằm ở domain C (Hình 3.3). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các công bố trƣớc đây. Hình 3.3: Phân tích trình tự axit amin của protein OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 của giống lúa Tẻ đỏ Ghi chú: Vùng tín hiệu định vị nhân được kí hiệu bởi dấu ngoặc; các vùng bảo thủ của protein NAC được kí hiệu A, B, C, D, E; TĐ: gen phân lập từ lúa Tẻ đỏ, JA: gen phân lập từ lúa Japonica (Niponbare) đã công bố trên ngân hàng gen mã số AY596808.1, AB028184.1 và AK069257.1. 12
3.1.3. Phân tích biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong điều kiện hạn Hình 3.4: Mức độ biểu hiện của OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 trong điều kiện xử lý hạn Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen OsNAC1 (cột màu xanh), OsNAC5 (cột màu đỏ) và OsNAC10 (cột màu vàng) của lúa Tẻ đỏ đã xử lý hạn (PEG 20%) trong thời gian 0 giờ, 1 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ được xác định bằng RT - PCR. Mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress (0 h) có giá trị bằng 1. Actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp RT-PCR nghiên cứu mức độ biểu hiện của các gen OsNAC1, OsNAC5 và OsNAC10 ở giống lúa Tẻ đỏ trong điều kiện xử lý stress hạn. Mức độ biểu hiện khác nhau ở các gen khác nhau, trong đó OsNAC1 có mức độ biểu hiện cao hơn rõ rệt và duy trì mức độ biểu hiện cao trong thời gian dài hơn đáng kể so với hai gen còn lại khi xử lý stress hạn. Điều này cho phép dự đoán OsNAC1 đóng góp vai trò nhiều hơn trong đáp ứng chống chịu hạn của cây lúa Tẻ đỏ so với OsNAC5 và OsNAC10, đặc biệt là đối với stress hạn kéo dài. Chính vì vậy, OsNAC1 đƣợc lựa chọn làm đối tƣợng nghiên cứu chính cho các thí nghiệm tiếp theo nhằm tạo ra dòng lúa chuyển gen có khả năng chống chịu hạn. 13
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNAC1 TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT 3.2.1. Thiết kế hệ vector chuyển gen pCAMBIA1301 Hình 3.5: PCR v cắt enzyme giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNAC1 trong plasmid tái tổ hợp pCAM-Rd/OsNAC1 Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR plasmid pCAM-Rd/OsNAC1, giếng 1 và 3: PCR với mồi OsNAC1-Fw/Rv; giếng 3 và 4: PCR với mồi RD-Fw/NAC1- Rv; giếng 1 và 2: khuôn là pCAM-Rd/OsNAC1; giếng 3 và 4: đối chứng âm (không có DNA khuôn). (B) Sản phẩm cắt enzyme giới hạn plasmid pCAM-Rd/OsNAC1, giếng 1: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme BamHI; giếng 3: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme HindIII/EcoRI; giếng 2: vector nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1kb. 3.2.2. Thiết kế hệ vector chuyển gen pBI101 Hình 3.6: PCR v cắt giới hạn kiểm tra sự có mặt của OsNAC1 trong plasmid tái tổ hợp pBI-Ubi/OsNAC1, pBI-Lip9/OsNAC1và pBI-Lip9/OsNAC1 Ghi chú: (A) Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp; giếng 1, 3: khuôn là pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 5, 7: khuôn là pBI-35S/OsNAC1; giếng 9, 11 : khuôn là pBI-Lip9/OsNAC1; giếng 1-2, 5-6 và 9-10: PCR với cặp mồi OsNAC1-Fw/ OsNAC1-Rv; giếng 3, 4: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/ OsNAC1-Rv; giếng 7, 8: PCR với cặp mồi 35S-Fw/ OsNAC1-Rv;giếng 11,12: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/ OsNAC1-Rv; giếng 1, 3, 6, 8, 10, 12: đối chứng âm với khuôn là nước. (B) Sản phẩm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp bằng BamHI; giếng 1 và 2: pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 3 và 4: pBI-35S/OsNAC1; giếng 5 và 6: pBI-Lip9/OsNAC1; giếng 2, 4 và 6: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 1, 3 và 5: plasmid nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb. 14
