Khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao chiết kim thất láng (Gynura nitida DC., Asteraceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG<br /> CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT<br /> KIM THẤT LÁNG (GYNURA NITIDA DC., ASTERACEAE)<br /> Trần Thị Nguyệt Ánh*, Trần Thị Ngọc Tú*, Bùi Mỹ Linh**, Đỗ Thị Hồng Tươi*<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Mở đầu: Đề tài cung cấp cơ sở về tính an toàn và tác dụng dược lý của Kim thất láng qua khảo sát độc tính<br /> cấp đường uống và tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của dược liệu này.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Cây Kim thất láng được chiết với 4 dung môi khác nhau. Dựa trên kết quả khảo<br /> sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp DPPH, chọn cao chiết tiềm năng. Khảo sát độc tính cấp<br /> đường uống và xác định LD50 của cao chiết tiềm năng bằng phương pháp Behrens; tác động chống oxy hóa, bảo vệ<br /> gan trên chuột nhắt gây tổn thương gan bằng cách cho uống paracetamol liều 400 mg/kg.<br /> Kết quả: Cao tiềm năng là cao cồn 50% (hiệu suất chiết 26,2%) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa in vitro với<br /> EC50 là 615,23 µg/ml. Khi cho uống, LD50 trên chuột nhắt của cao cồn 50% từ Kim thất láng là 25,64 ± 1,39 g<br /> cao/kg. Cho chuột uống paracetamol 400 mg/kg gây tổn thương gan, làm tăng đáng kể hoạt tính AST, ALT huyết.<br /> Cao Kim thất láng ở liều 130 và 260 mg/kg làm giảm hoạt tính AST, ALT huyết, hàm lượng MDA trong gan,<br /> phục hồi GSH so với lô chứng bệnh. Liều 260 mg/kg cho tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan tốt hơn liều 130<br /> mg/kg và tương đương với thuốc đối chứng silymarin 100 mg/kg, đưa hàm lượng MDA và GSH của gan trở về<br /> như mức sinh lý bình thường. Phân tích đại thể và vi thể gan cho thấy việc uống cao Kim thất láng trong 7 ngày<br /> làm giảm tổn thương gan do paracetamol gây ra.<br /> Kết luận: Cao cồn 50% từ Kim thất láng thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt với LD50 là 25,64<br /> ± 1,39 g/kg và tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan ở liều 130 mg/kg và 260 mg/kg; trong đó liều 260 mg/kg có tác<br /> động tương đương silymarin liều 100 mg/kg.<br /> Từ khóa: Kim thất láng, độc tính cấp, paracetamol, chống oxy hóa, bảo vệ gan.<br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON ACUTE ORAL TOXICITY AND ANTIOXIDANT, HEPATOPROTECTIVE EFFECTS<br /> OF EXTRACTS FROM GYNURA NITIDA DC., ASTERACEAE<br /> Tran Thi Nguyet Anh, Tran Thi Ngoc Tu, Bui My Linh, Do Thi Hong Tuoi<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 647 – 654<br /> <br /> Introduction: The aim of this study is to evaluate acute oral toxicity and antioxidant, hepatoprotective effects<br /> of Gynura nitida DC., Asteraceae in order to provide the evidences about the safety and pharmacological effect of<br /> this plant.<br /> Methods: Dry material was extracted with 4 different solvents (96%, 70%, 50% ethanol and water). Based<br /> on the in vitro antioxidant activity of the extracts by DPPH test, potential solvent was selected. The oral acute<br /> toxicity was evaluated in mice and LD50 estimated by Behrens method. The antioxidant and hepatoprotective<br /> effects of G. nitida extracts were examined in mice induced liver damage by oral administration of 400 mg/kg<br /> paracetamol.