Khóa luận tốt nghiệp: Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen (Kaempferia parviflora)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:54

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là đánh giá được hoạt tính chống đông máu của các dịch chiết cây Gừng đen; đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết cây Gừng đen. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen (Kaempferia parviflora)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THUỲ DUNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VÀ CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GỪNG ĐEN ( KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội-2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THUỲ DUNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VÀ CHỐNG ĐÔNG MÁU IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT GỪNG ĐEN ( KAEMPFERIA PARVIFLORA WALL.) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khoá : QH.2016.Y Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Hồng Luyến 2. ThS. Nguyễn Xuân Tùng Hà Nội- 2021
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Bào chế và công nghệ dược phẩm, các thầy cô đã tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua. Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS. Lê Hồng Luyến, trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS. Nguyễn Xuân Tùng, trường Đại học Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận . Em cũng xin cảm ơn đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của Cây Gừng đen Kaempferia parviflora” đã tài trợ kinh phí để em thực hiện nội dung nghiên cứu này. Em cũng xin cảm ơn Khoa Khám bệnh và Điều trị ngoại trú, Khoa Đông máu, Viện Huyết học- Truyền máu Trung ương đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm. Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, khích lệ tinh thần giúp em có thêm quyết tâm hoàn thành khóa luận này. Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khoa học nên khó tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô giúp em hoàn thiện khóa luận hơn nữa. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thuỳ Dung
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Giải nghĩa ADP Adenosin diphosphat AMP Adenosin monophosphat APTT Thời gian Thromboplastin từng phần hoạt hoá ( Activated partial Thromboplastin Time) ATP Adenosin triphosphat AUC Diện tích dưới đường cong (Area Under the aggregation curve) COX-2 Cyclooxygenase 2 cGMP guanosine monophosphat GP Glycoprotein HMWK Kininogen trọng lượng phân tử cao IC 50 Liều ức chế 50% đối tượng thử (Inhibitory concentration 50%) NTTC Ngưng tập tiểu cầu PPP Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma) PRP Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) PT Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time) TT Thời gian Thrombin ( Thrombin Time) vWF Von- Willerbrand
DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương 10 Bảng 3.1 Diện tích dưới đường cong (AUC) của các dịch chiết 28 Gừng đen ở nồng độ 0,2 mg/mL Bảng 3.2 Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết 29 Gừng đen ở nồng độ 0,2 mg/mL Bảng 3.3 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết Gừng đen ở 30 nồng độ 0,2 mg/mL Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường 31 đông máu ngoại sinh Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường 31 đông máu nội sinh Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các dịch chiết Gừng đen trên con đường 32 đông máu chung
DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ sinh tiểu cầu 2 Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo của tiểu cầu 4 Hình 1.3 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP 7 Hình 1.4 Sơ đồ quá trình đông máu huyết tương 12 Hình 1.5 Vai trò của thrombin trong quá trình đông cầm máu 14 Hình 1.6 Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) 15 Hình 2.1 Sơ đồ chiết tách dược liệu Gừng đen 22 Hình 2.2 Máy ACL TOP500 của hãng IL 23 Hình 2.3 Máy CHRONO –LOG 530 VS 23 Hình 2.4 Mẫu máu sau khi ly tâm 500 vòng/ phút trong 10 phút 25
