Khảo sát tế bào thần kinh ở một số vùng não suy thoái và sự thay đổi yếu tố hỗ trợ dinh dưỡng thần kinh BDNF do trimethyltin (TMT) trên chuột nhắt trắng

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> KHẢO SÁT TẾ BÀO THẦN KINH Ở MỘT SỐ VÙNG NÃO SUY THOÁI<br /> VÀ SỰ THAY ĐỔI YẾU TỐ HỖ TRỢ DINH DƯỠNG THẦN KINH BDNF<br /> DO TRIMETHYLTIN (TMT) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG<br /> Nguyễn Quỳnh Hương**, Nguyễn Phương Dung*, Kiyokazu Ogita**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Những bệnh lý thần kinh xảy ra từ sự suy thóai tế bào thần kinh (TBTK) tùy thuộc vị trí não và<br /> chức năng của nhóm tế bào đặc biệt. Trimethyltin (TMT) gây độc có chọn lọc lên TBTK ở một số vùng não và gây<br /> suy giảm trí nhớ. Việc xác định sự suy thóai TBTK do TMT trên chuột nhắt là cần thiết để nghiên cứu những<br /> yếu tố tổn thương liên quan.<br /> Phương pháp: Đối tựơng: Chuột nhắt trắng (đực), giống Std-ddY, trọng lượng 30-35g, 5 tuần tuổi (Osaka,<br /> Nhật Bản).Nguyên vật liệu: Trimethyltin clorid (TMT) – Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Nhật). Fluoro<br /> Jade B – Millipore, Mỹ. Kháng thể đa dòng vô tính anti-BDNF (brain-derived neurotrophic-factor) (AB1779SP)<br /> từ Chemicon (Millipore), kháng thể anti-rabbit được biotin hóa (Vector Laboratories, USA). Diaminobenzidin<br /> (DAB)/ Hydrogen peroxid của Histofine, Ninirei Co. (Nhật).<br /> Kết quả: Từ kết quả nhuộm Fluoro Jade B: TBTK suy thoái biểu hiện Fluoro Jade B tìm thấy chủ yếu ở vùng<br /> hồi răng; bên cạnh đó cũng ở vùng hành khứu giác, vùng hạch khứu giác trước và ở những lớp tế bào trên của<br /> vùng vỏ não sau khi tiêm TMT.Từ kết quả nhuộm BDNF: TMT gây nên sự giảm biểu hiện của BDNF ở một số<br /> tế bào vùng vỏ não như ở vùng hành khứu giác trong khi gây tăng biểu hiện này ở vùng hồi răng.<br /> Kết luận: TMT gây ra sự hiện diện TBTK suy thoái nhận biết với Fluoro Jade B đặc hiệu ở vùng hồi răng,<br /> vùng hành khứu giác, hạch khứu giác trước, và lớp trên của vùng vỏ não theo thời gian sau khi tiêm TMT. Cơ chế<br /> suy thoái tế bào thần kinh ở những vùng này còn chưa xác định chi tiết.Ngoài ra, vai trò của BDNF trong mô<br /> hình gây độc thần kinh với TMT được ghi nhận tùy thuộc vào từng vùng não.Đây chỉ là một phần của kết quả<br /> nghiên cứu, những nội dung còn lại sẽ đề cập tiếp ở các bài báo khác.<br /> Từ khóa: suy thoái tế bào thần kinh, trimethyltin<br /> <br /> ABSTRACT<br /> PARTIAL STUDY ABOUT NEURODEGENERATIVE REGIONS AND THE CHANGE IN BNDF<br /> EXPRESSION INDUCED BY TRIMETHYLTIN (TMT) IN MICE<br /> Nguyen Quynh Hương, Nguyen Phuong Dung, Kiyokazu Ogita<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 162 - 168<br /> Objective: Mental diseases occur as the result of neurodegeneration depending on brain parts and the<br /> function of specific neurons.Trimethyltin (TMT) induces neuro-toxicity selectively in several brain parts;<br /> therefore it induces memory deficit. Determining neurodegenerative regions induced by TMT in mice is necessary<br /> to study more about the involved harmful factors.