<br /> <br /> *<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> **<br /> Khoa Dược, Trường Đại học Buôn Ma Thuột<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. Đỗ Thị Hồng Tươi ĐT: 0908683080 Email: hongtuoi@ump.edu.vn<br /> <br /> Chuyên Đề Dược 647<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Results: The potential solvent is 50% ethanol (rendement of extraction de 26.2%). This extract expressed<br /> acute oral toxicity with value of EC50 of 615.23 g/ml. For oral acute toxicity of 50% ethanol extract in mice, LD50<br /> was 25.64 ± 1.39 g/kg. Oral administration of 400 mg/kg paracetamol induced liver injury associated to<br /> significant increases in AST, ALT. The oral doses of 130 and 260 mg/kg of G. nitida extract decreased ALT, AST,<br /> MDA levels and increased GSH compared to pathological group. The antioxidant and hepatoprotective effects of<br /> dose of 260 mg/kg were better than those of 130 mg/kg; this effect was similar to that of 100 mg/kg silymarin with<br /> normal MDA and GSH levels as those of physiological group. Macro-and micro-analyse of liver showed that oral<br /> administration of G. nitida extract for 7 days decreased paracetamol-induced liver injury.<br /> Conclusion: The 50% ethanol extract of G. nitida had oral acute toxicity in mice with LD50 of<br /> 25.64 ± 1.39 g/kg as well as expressed antioxidant, hepatoprotective effects at the doses of 130 mg/kg and 260<br /> mg/kg; effects at 260 mg/kg similar to those of 100 mg/kg silymarin.<br /> Key words: Gynura nitida DC., acute toxicity, paracetamol, antioxidant, hepatoprotective effect<br /> ĐẶT VẤNĐỀ hóa, bảo vệ gan của cây Kim thất láng còn<br /> rất hạn chế. Từ những cơ sở trên, đề tài thực<br /> Gan dễ bị ảnh hưởng bởi chất độc nên bệnh hiện “Khảo sát độc tính cấp đường uống và<br /> gan đa dạng và phức tạp. Xu hướng điều trị tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của Kim<br /> bệnh gan hiện nay là sử dụng thuốc từ dược liệu thất láng (Gynura nitida DC.)”<br /> nhờ ưu điểm có thể sử dụng lâu dài, an toàn. ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Gần đây, Kim thất láng (Gynura nitida Mẫu thử<br /> DC., Asteraceae) thường gọi là Rau rừng,<br /> Phần trên mặt đất cây Kim thất láng thu hái<br /> được người dân ưa thích và phân phối trong<br /> tại Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk vào tháng 10/2016,<br /> siêu thị ở nhiều tỉnh của Việt Nam(5,11). Một<br /> được định danh, cung cấp bởi PGS.TS. Bùi Mỹ<br /> số báo cáo cho thấy các loài trong chi Gynura<br /> Linh, Trường Đại học Buôn Ma Thuột.<br /> có tác dụng kháng viêm, chống oxy hóa. G.<br /> procumbens sử dụng trong dân gian ở Thái Hóa chất<br /> Lan trị viêm tại chỗ, thấp khớp, bệnh do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), acid<br /> virus(1,6). Dịch chiết ether của G. bicolor ngăn ascorbic, MDA chuẩn, GSH chuẩn, acid<br /> cản hoạt động của NF-κB, ức chế sản xuất thiobarbituric (Sigma-Aldrich, Mỹ); paracetamol<br /> NO, PGE2, giảm đáp ứng viêm ở tế bào (Sanofi-Aventis, Việt Nam); thuốc thử Folin-<br /> RAW 267.7(16). Dịch chiết ethyl acetat của G. Ciocalteu, methanol, acid tricloroacetic (TCA),<br /> bicolor chứa hợp chất phenol có hoạt tính Tris-HCl (Merck, Đức), silymarin (viên<br /> chống oxy hóa mạnh(16). G. procumbens thể Légalon®, số lô: B1600984, ngày sản xuất:<br /> hiện khả năng khử DPPH tương ứng với 01/4/2016; hạn dùng: 31/3/2021, Madaus GmbH,<br /> tổng lượng phenolic theo thứ tự dịch chiết Đức), formalin, NaCl, KCl (Guangdong<br /> methanol > ethanol > nước; khả năng ức chế Guanghua, Trung Quốc).