hóa luận tốt nghiệp ngành Y đa khoa: Phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

Chia sẻ: Chuheo Dethuong25 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm xây dựng quy trình phân tích các đa hình di truyền nằm trong exon 1 đến exon 6 thuộc gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam. Xác định tần số các đa hình gen NPHS2 trên 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: hóa luận tốt nghiệp ngành Y đa khoa: Phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THÙY LINH TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA HÀ NỘI - 2018
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI U KHOA Y DƯỢC VN y, ac NGUYỄN THỊ THÙY LINH a rm d Ph TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN an ine NPHS2 TRÊN MẪU MÁU BỆNH NHÂN NHI MẮC HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT dic Me of ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA ho Sc Khóa: QH 2012.Y Người hướng dẫn: 1. ThS. Phạm Thị Hồng Nhung @ 2. ThS. BS. Vũ Vân Nga ht rig py HÀ NỘI - 2018 Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
LỜI CẢM ƠN U Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới ThS. Phạm VN Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, ThS. Vũ Vân Nga - Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, y, những người thầy đã luôn hướng dẫn chỉ bảo tận tình, cho tôi nhiều ý kiến ac nhận xét quý báu cũng như truyền đạt cho tôi tinh thần học hỏi, làm việc rm nghiêm túc trong quá trình tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Thị Thơm – Giảng viên khoa Y a Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy luôn tận tâm giúp đỡ tôi trong Ph quá trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. d an Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số QG.16.23. Trong quá trình học ine tập, làm việc và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô và các bạn sinh viên làm việc tại thực tập tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dic dược học cơ sở – Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn. Me Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến of thức quý báu trong quá trình học tập tại trường. ol Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn ho bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. Sc Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2018 @ ht rig Nguyễn Thị Thùy Linh py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT U bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) VN ADN Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic) dNTP Deoxynucleotide triphosphate y, DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography (Sắc kí ac lỏng cao áp biến tính) rm EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine a tetraacetic) Ph HCTH Hội chứng thận hư HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát d an Kb kilobase (= 1000 bp) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm ine Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia – Mỹ) dic NPHS2 Gen mã hóa cho protein podocin NHLBI National Heart, Lung and Blood Instiute (Viện tim, phổi và Me máu quốc gia) OD Optical density (Mật độ quang học) of PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) ol RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài ho đoạn cắt giới hạn) Sc SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotit) SSCP Single strand conformation poly morphism (Phân tích đa hình @ cấu hình sợi đơn) STR Short Tandem Repeat (Các đoạn lặp ngắn) ht TAE Đệm Tris base/axit acetic/ EDTA rig UTR Untranslated region (Vùng không dịch mã) py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU U VN Trang Bảng 1 Trình tự mồi nhân dòng gen NPHS2 .............................................. 20 y, Bảng 2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR của gen NPHS2.............. 30 ac Bảng 3 Tổng hợp các SNP thuộc gen NPHS2 của 149 bệnh nhân ............. 32 rm Bảng 4 Các đột biến sai nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu .......... 33 a Bảng 5 Các đột biến vô nghĩa thuộc gen NPHS2 trong nghiên cứu ........... 