3.3. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN OsNAC1 TRONG CÂY LÚA 3.3.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens LBA4404 Hình 3.7: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pCAM-Rd/OsNAC1, pBI-35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1và pBI-Lip9/OsNAC1 Ghi chú: Sản phẩm PCR khuẩn lạc A. tumefaciens với cặp mồi OsNAC1- Fw/ OsNAC1-Rv được điện di trên gel agarose 1%. (A) Thể biến nạp pBI- 35S/OsNAC1, pBI-Ubi/OsNAC1và pBI-Lip9/OsNAC1, giếng 5, 6 và 13: đối chứng âm (khuôn là nước); giếng 1 – 4: khuôn là thể biến nạp pBI- 35S/OsNAC1; giếng 7 – 9: khuôn là thể biến nạp pBI-Ubi/OsNAC1; giếng 10 – 12: khuôn là thể biến nạp pBI-Ubi/OsNAC1. (B) Thể biến nạp pCAM-Rd/OsNAC1; giếng 2 – 4: khuôn là thể biến nạp pCAM- Rd/OsNAC1; giếng 4: đối chứng âm. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb. 3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen OsNAC1 vào lúa Cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 đƣợc chuyển vào mô sẹo của lúa J02 (Oryza sativa L. Japonica) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Mô sẹo hình thành từ phôi lúa đƣợc lần lƣợt chuyển các cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 (Ubi:OsNAC1, Lip9:OsNAC1, 35S:OsNAC1, Rd29A:OsNAC1) và các cấu trúc vector nhị phân không mang gen đích (pCAM IA1301, p I101). Sau đó, mô sẹo đƣợc chọn lọc và tái sinh trên môi trƣờng nuôi cấy in vitro. Bảng 3.2: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens Cấu trúc gen Tái sinh Tái sinh Callus Chọn lọc chuyển chồi rễ Lip9: OsNAC1 ~100 38 32 29 Ubi: OsNAC1 ~100 50 37 36 35S: OsNAC1 ~100 51 44 41 15
Rd29A: OsNAC1 ~100 38 14 14 pBI101 ~100 27 17 17 pCAMBIA1301 ~100 41 27 25 3.3.3. Chọn lọc cây lúa mang gen chuyển OsNAC1 có một bản copy đời T0 Các cây tái sinh trƣớc khi đƣa ra bầu đất sinh trƣởng trong nhà lƣới đƣợc kiểm tra khả năng mang gen cần chuyển bằng các phản ứng PCR với ba cặp mồi là Actin-Fw/ Actin-Rv, Hyg-Fw/ Hyg-Rv và OsNAC1-Fw/ Nos-Rv (đối với dòng chuyển cấu trúc gen OsNAC1) và xác định số lƣợng bản copy cấu trúc gen chuyển bằng phƣơng pháp phân tích PCR định lƣợng thời gian thực (qRT-PCR) với cặp mồi Hyg-RT-Fw/ Hyg-RT-Rv. Bảng 3.3: Kết quả s ng lọc cây lúa tái sinh mang cấu trúc biểu hiện gen OsNAC1 Số PCR Cấu trúc gen cây Actin Hygromycin OsNAC1:Nos chuyển kiểm (Actin- (Hyg-Fw/ OsNAC1-Fw/ tra Fw/Actin-Rv) Hyg-Rv) Nos-Rv) Lip9: OsNAC1 29 29/29 21/29 21/29 Ubi: OsNAC1 36 36/36 30/36 30/36 35S: OsNAC1 41 41/41 31/41 31/41 Rd29A: 11/14 11/14 OsNAC1 14 14/14 pBI101 17 17/17 13/17 0/0 pCAMBIA1301 25 25/25 18/25 0/0 Tổng 162 162/162 124/162 93/162 16
Bảng 3.4: Xác định bản copy cấu trúc gen chuyển trong cây lúa T0 Cấu trúc gen Số cây qRT-PCR chuyển kiểm tra 1 bản copy > 1 bản copy Lip9: OsNAC1 21 12/21 9/29 Ubi: OsNAC1 30 16/30 14/30 35S: OsNAC1 31 11/31 20/31 Rd29A: OsNAC1 11 3/11 8/11 pBI101 13 4/13 9/13 pCAMBIA1301 18 6/18 12/18 Tổng 124 52/124 72/124 3.3.4. Chọn lọc dòng lúa chuyển gen ở thể đồng hợp tử đời T1 Bảng 3.5: Kết quả s ng lọc các dòng lúa chuyển gen T1 Số hạt nảy Số PCR (+) Số cây Các dòng lúa mầm trên hạt đồng hợp chuyển gen môi trƣờng kiểm Mồi Mồi Mồi (> 1 bản T1 bổ sung tra copy) hygromycin actin Hygro (gen+nos) L1 5 3 3/3 3/3 3/3 1/3 L2 12 9 9/9 9/9 9/9 2/9 Lip9: L3 6 2 2/2 2/2 2/2 0/2 OsNAC1 L4 18 12 12/12 11/12 11/12 2/11 L5 7 4 4/4 3/4 3/4 1/3 U1 2 0 0/0 0/0 0/0 0/0 U2 7 5 5/5 5/5 5/5 1/5 U3 4 3 3/3 3/3 3/3 0/3 Ubi: U4 15 12 12/12 11/12 11/12 3/11 OsNAC1 U5 5 4 4/4 4/4 4/4 1/4 U6 10 7 7/7 7/7 7/7 2/7 U7 2 1 1/1 0/1 0/1 0/1 U8 2 0 0/0 0/0 0/0 0/0 Tổng cộng 95 62/95 62/62 58/62 58/62 13/58 17
3.3.5. Chọn lọc dòng lúa có biểu hiện gen chuyển đời T2 Hình 3.8: Mức độ biểu hiện của OsNAC1 trong các cây lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1 Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen đích trong các dòng lúa chuyển gen Ubi:OsNAC1 đời T2 được xác định dựa trên hàm lượng mRNA OsNAC1 tương quan giữa các dòng lúa chuyển gen với dòng lúa không chuyển gen (ĐC). Mức độ biểu hiện gen của cây lúa không chuyển gen có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm. Hình 3.9: Biểu hiện của OsNAC1 trong các cây lúa chuyển gen Lip9:OsNAC1 Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen Lip9:OsNAC1 đời T2 được xác định dựa trên hàm lượng mRNA OsNAC1 tương quan giữa các dòng lúa chuyển gen với dòng lúa không chuyển gen (ĐC). Mức độ biểu hiện gen của cây lúa không chuyển gen có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn. Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm. 18