<br /> CYP3A4, CYP1A2 tương ứng với lượng Động vật nghiên cứu<br /> flavonoid: dịch chiết ethanol > methanol > Chuột nhắt Swiss albino đực và cái, 5-6 tuần<br /> nước(1). Theo Wan và cộng sự (2014), dịch<br /> tuổi, trọng lượng trung bình 22-25 g, do Viện<br /> chiết từ lá G. formosana có khả năng chống<br /> Vaccin và sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp.<br /> oxy hóa, khử gốc tự do phụ thuộc lượng<br /> hợp chất phenolic và flavonoid ở những Chuột khoẻ mạnh, nuôi ổn định 5 ngày trong<br /> nhiệt độ khác nhau(15). Tuy nhiên, các báo lồng 25x35x15 cm (6 chuột/lồng), cung cấp thức<br /> cáo về tính an toàn và tác động chống oxy ăn, nước uống đầy đủ.<br /> <br /> <br /> 648 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu theo cấp số cộng khoảng từ LD0 - LD100. Theo dõi<br /> Chiết xuất dược liệu chuột trong 72 giờ, ghi nhận biểu hiện độc (cử<br /> Cao được chiết nóng theo tỷ lệ 1 g bột dược động tổng quát, hành vi, trạng thái lông, ăn<br /> liệu với 10 ml dung môi (nước, cồn 50%, 70%, uống, tiêu tiểu…), số chuột chết/sống, lập bảng<br /> 96% hoặc dung môi tiềm năng) ở 90 oC, chiết 3 số liệu, tính LD50.<br /> Số lượng thực tế Số lượng tích lũy<br /> lần, 30 phút/lần; dịch chiết được bốc hơi dung Liều Số Tổng Số Số %<br /> môi trên bếp cách thủy ở 50 oC và cô giảm áp thu Số chết Tổng số<br /> sống số chết sống chết<br /> hồi dung môi, thu cao toàn phần, hút ẩm đến (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)<br /> khối lượng không đổi (trong bình hút ẩm). LD50 được tính theo phương pháp Behrens:<br /> Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro LD50 = D1 + [(50-a) x d]/(b-a)<br /> bằng phương pháp DPPH(14) Trong đó: D1: liều có % chết sát dưới 50%; a:<br /> Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu tỷ lệ thuận % chết sát dưới 50%; b: % chết sát trên 50%; d:<br /> với sự giảm cường độ màu của DPPH và được khoảng cách giữa liều có % chết sát dưới 50% và<br /> xác định bằng cách đo OD ở 517 nm. Kết quả sát trên 50%.<br /> được tính theo công thức: HTCO (%) = [(ODchứng - Tính sai số chuẩn của LD50: Vẽ đồ thị biểu diễn<br /> ODthử)/ ODchứng] × 100. Mẫu chứng (có DPPH, % chết tích lũy theo liều, xác định LD16 và LD84.<br /> không có mẫu thử) và acid ascorbic được tiến Sai số chuẩn của LD50 tính theo công thức:<br /> hành song song. Xác định EC50 (nồng độ có<br /> , với s = (LD84 - LD16)/2 là phân phối<br /> HTCO 50%) bằng phần mềm Excel 2010.<br /> Khảo sát chất lượng của cao toàn phần chuẩn; hằng số Behrens k = 0,66; d: bước nhảy<br /> tiềm năng liều giữa 2 liều gần LD50; n: số chuột trung bình<br /> của các nhóm. Nếu sau 72 giờ, chuột không có<br /> Dựa vào hoạt tính chống oxy hóa in vitro của<br /> dấu hiệu bất thường hoặc chết, theo dõi tiếp<br /> 04 cao, xác định dung môi tiềm năng, chiết cao<br /> trong 14 ngày. Chuột chết trong thời gian quan<br /> tiềm năng. Độ tinh khiết (độ ẩm, độ tro toàn<br /> sát, mổ xác để xem nguyên nhân chết. Những<br /> phần, độ tro không tan trong acid) của cao tiềm<br /> chuột sống sau 14 ngày được mổ để xem các cơ<br /> năng được xác định theo các phụ lục tương ứng<br /> quan bên trong có bất thường không.<br /> trong Dược điển Việt Nam V(2). Hợp chất<br /> polyphenol trong cao tiềm năng được định Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan<br /> lượng bằng phương pháp Folin - Ciocalteu sử trên chuột nhắt(9,10)<br /> dụng chất chuẩn pyrogallol(2,12). Chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 lô<br /> Khảo sát độc tính cấp đường uống trên (n = 6): lô 1 (sinh lý) và lô 2 (chứng bệnh): uống<br /> chuột nhắt nước cất, lô 3 (đối chiếu): uống silymarin 100<br /> mg/kg, lô 4, 5: uống cao thử lần lượt với liều 130<br /> Thực hiện theo “Hướng dẫn thử nghiệm<br /> và 