<br /> Method: Male mice of 5 week old age, Std-ddY strain, weigh from 30 – 35g from Osaka, Japan. Trimethyltin<br /> chloride (TMT) – Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Japan). Fluoro Jade B – Millipore, Temecula, CA,<br /> USA. Rabbit polyclonal antibody against BDNF (brain-derived neurotrophic-factor) (AB1779SP) from Chemicon<br /> ∗<br /> <br /> Khoa Y Học Cổ Truyền, Đại học Y Dược TP HCM *+ Bộ môn Dược lý, Đại học Setsunan Osaka, Nhật Bản<br /> Tác giả liên lạc: DS. Nguyễn Quỳnh Hương<br /> ĐT: 0933192602<br /> Email: qhbeta@gmail.com<br /> <br /> 162<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> (Millipore), biotinylated secondary antibody against rabbit IgG (Vector Laboratories, CA, USA).<br /> Diaminobenzidine (DAB)/ Hydrogen peroxide của Histofine, Ninirei Co. (Tokyo, Japan).Drug administration:<br /> Adult male Std-ddY mice, weighing 30 – 35 g and 5 weeks of age, were breed with free access to food and water for<br /> at least 4 days before use.Animals were intraperitoneally injected with TMT (2.8 mg/kg) dissolved in phosphatebuffered saline, and then returned to their home cages until the time of decapitation. Histological assessment and<br /> immunohistochemical procedure: Mice were deeply anesthetized with pentobarbital (250 mg/kg, i.p.) and intracardially perfused with saline and then 4% (wt/v) paraformaldehyde. Post-fixed brains were embedded in paraffin,<br /> a cut as sagittal sections of 1- to 3-μm thickness with a microtome, and placed on MAS-coated slide glasses. The<br /> paraffin-embedded brain sections were deparafinized with xylene, ethanol of 100% to 50% (v/v), and<br /> water.Sections so obtained were subjected to specific desired antibody following protocols of their manufacturers.<br /> Stained sections were viewed with an Olympus U-LH100HG microscope.<br /> Results: Result of Fluoro Jade B staining: Fluoro Jade B (+) neuronal cells was present predominantly in the<br /> dentate gyrus; positively in the olfactory bulb, in the anterior olfactory nucleus and in the cortical superficial<br /> layers after TMT injection.Result of BDNF immunostaining: TMT induced a decrease of BDNF expression in<br /> cortical and olfactory neurons. Meanwhile, BDNF (+) neurons were enhanced in the dentate gyrus by TMT.<br /> Conclusion: Here we showed that TMT produced an expression of Fluoro Jade B in the dentate gyrus,<br /> olfactory bulb, anterior olfactory nucleus and partial cerebral cortex of the mice. The mechanism of<br /> neurodegeneration was still defined poorly. Moreover, the role of BDNF in TMT neurotoxicity was suggested<br /> probably region-specific.<br /> Keywords: neurodegeneration, trimethyltin, BDNF<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> factor) (AB1779SP) từ Chemicon (Millipore).<br /> <br /> Những bệnh lý thần kinh xảy ra từ sự suy<br /> thoái tế bào thần kinh (TBTK) tùy thuộc vị trí<br /> não và chức năng của nhóm tế bào đặc<br /> <br /> Diaminobenzidine (DAB)/ Hydrogen peroxide<br /> của Histofine, Ninirei Co. (Nhật).