33 Ph Bảng 6 Tần số kiểu gen và tần số alen của 6 SNP xuất hiện alen đột biến ...34 d an ine dic Me of ol ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH U Trang VN Hình 1.1 Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước ................................ 4 Hình 1.2 Cơ chế bệnh học HCTH ............................................................... 5 y, ac Hình 1.3 Gen NPHS2 và protein podocin ................................................... 8 Hình 1.4 Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận và tương tác giữa rm các protein cấu tạo nên tế bào ....................................................... 9 a Hình 1.5 Các đột biến trên protein podocin được mã hóa bởi gen NPHS2.... 10 Ph Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu ....................................................... 23 d Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 0,7% ................... 25 an Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi trên 6 exon gen NPHS2 .......................................................................................... 27 ine Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR tối ưu nồng độ mồi trên 6 exon dic gen NPHS2 .................................................................................... 28 Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với nồng độ ADN khác nhau trên Me 6 exon gen NPHS2 ........................................................................ 29 Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 exon gen NPHS2 sau khi tối of ưu .................................................................................................. 29 ol Hình 3.6 Một số kết quả giải trình tự gen NPHS2 ...................................... 31 ho Hình 3.7 Số lượng đột biến trên 6 exon đầu tiên của gen NPHS2 ............... 31 Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
MỤC LỤC U VN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT y, DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ac DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH rm ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 a Ph 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT ........ 3 1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học ..................................................... 3 d 1.1.2. Cơ chế sinh bệnh học .......................................................................... 4 an 1.1.3. Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP ...... 5 1.1.4. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát ............ 6 ine 1.2. TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 ............................................... 8 dic 1.2.1. Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2............................................... 8 1.2.2. Đa hình di truyền gen NPHS2 ............................................................. 9 Me 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP ................................................... 11 of 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN ĐƠN NUCLEOTIT ....................................................................... 13 ol CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 18 ho 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................... 18 Sc 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................ 18 2.1.2. Hóa chất............................................................................................. 18 @ 2.1.3. Thiết bị .............................................................................................. 19 2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..................................................... 19 ht 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 19 rig 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm............................................... 20 py 2.2.2. Tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN tổng số .............................. 