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Sinh lý học tiểu cầu 2 1.1.1 Giới thiệu chung về tiểu cầu 3 1.1.2. Chức năng của tiểu cầu 3 1.2. Sinh lý quá trình đông máu huyết tương 9 1.2.1. Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương 9 1.2.2. Các nhóm yếu tố tham gia đông máu huyết tương 11 1.2.3. Giai đoạn đông máu huyết tương 11 1.3. Tổng quan về Gừng đen 14 1.3.1. Đặc điểm thực vật 14 1.3.2. Thực trạng và phân bố 16 1.3.3. Thành phần hoá học 16 1.3.4. Công dụng và tác dụng dược lý 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2. Nguyên liệu, dụng cụ nghiên cứu 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Đánh giá hoạt tính chống đông máu của các phân đoạn dịch 25 chiết Gừng đen. 2.2.2.Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu của các phân 26 đoạn dịch chiết Gừng đen. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28
3.1. Kết quả 28 3.1.1. Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch 28 chiết Gừng đen 3.1.2. Tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết 30 Gừng đen 3.2. Bàn luận 32 3.2.1. Mô hình nghiên cứu 32 3.2.2. Kết quả nghiên cứu 34 3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu 36 KẾT LUẬN 38 ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối động mạch và huyết khối tĩnh mạch là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong trên toàn thế giới [37]. Các thuốc đã biết đến trong chống đông máu như: Heparin, wafarin,.. hay chống ngưng tập tiểu cầu như : aspirin, clopidogrel, prasugrel… đều cho tác dụng điều trị tốt nhưng bên cạnh đó chúng cũng gây nên những tác dụng phụ như: dị ứng, giảm tiểu cầu, loét dạ dày… [37,24]. Vì vậy, việc tìm kiếm liên tục các loại thuốc mới đặc biệt là thuốc chống kết tập tiểu cầu, chống đông máu là vô cùng cần thiết. Xác định được các con đường sinh hoá liên quan đến hoạt hoá đông máu và ngưng tập tiểu cầu đã đưa đến việc tìm kiếm các thuốc mới cho các thuốc chống huyết khối mới có ít tác dụng phụ hơn luôn được các nhà khoa học quan tâm. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên là một ứng viên tiềm năng để sử dụng nghiên cứu [37]. Gừng đen (Kaempferia parviflora Wall. ex Baker) thuộc họ Gừng Zingiberaceae [51,28] đã được sử dụng rất lâu đời trong y học Thái Lan và y học cổ truyền để tăng cường sức khoẻ [47]. Chúng được nghiên cứu khá nhiều về tác dụng dược lý, hoá học. Tuy nhiên ở Việt Nam và trên thế giới, số lượng các nghiên cứu về tác dụng chống đông máu và ức chế ngưng tập tiểu cầu còn rất hạn chế. Vì vậy, để làm rõ cơ sở khoa học và giá trị sử dụng Gừng đen, góp phần sử dụng hiệu quả tài nguyên cây thuốc vào điều trị bệnh huyết khối, tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu và chống đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây gừng đen (Kaempferia parviflora)” . Mục tiêu của đề tài là: 1. Đánh giá được hoạt tính chống đông máu của các dịch chiết cây Gừng đen. 2. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các dịch chiết cây Gừng đen. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Sinh lý học tiểu cầu 1.1.1. Giới thiệu chung về tiểu cầu Khái niệm: Tiểu cầu là những đĩa nhỏ hình tròn hoặc bầu dục, có đường kính 3 – 4 µm, độ dày trung bình 0,5 µm và thể tích khoảng 7 µm3. Đây là thành phần hữu hình nhỏ nhất của máu. Số lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi khoảng từ 150.000 - 400.000/µL (150 – 400 x 109/L). Tiểu cầu là những tế bào không có nhân và không có khả năng phân chia. Chúng là một trong những thành phần đóng vai trò quan trọng bậc nhất của quá trình cầm máu và đông máu, nhất là giai đoạn cầm máu ban đầu [3,1,35]. Nguồn gốc phát triển: Tiểu cầu được sinh sản từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tuỷ (CFU - GEMM), do tế bào gốc sinh máu tạo nên (Hình 1.1). Mẫu tiểu cầu trưởng thành ở tuổi sinh tiểu cầu là tế bào máu lớn nhất trong các tế bào máu ở tủy xương, với nhân rất to, nhiều múi, nguyên sinh chất rộng chứa rất nhiều hạt, có đường kính 50 – 100 µm. Mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo được từ 1000 đến 3000 tiểu cầu [3,9,14]. Hình 1.1. Sơ đồ sinh tiểu cầu [3] (HSC: tế bào gốc sinh máu, MTC: mẫu tiểu cầu, TC: tiểu cầu) Đời sống của tiểu cầu: Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ 8 - 14 ngày. Hiện nay có thể giữ tiểu cầu trong 7 ngày ngoài cơ thể ở nhiệt độ 20 – 22°C, lắc liên tục [3]. 2