<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> biệt.Trimethyltin (TMT) gây độc có chọn lọc lên<br /> <br /> Mô hình gây suy thoái thần kinh bằng TMT:<br /> <br /> TBTK ở một số vùng não và gây suy giảm trí<br /> <br /> Chuột nhắt 5 tuần tuổi, giống Std-ddY từ 30-35g<br /> <br /> nhớ. Việc xác định sự suy thoái TBTK do TMT<br /> <br /> (Osaka, Nhật Bản) được nuôi trong chuồng kim<br /> <br /> trên chuột nhắt là cần thiết để nghiên cứu những<br /> <br /> lọai trong phòng có chu kỳ sáng/ tối 12h/ 12h, độ<br /> <br /> yếu tố tổn thương liên quan.<br /> <br /> ẩm 55%, nhiệt độ 23˚C. Chuột được ăn uống tự<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> do để ổn định thể chất ít nhất 4 ngày trước thí<br /> nghiệm. Chuột được tiêm phúc mô với TMT liều<br /> duy nhất 2.8 mg/kg rồi thả về chuồng cho đến<br /> <br /> Đối tựơng<br /> <br /> lúc mổ chuột lấy não theo một số thời điểm tính<br /> <br /> Chuột nhắt trắng (đực), giống Std-ddY, trọng<br /> lượng 30-35g, 5 tuần tuổi (Osaka, Nhật).<br /> <br /> Nguyên vật liệu<br /> <br /> từ lúc tiêm. Những thí nghiệm được tiến hành<br /> lặp lại tối thiểu 3 lần (n = 4).<br /> Khảo sát mô học: Mẫu não được cố định<br /> <br /> Trimethyltin chloride (TMT) – Wako Pure<br /> <br /> trong paraffin và cắt theo phương đối xứng dọc<br /> <br /> Chemical Industries Ltd. (Nhật). Fluoro Jade B<br /> <br /> từng lớp có độ dày 1-3 μm. Lớp não cắt và dán<br /> <br /> – Millipore, Mỹ. Kháng thể đa dòng vô tính<br /> <br /> trên phiến kính phủ MAS (Kyoto, Nhật). Quy<br /> <br /> anti-BDNF<br /> <br /> trình<br /> <br /> (brain-derived<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> neurotrophic-<br /> <br /> nhuộm<br /> <br /> mô<br /> <br /> theo<br /> <br /> hóa<br /> <br /> miễn<br /> <br /> dịch<br /> <br /> 163<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> xử lý loại bỏ paraffin khi ngâm qua xylen-cồn từ<br /> <br /> Sự suy thoái TBTK do TMT nhận biết bằng<br /> FJB ở vùng vỏ não(cerebral cortex)<br /> <br /> 100% - 50%-nước cất. Phiến kính ngâm trong 10<br /> <br /> Vỏ não chi phối chức năng thần kinh cao cấp<br /> <br /> mM hệ natri phosphate (pH = 7,0) được ủ tủ ấm<br /> <br /> như nhận thức, cảm giác, trí nhớ.TBTK vùng vỏ<br /> <br /> 10 phút đến 100˚C, rửa với TBST (Tris-buffered<br /> <br /> não có hình dạng phong phú ví dụ hình sao<br /> <br /> saline Tween), rồi ngâm với H2O2 0,03% trong<br /> <br /> (stellate), hạt (granular), tháp (pyramidal). TMT<br /> <br /> methanol 5 phút. Sau 1 giờ ủ với huyết tương dê<br /> <br /> gây suy thoái không chỉ ở vùng hồi răng mà còn<br /> <br /> 5% trong TBST, mẫu được ủ với kháng thể<br /> <br /> ở những lớp trên của vùng vỏ não (hình 2).<br /> <br /> kháng BDNF qua đêm ở nhiệt độ 4˚C.Ngày hôm<br /> <br /> Sự suy thoái TBTK do TMT nhận biết bằng<br /> FJB ở vùng hành khứu giác - HKG<br /> (olfactory bulb, OB) và hạch khứu giác<br /> trước HKGT (anterior olfactory nucleus,<br /> AON)<br /> <br /> (immunohistochemistry) BDNF: Mẫu não được<br /> <br /> sau tiếp tục được ủ với kháng thể tương thích<br /> anti-rabbit được biotin-hóa. Cuối cùng, mẫu<br /> được quan sát và chụp hình bằng kính hiển vi<br /> sau khi xử lý với DAB/ hydrogen peroxidase.