260 mg/kg; uống 1 lần/ngày vào buổi sáng,<br /> tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ<br /> thể tích 10 ml/kg, liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ<br /> dược liệu” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định<br /> 7, sau 1 giờ cho chuột uống nước cất, cao thử<br /> số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015(3). Chuột (50%<br /> hoặc silymarin, gây độc gan cho chuột (trừ lô 1)<br /> đực, 50% cái) được nhịn đói ít nhất 12 giờ, cho<br /> bằng cách cho uống paracetamol liều duy nhất<br /> uống cùng liều cao thử trong điều kiện ổn định,<br /> 400 mg/kg. Sau 6 giờ cho uống paracetamol, gây<br /> quan sát trong 72 giờ. Giai đoạn sơ bộ xác định<br /> mê chuột bằng đá CO2, mổ lấy máu tim đo hoạt<br /> liều lớn nhất không làm chết con nào (LD0) và<br /> tính ALT (alanin aminotransferase), AST<br /> liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100). Sau đó,<br /> (aspartat aminotransferase) bằng phương pháp<br /> chia chuột làm 5 lô (10 con/lô), chia liều ở các lô<br /> đo động học enzym; tách gan, quan sát đại thể,<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 649<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> ghi trọng lượng. Một phần gan được ngâm trong hóa in vitro của 4 cao ở nồng độ 1000 µg/ml lần<br /> formol 10% để nhuộm hematoxylin-eosin (HE), lượt là 20,89%, 48,21%, 73,62% và 10,05%. Từ đó,<br /> phân tích vi thể; phần còn lại để định lượng<br /> khảo sát hoạt tính chống oxy ở các nồng độ khác<br /> MDA, GSH.<br /> của cao cồn 50% để xác định EC50 so với chất acid<br /> Định lượng malonyl dialdehyd (MDA),<br /> ascorbic. Dựa theo phương trình tuyến tính giữa<br /> glutathion (GSH) trong gan: một phần gan được<br /> nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của cao Kim<br /> nghiền đồng thể trong KCl 1,15% (tỉ lệ 1g:10 ml)<br /> thất láng (y = 0,0543x + 16,593, R² = 0,9934) và<br /> ở 0-4°C. Lấy 2 ml dịch đồng thể, thêm 1 ml Tris-<br /> chất đối chứng acid ascorbic (y = 6,9411x - 0,4636,<br /> HCl ủ 60 phút ở 37°C; thêm 1 ml TCA 10%, ly<br /> R² = 0,9936), xác định EC50 của cao cồn 50% và<br /> tâm 15 phút 10000 rpm ở 4°C; lấy 2 ml dịch trong<br /> acid ascorbic lần lượt là 615,23 và 7,27 µg/ml.<br /> phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở<br /> Từ đó, tiến hành chiết cao tiềm năng với<br /> 100°C trong 15 phút, đo OD ở 532 nm để định cồn 50% có hiệu suất chiết 26,2%, thu cao<br /> lượng MDA. Lấy 1 ml dịch đồng thể, thêm 2 ml đặc, màu xanh đen đậm, có mùi thơm đặc<br /> Tris-HCl ủ 60 phút ở 37°C; thêm 1 ml TCA 10%, trưng của dược liệu.<br /> ly tâm 15 phút, 10000 rpm ở 4oC; lấy 1 ml dịch Chất lượng của cao cồn 50%<br /> trong phản ứng với 1,8 ml đệm phosphat-EDTA, Cao có độ ẩm trung bình 10,8%, độ tro toàn<br /> 0,2 ml thuốc thử Ellman, ủ ở nhiệt độ phòng 3 phần trung bình là 8,8%, độ tro không tan trong<br /> phút, đo OD ở 412 nm để định lượng GSH. Hàm acid trung bình 0,6%. Cao chứa nhóm hợp chất<br /> lượng MDA và GSH (nmol/ml dịch đồng thể) polyphenol với hàm lượng polyphenol toàn<br /> được tính theo phương trình hồi quy của phần theo phương pháp Folin-Ciocalteu là 85 mg<br /> MDA/GSH chuẩn. Từ đó, xác định hàm lượng pyrogallol/g cao.<br /> MDA hoặc GSH (nmol/g protein) theo công<br /> Độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt của<br /> thức: C = Cnmol/ml × 1000/Cprotein; trong đó Cprotein xác cao cồn 50% từ cây Kim thất láng<br /> định bằng phương pháp Bradford dựa vào<br /> Cho chuột uống đồng lượng cao thử ở nồng<br /> đường cong chuẩn độ của albumin huyết thanh<br /> độ tối đa phân tán trong nước cất qua kim là<br /> bò (BSA)(4).