20 Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2.2.3. Nhân dòng 6 exon của gen NPHS2 bằng PCR ................................. 21 U 2.2.4. Xác định kiểu gen 6 exon của gen NPHS2 bằng giải trình tự .......... 23 VN 2.2.5. Xác định tần số của các SNP thuộc gen NPHS2............................... 23 2.3. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU .................................................... 24 y, CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................... 26 ac 3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ ............................................. 26 rm 3.2. NHÂN DÒNG 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG PCR ........ 26 3.3. XÁC ĐỊNH KIỂU GEN 6 EXON CỦA GEN NPHS2 BẰNG a Ph GIẢI TRÌNH TỰ .......................................................................... 30 3.4. TẦN SỐ ALEN CỦA CÁC ĐA HÌNH XUẤT HIỆN TRONG d NGHIÊN CỨU .............................................................................. 33 an CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 34 4.1. VỀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 6 EXON ĐẦU ine CỦA GEN NPHS2 ........................................................................ 34 4.2. VỀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ SNP XÁC ĐỊNH ĐƯỢC TRÊN 6 dic EXON ...................................................................................... …36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40 Me 4.1. KẾT LUẬN............................................................................ 40 4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................... 40 of TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ ol PHỤ LỤC ........................................................................................................... ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
U ĐẶT VẤN ĐỀ VN Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) là bệnh cầu thận mạn tính thường gặp nhất ở trẻ em và là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến suy giảm chức y, năng thận [14, 65]. Cho đến nay, các phương pháp điều trị bệnh chủ yếu là ac liệu pháp corticosteroid, thuốc ức chế miễn dịch và ghép thận. Theo tiêu chuẩn lâm sàng, HCTH được phân loại dựa vào đáp ứng của bệnh nhân với rm liệu pháp corticosteroid gồm hai nhóm: nhạy cảm và kháng corticosteroid [14, a 38]. Phần lớn bệnh nhân mắc HCTHTP thường rất cảm thụ với liệu pháp này, Ph tuy nhiên việc điều trị kéo dài bằng corticosteroid gây ra nhiều tác dụng phụ như hội chứng Cushing, tăng huyết áp, đục thủy tinh thể, glaucoma, loãng d xương, chậm phát triển thể chất [12]. Bên cạnh đó, một tỉ lệ không nhỏ (10 – an 20% trường hợp) bệnh nhân mắc HCTHTP kháng corticosteroid có nguy cơ cao tiến triển thành bệnh thận giai đoạn cuối [58]. Nhiều trường hợp kháng ine corticosetorid được chứng minh là do đột biến gen gây ảnh hưởng tới chức năng và sự biệt hóa của tế bào podocyte (tế bào biểu mô có chân trên màng dic đáy cầu thận). Bệnh có tỷ lệ tái phát cao, diễn biến điều trị lâu dài tạo ra sự lo lắng, chán nản và tiêu tốn nhiều tiền của cho bệnh nhân và gia đình người Me bệnh [6]. Trên thế giới, nhiều công trình nghiên cứu về HCTHTP đã được thực of hiện để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyền ol của bệnh. Những nghiên cứu áp dụng tiến bộ của di truyền học phân tử trong vài năm qua đã chứng minh có nhiều gen liên quan đến HCTHTP kháng ho corticosteroid, trong đó các đột biến của gen NPHS2 mã hóa cho protein Sc podocin đóng vai trò quan trọng [49, 60]. Các nhà khoa học đã xác định được tổng cộng 89 đột biến điểm trên 8 @ exon của gen NPHS2, trong đó 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6 được chứng minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP [41]. Vì vậy, việc xác ht định các đột biến của gen NPHS2 nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa di truyền rig với đáp ứng thuốc có thể hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng quyết định phác đồ điều trị thích hợp cho từng bệnh nhân, hạn chế nhiều biến chứng do thuốc và giảm py Co 1 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