Cấu trúc tiểu cầu: Cũng như các tế bào khác, tiểu cầu gồm có lớp màng, các hạt, hệ thống vi ống, hệ thống nội NSC (nội sinh nguyên chất). - Màng tiểu cầu: Gồm hai lớp lipid (lớp lipid kép); trong đó có thành phần quan trọng là glycoprotein (GP). Chúng có trọng lượng phân tử khoảng 140kD, có các thành phần sau đây: + GPIb: Là protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố Von Willebrand (vWF). Đây là bước đầu tiên trong hoạt động động cầm máu của tiểu cầu. + GPIIb/IIIa: Là protein màng, hoạt động phụ thuộc vào Ca++, có nhiệm vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập thành “đinh cầm máu” [3]. - Hệ thống các hạt đặc hiệu: Có ba loại hạt: + Hạt δ (hạt đặc): Có kích thước nhỏ hơn hạt α, trong chứa nhiều các chất như ATP, ADP, calci, serotonin, histamin và epinephrin. Các chất này được giải phóng khi tiểu cầu bị kích thích. Mỗi tiểu cầu chứa khoảng 3 – 8 hạt đặc [3,26, 41]. + Hạt α: Là loại hạt chiếm tỷ lệ cao nhất trong tiểu cầu, mỗi tiểu cầu có khoảng 50 – 80 hạt α, chiếm khoảng 10% thể tích tiểu cầu. Hạt này chứa nhiều protein khác nhau: thromboglobulin, yếu tố phát triển (GF), fibrinogen, yếu tố V, vWF và nhiều protein quan trọng khác như thrombospondin, fibronectin, giúp cho hiện tượng dính của tiểu cầu [3,9,15]. + Hạt lysosome: Là các hạt có số lượng thưa thớt, chứa các enzym như acid hydrolase và protease. Các hạt này có chức năng tiêu hóa các thành phần ma trận tế bào chất. Sự bài tiết thành phần lysosome có các chức năng ngoại bào quan trọng gồm phân cắt thụ thể, tiêu sợi huyết và phân hủy chất nền ngoại bào [27]. - Hệ thống vi ống và vi sợi: 3
+ Các vi ống: Nằm ngay cạnh màng tiểu cầu, hệ thống này tạo nên khung đỡ của tiểu cầu và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích. + Các ống dày đặc: Đó là khối vật chất không định hình, dày đặc điện tử, đóng vai trò là kho dự trữ Ca++, đồng thời là nơi tổng hợp cyclooxygenase và prostaglandin của tiểu cầu. + Các vi sợi: Gồm các sợi actin tham gia tạo giả túc của tiểu cầu. [3] - Hệ thống các kênh mở: Gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các không bào (vacuole) làm tăng diện tích bề mặt của tiểu cầu. Hệ thống này đóng vai trò như một đường dẫn cho các chất từ bên ngoài môi trường đi vào trong tế bào chất của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu khi chúng bị hoạt hóa [3,9]. Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của tiểu cầu [9] 1.1.2. Chức năng của tiểu cầu Tiểu cầu có ba chức năng chính là làm vững bền mạch máu (bảo vệ nội mô), tham gia vào quá trình cầm máu bằng cách tạo nút cầm máu ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [8]. 1.1.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu còn nguyên vẹn, có lẽ do một chất có tác dụng ức chế dính của tiểu cầu – chất đó có thể là prostagladin [3]. Tuy nhiên, khi tế bào nội mô thành 4