<br /> 1500 mg/ml, thể tích cho chuột uống 20 ml/kg<br /> Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê<br /> (tương đương 30 g cao/kg). Quan sát thấy chuột<br /> Kết quả xử lý bằng Excel, trình bày dạng giá<br /> giảm di chuyển, thở nhanh trong 2-3 phút. Sau 5<br /> trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung<br /> phút, chuột co thắt thành bụng kéo dài 30 phút.<br /> bình (Mean ± SEM), phân tích thống kê bằng test<br /> Khoảng từ 30 - 60 phút, 20% (2/10) chuột co giật<br /> Kruskal-Wallis và Mann-Whitney (phần mềm<br /> và chết, số chuột còn lại di chuyển, ăn cám và<br /> SPSS 20.0). Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.<br /> uống nước bình thường. Sau 72 giờ, 60% (6/10)<br /> KẾTQUẢ<br /> chuột chết. Tiến hành giảm liều cao thử, kết quả<br /> Hiệu suất chiết và hoạt tính chống oxy hóa cho thấy liều cao nhất không gây chết chuột<br /> của các cao toàn phần<br /> (LD0) là 14 g cao/kg. Tiến hành xác định LD50: Số<br /> Hiệu suất chiết cao với 04 dung môi cồn 96%,<br /> lượng chuột chết và sống ở mỗi lô sau 72 giờ<br /> cồn 70%, cồn 50% và nước lần lượt là 8,13%,<br /> được trình bày ở Bảng 1.<br /> 18,67%, 25,93% và 22,93%. Hoạt tính chống oxy<br /> <br /> <br /> <br /> 650 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 1: Số lượng chuột chết/sống ở mỗi lô uống Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo của<br /> cao Kim thất láng cao cồn 50% từ cây Kim thất láng<br /> Số lượng chuột thực Liều có thể dùng trong thử nghiệm sinh lý<br /> Số lượng chuột tích lũy<br /> Liều tế<br /> (g/kg)<br /> (Ds) ở chuột nhắt không vượt quá 1/10 LD50(5). Do<br /> Số Số Tổng Số Số Tổng<br /> % chết đó, đề tài chọn liều cho uống của cao cồn 50% là<br /> chết sống số chết sống số<br /> 14 0 10 10 0 34 34 0 130 mg/kg và 260 mg cao/kg (tương ứng 1/200 và<br /> 18 2 8 10 2 24 26 7,69 1/100 LD50, tương đương 500 mg và 1000 mg bột<br /> 22 3 7 10 5 16 21 23,81 dược liệu khô/kg) để khảo sát tác động chống<br /> oxy hóa, bảo vệ gan trên chuột nhắt được gây<br /> 26 5 5 10 10 9 19 52,63<br /> tổn thương gan bằng paracetamol.<br /> 30 6 4 10 16 4 20 80,00<br /> Tác động lên hoạt tính enzym gan<br /> Giá trị LD50 xác định theo phương pháp<br /> Behrens: Tác động của cao Kim thất láng lên hoạt tính<br /> enzym AST, ALT được trình bày trong Bảng 2.<br /> LD50 = D1 + [(50-a) x d]/(b-a) = 22 + [(50 -<br /> 23,81) x 4]/(52,63 - 23,81) = 25,64 mg/kg Bảng 2: Hoạt tính AST, ALT ở các lô chuột thử nghiệm<br /> Lô (n = 6) AST (U/L) ALT (U/L)<br /> Đồ thị biểu diễn tỷ lệ phần trăm chết tích lũy Sinh lý 123,78 ± 6,92 62,78 ± 4,61<br /> (%) theo liều dùng ở Hình 1. Chứng bệnh 5975,22 ± 292,76<br /> ***<br /> 9910,62 ± 446,31<br /> ***<br /> <br /> Silymarin 100 ***## ***##<br /> 2449,82 ± 635,53 4834,17 ± 1222,15<br /> mg/kg<br /> Cao thử liều ***## ***##<br /> 4166,92 ± 144,96 7508,58 ± 548,42<br /> 130 mg/kg<br /> Cao thử liều ***## ***##<br /> 2448,63 ± 459,07 3965,93 ± 719,95<br /> 260 mg/kg<br /> ***<br /> p < 0,001 so với lô sinh lý, ##p < 0,01 so với lô chứng bệnh<br /> Hoạt tính AST, ALT của lô chứng bệnh cao<br /> hơn lô sinh lý (p < 0,001; AST tăng 48,3 lần,<br /> ALT tăng 157,9 lần). Khi dự phòng tổn thương<br /> gan bằng cách cho chuột uống silymarin 100<br /> Hình 1: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ chết tích lũy (%) theo mg/kg hoặc cao thử liều 130 và 260 mg/kg,<br /> liều uống cao Kim thất láng hoạt tính AST, ALT của chuột giảm có ý nghĩa<br /> Từ đồ thị, xác định LD16 = 16,07 g/kg và LD84 so với lô chứng bệnh (p < 0,01). Cụ thể: lô<br /> = 30,67 g/kg. silymarin, AST giảm 2,43 lần và ALT giảm<br /> 2,05 lần; lô cao thử liều 130 và 260 mg/kg: AST<br /> Phân phối chuẩn s = (LD84 - LD16)/2 = (30,67 –<br /> giảm lần lượt 1,43 và 2,44 lần; ALT giảm lần<br /> 16,07)/2 = 7,3 lượt 1,32 và 2,50 lần. Tác dụng của cao Kim<br /> Sai số chuẩn của LD50 tính theo công thức: thất láng liều 260 mg/kg khác biệt không có ý<br /> k .s .d nghĩa so với silymarin 100 mg/kg (p > 0,05).