chi phí điều trị [43]. Đây chính là xu hướng tối ưu hóa điều trị theo từng cá U thể, tích hợp xét nghiệm di truyền học trong phác đồ điều trị bệnh nhân. VN Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về các đa hình thái của gen NPHS2 cũng như quy trình phân tích gen này. Từ nhu cầu lâm sàng và tính y, cấp thiết của nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới trong chẩn đoán, ac điều trị bệnh nhân mắc HCTHTP, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân tích gen NPHS2 trên mẫu máu bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát”. rm 1. Mục tiêu nghiên cứu: a - Xây dựng quy trình phân tích các đa hình di truyền nằm trong exon 1 Ph đến exon 6 thuộc gen NPHS2 ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam. - Xác định tần số các đa hình gen NPHS2 trên 149 d bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam. 2. Nội dung nghiên cứu: an ine - Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng exon 1 đến exon 6 thuộc gen NPHS2. dic - Giải trình tự và xác định các đa hình gen NPHS2. - Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số Me alen trên 149 bệnh nhân nhi mắc HCTHTP ở Việt Nam. of ol ho Sc @ ht rig py Co 2 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU U VN 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT 1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học y, Hội chứng thận hư là biểu hiện thường gặp của bệnh cầu thận nguyên ac phát, diễn biến kéo dài nhiều năm với các đợt bột phát, xen lẫn những thời kỳ thuyên giảm. Đây là một hội chứng lâm sàng và sinh hóa xuất hiện ở nhiều rm bệnh do tổn thương ở cầu thận đặc trưng bởi phù, protein niệu cao, protein a máu giảm, rối loạn lipid máu và có thể đái ra mỡ [6]. Ph Hội chứng thận hư tiên phát là HCTH không có nguyên nhân rõ ràng, khởi phát sớm nhất trên 3 tháng tuổi, với 3 hình thái bệnh lí tổn thương cầu d thận: tổn thương tối thiểu, xơ cứng hoặc hyalin hoá cục bộ hoặc một phần và an tăng sinh gian mạch lan toả. Bệnh hay gặp ở tuổi tiền học đường hoặc học đường (5 – 10 tuổi) [8]. ine Hội chứng thận hư kháng steroid (Steroid-resistant nephrotic syndrome - SRNS) được định nghĩa là một tình trạng bệnh nhân mắc hội chứng thận hư dic không đạt được sự thuyên giảm sau điều trị đầy đủ theo liệu pháp corticosteroid tiêu chuẩn. Hội chứng thận hư kháng corticosteroid chiếm Me khoảng 10% - 15% hội chứng thận hư ở trẻ em và có xu hướng tiến triển đến giai đoạn cuối của bệnh thận trong vòng 10 năm [44]. Khi đó bệnh nhân cần of được điều trị bằng lọc máu và ghép thận với chi phí cao. Tỷ lệ mắc HCTHTP thay đổi theo tuổi, giới, chủng tộc, địa dư và cơ ol địa. Tuổi mắc bệnh trung bình ở trẻ em Việt Nam là 8,7 ± 3,5 (tuổi đi học) ho trong khi đó một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy tuổi mắc bệnh thấp hơn Sc thường gặp ở trẻ em trước tuổi đi học. Trẻ nam gặp nhiều hơn trẻ nữ (tỷ lệ 2:1). Về chủng tộc, trẻ em Châu Á bị bệnh nhiều hơn Châu Âu (với tỷ lệ 6:1); @ trẻ em Châu Phi ít mắc HCTHTP, nhưng nếu trẻ em da đen mắc HCTHTP thì thường bị kháng corticosteroid [52]. ht Ở Mỹ, tỉ lệ mắc mới hàng năm ước tính 2,0 – 2,7/100.000 ca, tỉ lệ hiện rig mắc là 16/100.000 người. Tại Anh, hàng năm tỉ lệ mới mắc của trẻ em gốc Á (Đông Nam Á, Nhật, Ấn Độ) cao gấp 6 lần trẻ em châu Âu (Hình 1.1 thể hiện py tỉ lệ mắc HCTH ở một số nước trên thế giới). Ở nước ta, tại các khoa Nhi Co 3 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