mạch bị tổn thương, tiểu cầu nhanh chóng trải qua các quá trình bám dính, thay đổi hình dạng, bài tiết và kết tập thông qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh xảo, mà đỉnh điểm là hình thành một nút tiểu cầu tại nơi mô tổn thương. Quá trình này đạt được thông qua ba bước riêng biệt: kết dính tiểu cầu, chế tiết tiểu cầu và kết tập tiểu cầu [9,21]. Giai đoạn bám dính Tiểu cầu có khả năng dàn ra và dính vào một số bề mặt. Trong in vitro, tiểu cầu có thể dính vào tất cả các bề mặt lạ như ống nghiệm, bi thủy tinh, thạch anh, bentonit, barbiturat. Còn trong in vivo, tiểu cầu không dính vào lớp tế bào nội mạc, nhưng lại có thể dính rất mạnh với tổ chức dưới nội mạc, đặc biệt là với collagen [8]. Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất đi và bộc lộ lớp dưới nội mô. Lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố vWF, fibronectin, lamilin… [9,16,50]. Yếu tố vWF tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên màng tiểu cầu. vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ dòng máu cao. Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GPIa/IIa. Những tương tác này cho phép tiểu cầu lưu thông chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc hơn nữa của các cặp thụ thể - phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [9,36]. Đặc biệt sự tương tác ban đầu giữa collagen và GPVI gây ra sự kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa. vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen liên kết với GP IIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [9]. Giai đoạn chế tiết Tiểu cầu hoạt hóa, thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành dạng quả cầu nhỏ gọn, với phần mở rộng đuôi gai dài tạo điều kiện thuận lợi cho độ bám dính [8,9]. Một khi sự kết dính tiểu cầu đã xảy ra tại vị trí thành mạch bị tổn thương, cần duy trì hoạt hóa tiểu cầu để quá trình cầm máu tiếp tục diễn ra. Điều cần thiết cho việc khuếch đại hoạt hóa tiểu cầu là sản xuất và giải phóng các chất chủ vận hòa tan tại vị trí tổn thương [69], hoạt động theo cách tự tiết (tác động lên chính các tế bào đã tạo ra chúng) và cận tiết (tác động lên các tế 5
bào lân cận) để khuếch đại hoạt hóa tiểu cầu và thu nạp thêm các tiểu cầu lưu thông. Các chất chủ vận này bao gồm thromboxan A2, ADP, epinephrine và thrombin. ADP được tiết ra từ các hạt đặc của tiểu cầu và liên kết với các thụ thể liên quan của nó, gồm P2Y12 và P2Y1 trên bề mặt tiểu cầu [31]. Thụ thể P2Y1 huy động Ca++ và thay đổi hình dạng tạm thời. Thụ thể P2Y12 tăng cường sự tiết của tiểu cầu và tham gia vào duy trì kết tập tiểu cầu bền vững [9]. P2Y12 cũng là mục tiêu của nhóm thuốc chống kết tập tiểu cầu gọi là thienopyridines (ticlopidine, clopidogrel, prasugrel), được sử dụng rộng rãi trong việc phòng ngừa các biến cố mạch máu ở bệnh nhân mắc các bệnh tim mạch [12]. Ở giai đoạn này, các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển hóa tiêu đường, thoái hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP, hoạt hóa thrombosterin. Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin, collagen và có tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu. Đây là hiện tượng vô cùng ý nghĩa trong việc bảo vệ mạch máu khi mạch máu bị tổn thương [8]. Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu cầu có sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau. Khả năng này thúc đẩy, tạo điều kiện và mở rộng cho khả năng khác xảy ra để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện tốt các chức năng của tiểu cầu [8]. Giai đoạn ngưng tập Tiểu cầu có khả năng kết dính lẫn nhau tạo nên các kết chụm tiểu cầu gọi là hiện tượng ngưng tập tiểu cầu. Đây là một khả năng rất đặc biệt của tiểu cầu, thông qua hiện tượng này mà tiểu cầu thực hiện chức năng của mình [8]. Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu. Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen. Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó. Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin. Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng 6
tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [8,9,28]. Có nhiều chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu như: ADP, thrombin, adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin,… Các chất này được gọi là “chất kích hoạt tiểu cầu”. Trong đó, ADP đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn. Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu. Những hồng cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [8,12,51]. ADP gây ra ngưng tập tiểu cầu theo cơ chế sau: Bình thường các tiểu cầu không ngưng tập là phải có năng lượng, năng lượng được tạo ra là do sự thoái hoá ATP thành ADP. Trong trường hợp có nhiều ADP (do đưa từ ngoài vào) thì phản ứng này bị ức chế, nên gây ra thiếu năng lượng dẫn đến tiểu cầu bị ngưng tập (Hình 1.3) [8] Hình 1.3. Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP [8] (- -: ức chế, ngăn cản) 7
Sự ngưng tập tiểu cầu là một hiện tượng có thể phục hồi được tự nhiên. Quá trình phục hồi này là do sự có mặt của một hệ thống men ở trong huyết tương và trong tiểu cầu; trong đó adenylat kinase đóng vai trò quan trọng nhất [8]. 1.1.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương Ngay từ khi bắt đầu hiện tượng bám dính, tiểu cầu thay đổi hình dạng và chế tiết những hoạt chất tham gia quá trình khởi động đông máu. Kininogen trọng lượng phân tử cao (HMWK) cùng với kallikrein hoạt hóa yếu tố XII bước đầu của quá trình đông máu. Tiểu cầu có thể làm tăng nhanh sự tổng hợp thrombin. Một lượng nhỏ thrombin được hình thành trên bề mặt của một số tế bào mang yếu tố tổ chức (TF – tissue factor) như: nguyên bào sợi, bạch cầu đơn nhân hoạt hóa hoặc tế bào nội mô. Lượng thrombin này không có khả năng để tạo ra một cục máu đông fibrin ổn định, nhưng đủ để hoạt hóa tiểu cầu. Tiểu cầu hoạt hóa sau đó có thể liên kết các yếu tố đông máu bởi các thụ thể chuyên biệt. Tiểu cầu liên kết với các yếu tố V và VIII chống lại sự phân cắt bởi hoạt tính protein C. Trên bề mặt tiểu cầu, XIa liên kết với thụ thể GPIb và hoạt hóa yếu tố IX. Ngược lại yếu tố Xa dễ dàng bị ức chế bởi TF. Các hoạt động phối hợp của các yếu tố đông máu trên bề mặt tiểu cầu mang đến một sự bùng nổ hình thành thrombin, vì vậy một cục máu đông ổn định fibrin được hình thành. Ngoài ra tiểu cầu còn cung cấp khoảng 20% yếu tố V và các yếu tố đông máu khác như fibrinogen, yếu tố IX, XIII [9]. 1.2. Sinh lý quá trình đông máu huyết tương Đông máu là quá trình chuyển máu ở thể lỏng sang thể đặc, mà thực chất là chuyển fibrinogen ở dạng hòa tan trong huyết tương thành fibrin ở dạng không hòa tan dưới xúc tác của thrombin [7]. Trong cơ thể luôn có sự cân bằng sinh lý giữa hai hệ thống: làm đông máu và chống lại quá trình đông máu. Một hệ thống mang tính bảo vệ cơ thể tránh chảy máu, một hệ thống đóng vai trò gìn giữ lưu thông lòng mạch để luôn bảo đảm tuần hoàn duy trì sự sống. Mất cân bằng hai hệ thống này sẽ dẫn đến hậu quả tắc mạch hoặc chảy máu [8]. Thông thường, quá trình đông máu nằm dưới sự kiểm soát của một số chất ức chế nhằm hạn chế sự hình 8
thành cục máu đông, do đó tránh được sự lan truyền huyết khối. Sự cân bằng mong manh này bị gián đoạn bất cứ khi nào hoạt động đông máu của các yếu tố đông máu được tăng lên, hoặc hoạt động của các chất ức chế tự nhiên bị giảm [48]. 1.2.1. Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương Phần lớn các yếu tố đông máu là tiền chất của các enzym phân giải protein được gọi là các zymogen ở dạng không hoạt động. Sự kích hoạt của mỗi zymogen được mô tả bằng cách thêm chữ cái “a” vào chữ số La Mã xác định zymogen cụ thể đó. Hầu hết các yếu tố đông máu và chống đông máu đều do gan sản xuất, ngoại trừ yếu tố III, IV và VIII. Các protein này trải qua một quá trình sửa đổi sau dịch mã để cho phép chúng liên kết với canxi và các cation hóa trị hai khác và tham gia vào quá trình đông máu. Thiếu vitamin K hoặc sử dụng thuốc đối kháng vitamin K (warfarin) dẫn đến chống đông máu [42,52]. Danh pháp của các protein tham gia vào quá trình đông máu khá phức tạp và được Ủy ban danh pháp quốc tế (1954) đặt tên cho các yếu tố đó bằng các chữ số La mã. Tuy nhiên về sau đã có sự thay đổi: một số yếu tố đã bị bỏ đi (như các yếu tố III, IV, VI) vì không tương ứng với một protein riêng biệt nào. Bên cạnh đó, một số yếu tố đông máu được phát hiện gần đây (ví dụ như prekallikrein, HMWK) không được chỉ định bằng số La mã (Bảng 1.1). Yếu tố V và VIII còn được gọi là yếu tố không bền vì hoạt tính đông máu của chúng không bền trong máu lưu trữ [8,52]. Bảng 1.1. Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương [8,13,52] Nồng độ trong Chức Nửa đời Nơi sản Yếu tố đông máu huyết năng sống xuất tương (mg/dL) Tế bào gan I (fibrinogen) 150 – 400 Cơ chất 90 giờ Mẫu tiểu cầu 9