<br /> Es   0 , 66 x 7 ,3 x 4  / 10  1 , 39<br /> n Giữa 2 liều cao thử, liều 260 mg/kg giảm hoạt<br /> Vậy LD50 của cao cồn 50% từ cây Kim thất tính ALT tốt hơn liều 130 mg/kg (p < 0,05; thấp<br /> láng là 25,64 ± 1,39 (g/kg). hơn 1,9 lần); hoạt tính AST của chuột uống cao<br /> Chuột chết trong thử nghiệm và chuột sống thử liều 130 mg/kg cao gấp 1,7 lần so với liều<br /> 260 mg/kg nhưng khác biệt không có ý nghĩa<br /> sau 14 ngày được mổ, quan sát đại thể cho thấy<br /> (p > 0,05); do số lượng chuột thử nghiệm ít,<br /> không có sự thay đổi về đại thể ở tất cả chuột khoảng dao động giữa các chuột trong một<br /> thử nghiệm. lô rộng.<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 651<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Tác động lên hàm lượng MDA, GSH của gan 2 liều của cao thử, lượng GSH ở lô uống liều 260<br /> Từ phương trình tuyến tính của protein mg/kg cao hơn lô 130 mg/kg (p < 0,01).<br /> (y = 0,1704x + 0,2541, R2 = 0,9553), MDA chuẩn<br /> Tác động lên đại thể, vi thể gan<br /> (y = 0,0356x + 0,0912, R² = 0,9936) và GSH chuẩn<br /> Về đại thể, tất cả chuột sinh lý đều có<br /> (y = 0,0007x + 0,1431, R² = 0,9951) suy ra hàm<br /> gan màu đỏ, không phù mề, mặt nhẵn và<br /> lượng MDA và GSH trong gan (Bảng 3).<br /> mềm mại. Chuột chứng bệnh có gan bạc<br /> Bảng 3: Hàm lượng MDA, GSH trong gan của màu, bề mặt có chấm trắng và sung huyết.<br /> các lô chuột thử nghiệm Đa số chuột ở 2 lô cao thử và lô silymarin có<br /> Lô (n = 6) nmol MDA/g nmol GSH/g protein<br /> protein<br /> gan màu đỏ, bề mặt nhẵn, không nổi nốt<br /> Sinh lý 2,96 ± 0,27 972,93 ± 39,28 trắng hoặc sung huyết.<br /> ** **<br /> Chứng bệnh 14,33 ± 2,09 153,61 ± 15,09 Kết quả phân tích vi phẫu gan chuột ở các lô<br /> ## *##<br /> Silymarin 2,63 ± 0,29 685,81 ± 102,28 được trình bày trong Bảng 4 và Hình 2.<br /> liều 100 mg/kg<br /> ## **##<br /> Cao thử 3,92 ± 0,34 287,26 ± 26,94 Bảng 4: Kết quả phân tích vi phẫu gan chuột thử<br /> liều 130 mg/kg nghiệm<br /> ## ##<br /> Cao thử 2,39 ± 0,37 916,20 ± 85,65<br /> liều 260 mg/kg Lô<br /> Kết quả phân tích vi phẫu gan<br /> (n=6)<br /> *<br /> p < 0,05 và **p < 0,01 so với lô sinh lý 6/6 mẫu gan bình thường, không viêm hay<br /> Sinh lý<br /> ## p < 0,01 so với lô chứng bệnh hoại tử.<br /> 4/6 mẫu gan viêm mức độ 8/18 (hoại tử<br /> Hàm lượng MDA ở lô chứng bệnh tăng 4,84 quanh tĩnh mạch trung tâm 6/6 và trong tiểu<br /> Chứng bệnh thùy gan: 2/4); 2/6 mẫu gan viêm mức độ<br /> lần so với lô sinh lý (p < 0,01). Lô silymarin 100 6/18 (hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm 4/6<br /> mg/kg và 2 lô thử đều có hàm lượng MDA gan và trong tiểu thùy gan: 2/4)<br /> Silymarin 3/6 mẫu gan viêm mức độ 8/18<br /> thấp hơn lô chứng bệnh (p < 0,01), cụ thể MDA ở 100 mg/kg 3/6 mẫu gan viêm mức độ 6/18<br /> 3 lô này giảm lần lượt 5,45; 3,66 và 5,60 lần và 1/6 mẫu gan viêm mức độ 8/18; 1/6 mẫu gan<br /> viêm mức độ 7/18 (hoại tử quanh tĩnh mạch<br /> không khác biệt có ý nghĩa so với sinh lý (p > Cao Kim thất trung tâm 5/6 và trong tiểu thùy gan: 2/4); 2/6<br /> 0,05). Ngoài ra, hàm lượng MDA ở lô