bệnh viện đa khoa tỉnh, số trẻ em mắc hội chứng thận hư (HCTH) chiếm U khoảng 0.5 – 1% tổng số bệnh nhi điều trị nội trú và chiếm 10 – 30% tổng số VN bệnh nhi bị các bệnh thận. Tại Bệnh viện Nhi Trung Ương số bệnh nhân bị thận hư chiếm gần 2% tổng số bệnh nhân và chiếm 40% tổng số bệnh nhân y, của khoa thận [1, 10]. ac a rm d Ph an ine dic Hình 1.1. Tỉ lệ mắc hội chứng thận hư ở một số nước trên thế giới [27] Me 1.1.2. Cơ chế sinh bệnh học of Cơ chế sinh bệnh học của HCTHTP đến nay vẫn chưa được biết đầy đủ. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có sự rối loạn chức năng của tế bào ol lympho T dẫn đến sự rối loạn đáp ứng miễn dịch. Các protein đặc biệt là các ho Albumin xuất hiện trong nước tiểu là do biến đổi cấu trúc màng lọc, mở rộng lỗ lọc và mất điện tích âm màng đáy. Một số bệnh nhân mang điện tích dương Sc trong huyết tương và các phân tử protein này có thể trung hòa điện tích âm trên thành mao mạch cầu thận. Ngoài ra một số nghiên cứu còn cho thấy có @ vai trò của yếu tố di truyền trong cơ chế sinh bệnh học HCTHTP. Gần đây ht người ta thấy rằng sự thay đổi của các phân tử creatin bộc lộ trên chân lồi của các tế bào biểu mô có chân, đặc biệt là nephrin, podocin và α-actin cũng có rig vai trò gây xuất hiện protein niệu [4]. Hình 1.2 mô tả cơ chế gây mất albumin py từ máu ra nước tiểu trong HCTH. Co 4 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
U VN y, ac a rm Hình 1.2. Cơ chế bệnh học HCTH [53] Ph Hầu hết các bệnh nhân bị HCTH kháng corticosteroid không rõ nguyên nhân. Tuy nhiên 1/4 đến 1/3 trường hợp HCTH kháng corticosteroid ở trẻ em d hoặc HCTH bẩm sinh được chứng minh trong các nghiên cứu có nguyên nhân an do gen làm ảnh hưởng tới sự biệt hóa và chức năng của tế bào podocyte [33]. 1.1.3. Biến chứng của liệu pháp corticosteroid trong điều trị HCTHTP ine Những bằng chứng về rối loạn miễn dịch là cơ sở để sử dụng dic corticosteroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác trong điều trị HCTHTP. Khi chưa có corticosteroid, một tỉ lệ lớn bệnh nhân bị HCTH chết hoặc tiến Me triển đến bệnh thận giai đoạn cuối nhanh chóng. Từ năm 1950, corticosteroid đã được sử dụng trong điều trị HCTH giúp giảm tỉ lệ tử vong trẻ em bị HCTH of xuống còn khoảng 3%. Corticosteroid có tác dụng giảm viêm ở cầu thận trong điều trị HCTHTP, từ đó các triệu chứng bệnh sẽ giảm hoặc mất hoàn toàn. ol Với những trẻ bị HCTH giai đoạn đầu, 90% trẻ đáp ứng với liệu pháp ho corticosteroid [45]. Tuy nhiên, bệnh có khả năng tái phát cao, vì vậy cần theo dõi lâu dài và tuân thủ phác đồ một cách chính xác. Mặt khác, điều trị bằng Sc corticosteroid trong thời gian dài cũng gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như [12, 45]: @ - Thần kinh, tâm thần: rối loạn tâm thần, trầm cảm. ht - Tim mạch: tăng huyết áp, suy tim mất bù. rig - Tiêu hóa: bệnh lý dạ dày – tá tràng (loét, chảy máu, thủng), viêm tụy. - Nội tiết: hội chứng Cushing, chậm phát triển ở trẻ em. py - Chuyển hóa: tăng glucose máu, đái tháo đường, mất kali. Co 5 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Cơ xương khớp: loãng xương, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi, yếu U cơ, nhược cơ. VN - Mắt: Glaucoma, đục thủy tinh thể dưới bao. - Da: trứng cá, teo da, ban, tụ máu, đỏ mặt, chậm liền sẹo. y, - Nhiễm khuẩn. ac - Tai biến do ngừng thuốc đột ngột: suy thượng thận cấp. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu về HCTHTP đã được thực hiên cho rm thấy tỉ lệ bệnh nhân HCTH kháng thuốc là 10 – 20% và có xu hướng ngày a càng tăng [11, 31]. Theo kết quả nghiên cứu của Lê Nam Trà và cộng sự trên Ph 42 trẻ bị HCTHTP kháng corticosteroid được điều trị bằng methylprenisolon liều cao truyền tĩnh mạch, tỉ lệ thuyên giảm hoàn toàn là 33,3%, thuyên giảm d một phần là 30,9% và không đáp ứng là 35,7% [8]. Những nghiên cứu mới về an phân tích đột biến gen mã hóa tổng hợp các protein tham gia cấu trúc màng lọc cầu thận đã phần nào chứng minh giả thiết nguyên nhân gây kháng thuốc ine do gen. Bằng chứng là sự di truyền khả năng đáp ứng và không đáp ứng với corticosteroid ở các bệnh nhân mắc hội chứng thận hư đang ngày càng được dic công nhận [30]. Vấn đề cơ chế nào dẫn đến việc những bệnh nhân này ban đầu đáp ứng với corticosteroid nhưng sau đó lại kháng với corticosteroid (hiện Me tượng kháng corticosteroid muộn) cũng được đặt ra. Vì vậy, xét nghiệm gen di truyền đang ngày càng trở thành một công cụ có giá trị trong việc xác định of các đột biến gen có liên quan đến hội chứng thận hư và sự di truyền tính ol kháng steroid, từ đó có được hướng điều trị hiệu quả và trong tương lai có thể ho tránh những trường hợp sinh thiết thận không phù hợp [13]. 