<br /> Phương pháp nhuộm Fluoro Jade B: Fluoro<br /> <br /> Tương tự kết quả báo cáo(4), TMT đồng thời<br /> <br /> Jade B (FJB) là thuốc nhuộm đặc hiệu cho TBTK<br /> <br /> gây ra sự suy thoái TBTK ở hành khứu giác và<br /> <br /> bị suy thoái. Quy trình lọai bỏ lớp paraffin cố<br /> <br /> vùng lân cận là hạch khứu giác trước được<br /> <br /> định mẫu tiến hành tương tự qua các dung môi<br /> <br /> phóng to ở hình 3.<br /> <br /> xylen-cồn như trên. Theo hướng dẫn của nhà<br /> FJB 0,0004%, sau đó được rửa nước cất 3 lần 1<br /> <br /> BDNF (brain-derived neurotrophic factor) ở<br /> một số vùng não chuột thử nghiệm tiêm<br /> TMT<br /> <br /> phút/ lần. Sau khi để khô, mẫu được ngâm trong<br /> <br /> BDNF biểu hiện khác nhau ở các vùng não<br /> <br /> xylen ít nhất 1 phút. Mẫu được quan sát và chụp<br /> <br /> của chuột không tiêm TMT. TMT gây giảm biểu<br /> <br /> hình lại dưới kính hiển vi huỳnh quang. Hình<br /> <br /> hiện của BDNF ở những vùng có suy thoái như<br /> <br /> ảnh nền từ chuột chứng được làm nổi để phân<br /> <br /> vỏ não (4a) và HKG (4c) trong khi ở vùng hồi<br /> <br /> biệt các vùng não khác nhau.<br /> <br /> răng thì ngược lại (4b).<br /> <br /> cung cấp, trong vòng 20 phút mẫu được ủ với<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> <br /> Ở chuột chứng, BDNF biểu hiện dày ở tế<br /> <br /> Sự suy thoái TBTK do TMT nhận biết bằng<br /> FJB ở vùng hồi răng (dentate gyrus)<br /> <br /> bào vỏ não và hành khứu giác trong khi chỉ<br /> <br /> Trong 1-3 ngày sau khi tiêm TMT, TBTK hạt<br /> <br /> chuột tiêm TMT, BDNF bị mất đi ở một số tế<br /> <br /> vùng hồi răng biểu hiện FJB ở thân (soma) tế<br /> <br /> bào vỏ não (đánh dấu bởi mũi tên màu đen),<br /> <br /> bào, đôi khi ở cả sợi trục (axon). TBTK hạt<br /> <br /> trong khi ở vùng hồi răng tăng một số tế bào<br /> <br /> (granular) biểu thị FJB tăng dần đến ngày thứ 2<br /> <br /> BDNF (+) cho đến ngày thứ 10. Ở HKG, BDNF<br /> <br /> và giảm dần sau đó (Hình 1).<br /> <br /> giảm biểu hiện ở ngày 1 và dần phục hồi ở<br /> <br /> biểu hiện ở một vài tế bào vùng hồi răng. Ở<br /> <br /> ngày thứ 10.<br /> <br /> 164<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> TMT (2,8 mg/kg, tiêm phúc mô)<br /> <br /> Hình 1: FJB ở TBTK vùng hồi răng của chuột chứng và tiêm TMT. Ô viền trắng và xanh chỉ định hình ảnh<br /> phóng to tương ứng của TBTK suy thoái biểu hiện FJB ở một số ngày sau khi tiêm TMT.Tỉ lệ hình 200 μm.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> 165<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Hình 2: FJB ở vỏ não chuột chứng và tiêm TMT. Phần thân TBTK hạt, sao hay tháp biểu hiện FJB được phóng to<br /> ở ô viền vàng.Đôi khi FJB biểu hiện ở phần trục (axon). TBTK ở vỏ não biểu hiện FJB được tìm thấy sau thời điểm<br /> TBTK vùng hồi răng suy thoái.<br /> <br /> Hình 3: TBTK suy thoái biểu hiện FJB ở hành khứu giác (OB) xuất hiện trước, sau đó thể hiện ở vùng lân cận<br /> (AON) ở chuột thử nghiệm tiêm phúc mô TMT 2,8 mg/kg.<br /> <br /> 166<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br />