cao liều láng liều mẫu gan viêm mức độ 6/18; 1/6 mẫu gan<br /> 130 mg/kg viêm mức độ 4/18 (hoại tử quanh tĩnh mạch<br /> 260 mg/kg thấp hơn có ý nghĩa so với liều 130 trung tâm 3/6 và trong tiểu thùy gan: 1/4); 1/6<br /> mẫu gan viêm mức độ 3/18<br /> mg/kg (p < 0,05) và không khác biệt so với<br /> Cao Kim thất 3/6 mẫu gan viêm mức độ 7/18<br /> silymarin 100 mg/kg (p > 0,05). láng liều<br /> 3/6 mẫu gan viêm mức độ 6/18<br /> 260 mg/kg<br /> Về hàm lượng GSH trong gan, lô chứng<br /> Kết quả cho thấy lô sinh lý không chuột<br /> bệnh giảm 6,33 lần so với lô sinh lý (p < 0,01).<br /> nào xuất hiện tình trạng viêm gan. Với lô<br /> Lượng GSH của lô silymarin 100 mg/kg, 2 lô cao<br /> chứng bệnh, xuất hiện tình trạng viêm gan<br /> Kim thất láng liều 130 và 260 mg/kg tăng lần<br /> cấp thể hiện qua những bất thường trên đại<br /> lượt 4,46; 1,87 và 5,96 lần so với lô chứng bệnh (p<br /> thể và vi thể gan (hoại tử nặng tế bào gan).<br /> < 0,01). Hàm lượng GSH ở lô silymarin và lô cao<br /> Khi cho chuột uống cao cồn 50% từ Kim thất<br /> liều 130 mg/kg lần lượt bằng khoảng 70% và 30%<br /> láng liều 130 và 260 mg/kg hoặc mẫu đối<br /> lô sinh lý (p < 0,05). Ở lô cao thử liều 260 mg/kg,<br /> chứng silymarin 100 mg/kg, kết quả cho<br /> GSH gan phục hồi gần trở về mức sinh lý<br /> thấy có sự giảm tổn thương gan do<br /> (khoảng 94%, p > 0,05), khác biệt không có ý<br /> paracetamol gây ra rõ rệt.<br /> nghĩa so với silymarin 100 mg/kg (p > 0,05). Giữa<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 652 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm Hoại tử tiểu thùy gan<br /> <br /> Hình 2: Vi thể cấu trúc tế bào gan<br /> BÀNLUẬN tác dụng dược lý của các loài thuộc chi Gynura<br /> như khả năng chống oxy hóa, cải thiện sự tăng<br /> Từ hiệu suất chiết và hoạt tính chống oxy<br /> hoạt tính AST, ALT của dịch chiết G. formosana<br /> hóa in vitro khảo sát bằng phương pháp DPPH,<br /> trên chuột cống bị viêm gan nhiễm mỡ không do<br /> cồn 50% được chọn là dung môi tiềm năng để<br /> rượu và cao chiết G. procumbens trên thỏ bị tổn<br /> chiết khối lượng lớn cao Kim thất láng. Cao cồn<br /> thương gan do chế độ ăn giàu cholesterol(7,8,14,15).<br /> 50% thể hiện hoạt tính chống oxy hóa in vitro với<br /> EC50 615,23 mg/ml, hàm lượng polyphenol toàn KẾTLUẬN<br /> phần tương ứng 85 mg pyrogallol/g cao, phù Cao cồn 50% từ cây Kim thất láng thể hiện<br /> hợp với một số báo cáo về hàm lượng độc tính cấp đường uống với LD50 là 25,64 ± 1,39<br /> polyphenol của G. procumbens khoảng 70,7 mg g/kg. Cho chuột nhắt uống cao liều 130 và 260<br /> GAE/g cao và một số loài chi Gynura có hoạt tính mg/kg trong 7 ngày liên tiếp thể hiện tác động<br /> chống oxy hóa theo cơ chế bắt gốc tự do .(1)<br /> chống oxy hóa, bảo vệ gan, giảm tổn thương gan<br /> Đề tài khảo sát khả năng chống oxy hóa, bảo do paracetamol gây ra; trong đó liều 260 mg/kg<br /> vệ gan in vivo của cao cồn 50% từ cây Kim thất tác động tốt hơn liều 130 mg/kg và tương tự tác<br /> láng trên chuột nhắt gây tổn thương gan bằng động của silymarin 100 mg/kg. Đề tài mở ra triển<br /> paracetamol đã được báo cáo với liều 200 - 400 vọng nghiên cứu và phát triển sản phẩm từ Kim<br /> mg/kg có thể gây độc gan trong vòng 6-24 giờ(10). thất láng ứng dụng trong phòng và/hoặc điều trị<br /> Kết quả cho thấy paracetamol làm tăng AST, các bệnh về gan.