1.1.4. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng thận hư tiên phát Sc Hơn hai thập kỉ qua, cơ sở phân tử của HCTH kháng corticosteroid đã được nghiên cứu trên cả trường hợp mắc HCTH kháng corticosteroid có tính @ chất gia đình và những trường hợp ngẫu nhiên. Các đột biến trên gen mã hóa cho các protein ở tế bào biểu mô có chân (podocyte) được mô tả như là ht nguyên nhân của HCTH kháng corticosteroid di truyền. Đến nay, các đột biến rig ở 10 gen (NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, ACTN4, TRPC6, INF2, MYO1E, py PTPRO và ARHGDIA) liên quan đến các dạng khác nhau của HCTH kháng corticosteroid đã được mô tả và 11 gen khác cũng được xác định là có liên Co 6 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
quan (WT1, LMX1B, LAMB2, ITGB4, SCARB2, COQ2, PDSS2, MTTL1, U SMARCA, MYH9 và NXF5) [23]. Kết quả của các nghiên cứu đã thực hiện VN trên thế giới chỉ ra các gen sau đây là nguyên nhân phổ biến nhất trong HCTH kháng corticosteroid: y, - Đột biến gen NPHS1 mã hóa nephrin của tế bào podocyte, thường gặp ac ở lứa tuổi nhỏ, đặc biệt trong HCTH bẩm sinh thể Phần Lan [31, 36]. - Đột biến gen NPHS2 mã hóa protein podocin của tế bào podocyte, rm thường gặp ở lứa tuổi lớn và HCTH kháng thuốc có tính chất gia đình. Đột biến gen NPHS2 gặp khoảng từ 10 – 30 % trẻ bị HCTH kháng thuốc ở Châu a Ph Âu và Trung Đông, ngược lại tỉ lệ này lại ít ở trẻ em Mỹ gốc Phi [37, 54, 60, 69]. - WT1 mã hóa cho sự di truyền ức chế protein của khối u liên quan đến d phát triển thận và hệ sinh dục. Đột biến gen WT1-Wilm’tumor có thể gặp ở an tất cả các trường hợp bị HCTH tiên phát kháng corticosteroid [36, 59]. - Gen ít gặp hơn là LAMB2 mã hóa lamin beta 2, PLCE1 mã hóa ine phospholipase C epsilon và TRP6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm trên màng lipid tạo thành một phức hệ với podocin quy định cơ chế cảm nhận của dic màng lọc cầu thận [36]. - Đột biến gen NPHS3 và đột biến ở gen epsilon phospholipase C Me (PLCE1 hay NPHS3) thường kết hợp với HCTH bẩm sinh và xơ hóa gian mạch lan tỏa [35]. of - Các gen khác gồm ACTN4 mã hóa alpha-actinine 4, TRPC6 mã hóa cho kênh dẫn truyền canxi nằm trên màng lipid và INF2 mã hóa protein điều hòa ol actin, các gen này gây HCTH di truyền trội với xơ hóa cầu thận cục bộ ho thường xuất hiện ở trẻ vị thành niên và người trẻ tuổi [68]. Sc Trên cơ sở các nghiên cứu này, các đột biến của gen NPHS2 được mô tả là một trong các nguyên nhân quan trọng trong cơ chế kháng thuốc ở bệnh @ nhân mắc HCTHTP và được tìm thấy ở các quần thể khác nhau với tần số và mức độ biểu hiện khác nhau [20, 25]. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi lựa ht chọn phân tích gen NPHS2 là bước đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về rig mối liên quan giữa các đột biến tìm thấy với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đáp ứng điều trị và tiên lượng ở bệnh nhân người Việt Nam mắc py HCTHTP. Co 7 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1.2. TỔNG QUAN VỀ GEN NPHS2 U 1.2.1. Vị trí, cấu trúc, vai trò của gen NHPS2 VN Gen NPHS2 ở người được xác định vị trí vào năm 2000, có độ dài khoảng 25 kb trên vai dài nhiễm sắc thể số 1 (1q25-q31) và bao gồm 8 exon y, [21] (Hình 1.3). ac a rm d Ph an ine dic Hình 1.3. Gen NPHS2 và protein podocin. A. Vị trí của gen NPHS2 trên Me nhiễm sắc thể số 1. B. Cấu trúc các đoạn exon và intron của gen NPHS2 mã hóa protein Podocin. Các exon được kí hiệu bằng hình chữ nhật màu đen, các of intron được thể hiện bằng đường gạch nối giữa các exon. UTR là vùng không dịch mã. C. Cấu trúc protein podocin. (Nguồn: Genetics in Medicine) ol NPHS2 mã hóa cho protein podocin, hầu như chỉ biểu hiện ở tế bào ho podocyte trên cầu thận. Podocyte là tế bào biểu mô biệt hóa bao quanh mặt Sc ngoài của màng lọc cầu thận (Hình 1.4). Những tế bào này phân ngón thành những chân bám vào mặt ngoài màng đáy, khe giữa các chân giả tạo ra những @ lỗ lọc đường kính khoảng n Å cho dịch lọc đi qua. Podocin là một protein màng, cấu tạo từ 383 axit amin và trọng lượng 42 kD, thuộc họ stomatin có ht cấu trúc giống như kẹp tóc, cả hai đầu của phân tử protein podocin đều nằm rig trong tế bào chất. Podocin tồn tại dưới dạng oligo trên màng lipid kép và tập trung nhiều ở các khe của màng lọc cầu thận, nơi nó tương tác với các protein py khác như CD2AP hay nephrin [20]. Co 8 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