II (prothrombin) 10,0 – 15,0 Zymogen 60 giờ Tế bào gan Đồng Tế bào gan V (proaccelerin) 0,5 – 1,0 12 – 36 giờ yếu tố Mẫu tiểu cầu VII (proconvertin) 1,0 Zymogen 4 – 6 giờ Tế bào gan VIII (yếu tố chống Đồng < 0,01 12 giờ Tế bào gan hemophilia A) yếu tố IX (yếu tố chống 0,01 Zymogen 24 giờ Tế bào gan hemophilia B) X (yếu tố Stuart) 0,75 Zymogen 24 giờ Tế bào gan XI (yếu tố Rosenthal) 1,2 Zymogen 40 giờ Tế bào gan XII (hageman) 0,4 Zymogen 48 – 52 giờ Tế bào gan XIII (yếu tố ổn định 2,5 Zymogen 3 – 5 ngày Tế bào gan sợi huyết) Prekallikrein (yếu tố 0,3 Zymogen 48 – 52 giờ Tế bào gan fletcher) HMWK (yếu tố Đồng 2,5 6,5 ngày Tế bào gan fitzgerald) yếu tố 1.2.2. Các nhóm yếu tố tham gia đông máu huyết tương Các yếu tố tham gia đông máu huyết tương có thể được phân thành ba nhóm như sau [52]: - Nhóm yếu tố tham gia vào giai đoạn đầu (giai đoạn tiếp xúc) được gọi chung là các yếu tố tiếp xúc. Đó là yếu tố XI, XII, prekallikrein và HMWK. Các yếu tố thuộc nhóm này có đặc tính không phụ thuộc vitamin K khi tổng hợp, không phụ thuộc Ca++ trong quá trình hoạt hóa, ổn định tốt trong huyết tương lưu trữ và là những yếu tố bền vững. Các yếu tố này hầu như không có vai trò gì trong quá trình cầm máu in vitro; tuy nhiên chúng lại có vai trò rất quan trọng trong việc khởi đầu cho quá trình đông máu theo con đường nội 10
sinh. Ngoài ra, chúng cũng có vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa hệ thống tiêu fibrin [8,52,13]. - Nhóm prothrombin gồm các yếu tố II, VII, IX, và X. Đây là các yếu tố phụ thuộc vitamin K khi tổng hợp, cần có Ca++ trong quá trình hoạt hóa. Ngoại trừ yếu tố II, các yếu tố kia không bị tiêu thụ trong quá trình đông máu (có mặt trong huyết thanh) và ổn định trong huyết tương lưu trữ [3,31]. Cả bốn yếu tố này đều là zymogen (tiền men) của các serin protease (men hoạt động). Chúng không có hoạt tính enzym ở trạng thái cơ bản, nhưng có thể bị biến đổi thành serin protease bằng sự phân cắt có lựa chọn một hoặc hai dây nối peptid [8]. - Nhóm fibrinogen gồm các yếu tố I, V, VIII và XIII. Thrombin có tác dụng qua lại với tất cả các yếu tố này. Các yếu tố trong nhóm fibrinogen bị tiêu thụ trong quá trình đông máu. Riêng yếu tố V và yếu tố VIII còn bị mất hoạt tính trong huyết tương lưu trữ [3,13]. 1.2.3. Giai đoạn đông máu huyết tương Quá trình đông máu huyết tương có thể chia thành ba thời kỳ [3]: - Hình thành thromboplastin hoạt hóa (phức hợp prothrombinase) bằng hai con đường nội sinh và ngoại sinh. - Hình thành thrombin. - Hình thành fibrin. 11
Hình 1.4. Sơ đồ quá trình đông máu huyết tương [8] Hình thành thromboplastin hoạt hoá Theo đường nội sinh: Đây là con đường có sự tham gia của đa số các yếu tố đông máu và theo quy luật diễn tiến mở rộng, do vậy mà rất cơ bản và bền vững. Năm protein (yếu tố XII, prekallikrein, yếu tố XI, HMWK, kallikrein trọng lượng phân tử cao và chất ức chế CI) là những yếu tố quyết định chính quá trình hoạt hoá và ức chế giai đoạn tiếp xúc đông máu. Khi thành mạch bị tổn thương, các sợi collagen được bộc lộ. Bề mặt các sợi cơ này mang điện tích âm sẽ gắn và cố định các yếu tố XII, prekallikrein, HMWK, yếu tố XI vào. Ngay sau khi gắn, các yếu tố này được hoạt hoá để tạo yếu tố XIIa, tiếp đó là sự tác động của XIIa để chuyển XI  XIa, nhờ có XIa mà yếu tố IX  IXa. Yếu tố X được hoạt hóa với sự tham gia của một phức hợp bao gồm yếu tố XIa, đồng yếu tố VIIIa, ion Ca++ và phospholipid của tiểu cầu. Giai đoạn này còn có sự hiệp lực của con đường đông máu ngoại sinh. Yếu tố IXa không chỉ giới hạn tác dụng enzym lên yếu 12