<br /> ALT, MDA và giảm GSH tương tự báo cáo của TÀILIỆUTHAMKHẢO<br /> Madkour và cộng sự (2013) . Cao chiết Kim thất<br /> (9) 1. Afandi A, et al. (2014), “Antioxidant properties of Gynura<br /> procumbens extracts and their inhibitory effects on two major<br /> láng cho uống liều 130 và 260 mg/kg thể hiện tác human recombinant cytochrome P450s using a high<br /> động chống oxy hóa, bảo vệ gan; giúp giảm hoạt throughput luminescence assay”, Asian journal of Pharmaceutical<br /> and Clinical Research, 7(5), pp. 36-41.<br /> tính AST, ALT, hàm lượng MDA và tăng GSH, 2. Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam 5, NXB Y học, PL<br /> 203, 204, 205.<br /> đặc biệt với liều 260 mg/kg thể hiện tác dụng<br /> 3. Bộ Y tế (2015), Quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015,<br /> tương tự silymarin 100 mg/kg, giúp giá trị MDA Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông<br /> y, thuốc từ dược liệu.<br /> và GSH trở về gần với mức sinh lý. Tác dụng 4. Bradford MM (1976), “A rapid and sensitive method for the<br /> bảo vệ gan của cao Kim thất láng còn được quantitation of microgram quantities of protein utilizing the<br /> principle of protein-dye binding”, Analytical Biochemistry, 72,<br /> khẳng định bởi sự giảm tổn thương gan ở các lô pp. 248 - 254.<br /> điều trị so với lô chứng bệnh khi phân tích vi thể 5. Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính<br /> của thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr.15-157, 199-215.<br /> cấu trúc gan. Tác động chống oxy hóa, bảo vệ<br /> gan của Kim thất láng phù hợp với báo cáo về<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 653<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> 6. Iskander M, et al. (2002), “Antiinflammatory screening of the 14. Wan C, et al. (2011), “Antioxidant activity and free<br /> medical plant Gynura procumbens”, Plant Foods for Human radical-scavenging capacity of Gynura divaricate leaf<br /> Nutrition, 57(3-4), pp. 233-244. extracts at different temperatures”, Pharmacognosy<br /> 7. Ismail MAH, et al. (2016), “Effects of Gynura procumbens extract Magazine, 7(25), pp. 40-45.<br /> on liver function test of hypercholesterolemia induced rabbits”, 15. Wan Y, et al. (2014), “Therapeutical effect of Gynura formosana<br /> 78(6-7), pp. 49-54 alcohol extract on non-alcoholic fatty liver disease in rats”,<br /> 8. Ma J (2017), “Antioxidant and anti-inflammatory activities of Global journal of Intergrated Chinese Medicine and Western<br /> ethyl acetate extract of Gynura formosana leaves”, Experimental Medicine, 2(2).<br /> and therapeutic medicine, 14, pp. 2303-2309. 16. Wu C, et al. (2013), “Antiinflammatory activity of Gynura<br /> 9. Madkour FF, Abdel-Daim MM (2013), “Hepatoprotective and bicolor ether extract through inhibits nuclear factor kappa B<br /> antioxidant activity of Dunaliella salina in paracetamol-induced activation”, Journal of Traditional and Complementary Medicine,<br /> acute toxicity in rats”, Indian journal of Pharmaceutical Sciences, 3(1), pp. 48-52.<br /> 75(6), pp. 642-648.<br /> 10. Maes M, et al. (2016), “Experimental models of hepatotoxicity<br /> related to acute liver failure”, Toxicology and Applied Ngày nhận bài báo: 18/10/2018<br /> Pharmacology, 290, pp. 86-97. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018<br /> 11. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, quyển III, Nhà xuất<br /> bản trẻ, tr. 230-233. Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019<br /> 12. Singleton VL, et al. (1999), “Analysis of total phenols and other<br /> oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-<br /> Ciocalteu reagent”, Methods Enzymol, 299, pp. 152-178.<br /> 13. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 654 Chuyên Đề Dược<br />