U VN y, ac a rm d Ph an ine dic Hình 1.4. Tế bào biểu mô có chân trên màng đáy cầu thận và tương tác Me giữa các protein cấu tạo nên tế bào (Nguồn: Diagnostic Pathology: Kidney diseases E-Book by Robert B Colvin, Anthony Chang) of 1.2.2. Đa hình di truyền gen NPHS2 Kruglyak và Nickerson (2001) ước tính rằng hai hệ gen người bình ol thường trung bình giống nhau về trình tự các nucleotit tới 99,9%. Trong phần ho khác biệt di truyền còn lại thì đến 90% là các đa hình đơn nucleotit (single nucleotit polymorphism, viết tắt là SNP) [46]. SNP là đột biến thay thế một Sc nucleotit trong trình tự ADN với tần số lớn hơn 1% trong quần thể. Nhiều nghiên cứu đến nay cho thấy hầu hết các SNP phổ biến chỉ có hai alen và @ khoảng 2/3 các SNP trong hệ gen người có nguồn gốc là các đột biến đồng ht hoán. SNP có ý nghĩa rất quan trọng vì nó là loại biến dị di truyền phổ biến và ổn định, hơn 99,9% trình tự hệ gen là giống nhau và sự biến đổi của phần còn rig lại được coi là có ảnh hưởng rất lớn đến việc bằng cách nào đó mà con người py có sự phản ứng khác nhau với bệnh tật, với các nhân tố môi trường như vi khuẩn, vi rút, các độc tố và hóa chất, các thuốc và các liệu pháp điều trị khác Co 9 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
nhau. Các SNP nằm trong vùng mã hóa của gen làm thay đổi cấu trúc và chức U năng của protein được dịch mã là một trong những mục tiêu thường được VN phân tích nhằm chẩn đoán bệnh và lý giải cho việc tại sao mỗi người lại đáp ứng khác nhau với một loại thuốc trong cùng một điều kiện môi trường. Các y, điểm đa hình nucleotit này cho thấy tiềm năng không giới hạn trong việc ac nghiên cứu tác động của chúng đến con đường sinh bệnh học [61, 64]. Mặc dù tác động của từng SNP riêng rẽ đến sự hình thành bệnh là tương đối yếu rm nhưng sự tổ hợp của chúng có thể làm tăng đáng kể nguy cơ gây bệnh. Cùng với đó là sự liên quan đến khả năng đáp ứng thuốc, khả năng hấp thụ, chuyển a Ph hóa thuốc cũng như các phân tử khác [66]. Vì vậy, việc nghiên cứu mối liên hệ giữa các SNP này với sự hình thành bệnh là rất cần thiết nhằm tìm ra các d chỉ thị di truyền đặc trưng cho từng quần thể. an Do có cấu trúc đơn giản, chỉ thay đổi một nucleotit nên các kĩ thuật sinh học phân tử có thể phân tích nhanh chóng và hiệu quả kiểu gen của hàng ine trăm hay hàng ngàn cá nhân cho hàng trăm hay hàng ngàn SNP [47]. Các nhà di truyền học hy vọng rằng trong tương lai có thể hoàn thiện bản đồ các SNP dic có liên quan đến các bệnh lý, tiến đến việc giải mã chức năng của các gen ở mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ mắc bệnh, từ đó có lời khuyên thích Me hợp trong vấn đề phòng bệnh đối với từng cá thể. Nhiều dạng đa hình gen NPHS2 đã được xác định, trong đó chủ yếu là of các SNP (Hình 1.5). ol ho Sc @ ht rig py Hình 1.5. Các đột biến trên podocin Co (Nguồn: Weber et al: Podocin gene mutation screening) 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Các nhà khoa học đã xác định được 89 đột biến điểm trên 8 exon của U gen NPHS2, trong đó 56 đột biến tập trung từ exon 1 đến exon 6 được chứng VN minh có liên quan chặt chẽ tới HCTHTP; còn 33 đột biến tập trung ở exon 7 và 8 chưa tìm được mối liên quan chặt chẽ nào với HCTHTP [41, 42]. Bên y, cạnh các nghiên cứu trên các exon, cũng có một số ít nghiên cứu về các đột ac biến trên intron của NPHS2, tuy nhiên chưa có mối liên hệ rõ ràng nào giữa các đột biến trên intron của gen này với HCTHTP kháng thuốc [34, 41]. rm Sáu mươi bảy biến thể đa hình của NPHS2 đã được công bố gồm 22 SNP thuộc vùng mã hóa, trong đó có 8 SNP làm thay đổi axit amin và 14 a Ph SNP không làm thay đổi axit amin. 45 đột biến còn lại nằm ở vùng không mã hóa gồm 13 thay đổi ở intron, 26 thay đổi ở vùng promoter và 6 thay đổi ở d vùng 3 UTR. Đột biến p.R229Q (c.686G>A) thay thế nucleotit G thành A ở an vị trí 686 trong exon 5 dẫn đến sự thay đổi axit amin arginine thành glutamine [21]. Vì vậy, các đặc điểm sinh học của chuỗi peptit được mã hóa đã thay đổi. ine Nghiên cứu invitro cho thấy podocin đã giảm đáng kể liên kết với nephrin [63]. Tỷ lệ xuất hiện alen p.R229Q (c.686G> A) phụ thuộc vào dân tộc: 0,03- dic 0,13 ở châu Âu [25, 42, 63], và 0,005-0,025 ở các cá nhân từ gốc Phi Châu [29, 55, 63]. Các biến thể p.A61V (c.182C> T) và p.A242V (c.725C> T) là Me những SNP làm thay đổi protein mã hóa chủ yếu ở các cá nhân người Mỹ gốc Phi, với tần suất tương đối lần lượt là 0,015 và 0,076 (NHLBI Exome of Sequencing Project). Năm 2011, Ren Q và Yu Sy trong nghiên cứu ở 35 bệnh nhân nhi và 30 người đối chứng khỏe mạnh đã phát hiện 3 SNP: 288C>T thể ol dị hợp ở exon 2, 945T>C thể đồng hợp và 1038A>G thể dị hợp ở exon 8 [56]. ho 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 Ở Sc BỆNH NHÂN MẮC HCTHTP Trên thế giới, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân tích đa hình di @ truyền gen NPHS2 trên những nhóm bệnh nhân mắc hội chứng thận hư khác nhau. Năm 2000, Boute và cộng sự lần đầu phân tích đột biến gen NPHS2 đã ht phát hiện ra đột biến gen lặn trên nhiễm sắc thể thường ở các bệnh nhân người rig Mỹ với HCTH kháng thuốc [21]. Các nghiên cứu trước đây về tần số đột biến py gen NPHS2 trong các quần thể khác nhau cho thấy chủng tộc đóng một vai trò quan trọng. Các đa hình di truyền gen NPHS2 đã được công bố có ảnh hưởng Co 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
khác nhau đến các đặc điểm lâm sàng như protein niệu xuất hiện sớm, tiến U triển nhanh đến bệnh thận giai đoạn cuối và sự khác biệt về thể mô bệnh học VN [19, 44, 65]. Tuy nhiên, không có sự đồng thuận về exon nào ảnh hưởng đến HCTH hơn hay đột biến trên exon nào có hại nhất [32]. Năm 2007, Berdeli y, nghiên cứu đột biến gen NPHS2 trên 295 trẻ em ở Thổ Nhĩ Kì mắc HCTHTP ac kháng thuốc thấy: 41 bệnh nhân (chiếm tỉ lệ 13,8%) có tiền sử gia đình và 254 bệnh nhân (chiếm 86,2%) là trường hợp ngẫu nhiên. Phân tích trên 8 exon của rm gen NPHS2 bằng phương pháp giải trình tự thấy có 53 đột biến, trong đó 37 đột biến mới. Tỷ lệ phát hiện đột biến là 24,7% trên tất cả các bệnh nhân, a Ph 29,2% ở nhóm có tiền sử gia đình và 24% ở nhóm ngẫu nhiên [18]. Trong nghiên cứu của Basiratnia và cộng sự năm 2013 trên 99 trẻ em mắc hội chứng d thận hư ở Tây Nam Iran, sau khi phân tích kết quả trên hai nhóm là nhóm an kháng corticosteroid (49 bệnh nhân) và nhóm nhạy cảm với corticosteroid (50 bệnh nhân), đã đề xuất phác đồ điều trị mới cho nhóm trẻ em mắc HCTH ine kháng thuốc dựa trên xác định các đột biến gen NPHS2 [51]. Joshi và cộng sự năm 2013 đã chỉ ra trong nghiên cứu của mình sự biểu hiện đa dạng về đột dic biến gen NPHS2 ở các chủng người và các quốc gia khác nhau. Từ đó đề xuất sự tiếp cận có hệ thống để kiểm tra di truyền cho từng bệnh nhân mắc HCTH Me kháng thuốc nhằm hỗ trợ các bác sĩ trong việc lựa chọn điều trị thích hợp [40]. Mặc dù vậy, cũng có một số nghiên cứu phân tích các exon khác nhau of của gen NPHS2 trên đối tượng bệnh nhân mắc HCTH lại không tìm thấy đột ol biến gen nào. Nghiên cứu của Dedi Rachmadi và cộng sự năm 2015 trên đối ho tượng bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư kháng steroid ở Indonesia đã phân tích các đa hình di truyền trên các exon 1, 2 và 8 bằng phương pháp giải Sc trình tự gen và mối liên quan với các biểu hiện lâm sàng. Kết quả cho thấy không có mối tương quan giữa 6 đa hình di truyền gen NPHS2 đã xác định @ được với các biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân (p>0,05) và không tìm thấy đột biến mới. Tuy nhiên, tác giả cũng đưa ra kết luận trong nghiên cứu này ht chỉ có 28 trên 59 mẫu giải trình tự thành công do hạn chế về thời gian và tài rig chính [28]. Vì vậy có thể các exon khác của gen mã hóa cho protein podocin đóng vai trò trong cơ chế sinh bệnh học của hội chứng thận hư kháng py Co 12 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma