Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:65

Thêm vào BST

Báo xấu

77
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu; nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu; nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ MAI HƯƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Thực phẩm Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ MAI HƯƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Thực phẩm Lớp: K48 - CNTP Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Người hướng dẫn: TS. Lương Hùng Tiến Thái Nguyên, năm 2020
i LỜI CẢM ƠN Đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu” là nội dung em chọn để nghiên cứu và làm khóa luận tốt nghiệp sau bốn năm theo học chương trình đai học, chuyên ngành Công nghệ thực phẩm tại trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, đầu tiên em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến toàn bộ quý thầy cô Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, cùng với quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt bốn năm học tập và rèn luyện tại trường. Sáu tháng thực tập là cơ hội cho em tổng hợp thêm và hệ thống hóa lại những kiến thức đã học, đồng thời kết hợp với thực tế để nâng cao kiến thức chuyên môn. Qua quá trình thực tập này, từ những chỗ còn bở ngỡ cho đến thiếu kinh nghiệm, em đã gặp phải rất nhiều khó khăn nhưng với sự giúp đỡ tận tình của thầy TS. Lương Hùng Tiến đã giúp em có được những kinh nghiệm quý báu để hoàn thành tốt kì thực tập này cũng như viết lên bài báo cáo hoàn chỉnh nhất. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến giáo viên hướng dẫn em - thầy TS. Lương Hùng Tiến, người đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn em thực hiện bài báo cáo này. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô ThS. Phạm Thị Phương đã tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học cho em. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình. Với việc hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm thực tiễn nên bài khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của các Thầy Cô và các bạn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2020 Sinh viên
ii DANH MỤC VIẾT TẮT CFU Colony fomat unit DNA Deoxyribo Nucleic Acid E. coli Escherichia coli E. ictaruli Edwardsiella ictaruli EAEC Enteroadherent E.coli EHEC Enterohaemorrhagic E.coli EIEC Enteroinvasive E.coli EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC Enterotoxigenic E.coli I Intermediate ( trung gian) MH Mueller-Hinton MIC Minimum Inhibitory Concentration MRSA Methicillin resistance Staphulococcus aureus PBS Phosphate buffer saline PPCĐ Phương pháp cổ điển PPVS Phương pháp vi sóng R Resistante (đề kháng) S Susceptible (nhạy cảm) S. aureus Staphylococus areus TNF Tumor necrosis factor TSST Toxic shock syndromme toxin
iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Vị trí phân loại thực vật của lá trầu không ................................................4 Bảng 2.2. Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi .............................................5 Bảng 2.3. Phân loại của Staphylococcus aureus .......................................................18 Bảng 2.4. Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng ....................................................22 Bảng 2.5. Phân loại Escherichia coli ........................................................................26 Bảng 2.6. Phân loại Salmonella ................................................................................31 Bảng 3.1. Danh mục thiết bị sử dụng ........................................................................35 Bảng 3.2. Danh mục hóa chất sử dụng......................................................................35 Bảng 3.3. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu .............................................................39 Bảng 3.4. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng tinh dầu từ lá Trầu không ...............................................................................................40 Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu ............................................................................................................42 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu ..........................................................................................44 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết dến hàm lượng tinh dầu .................................................................................................................45 Bảng 4.4. Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết tinh dầu từ lá Trầu không ...............................................................................................46 Bảng 4.5. Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết tinh dầu từ lá Trầu không ...............................................................................................47 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tinh dầu đến khả năng kháng khuẩn................................49
iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cây Trầu không ...........................................................................................4 Hình 2.2. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus .......................................................19 Hình 2.3. Trực khuẩn Escherichia coli .....................................................................27 Hình 2.4. Tụ cầu khuẩn Salmonella ..........................................................................32 Hình 4.1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng tinh dầu lá Trầu không .................................48 Hình 4.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu của hàm lượng tinh dầu lá Trầu không48 Hình 4.3. Kích thước vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm .............................................................................50
v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iv MỤC LỤC ...................................................................................................................v PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1 1.1. Đặt vấn dề ............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu của đề tài ...............................................................................................2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................................2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..............................................................................3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4 2.1. Tổng quan về Trầu không ....................................................................................4 2.1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật học của trầu không ..........................................4 2.1.2. Thành phần hóa học và công dụng của lá trầu không .......................................5 2.1.3. Một số nghiên cứu về trầu không ......................................................................6 2.2. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật ..........................................10 2.2.1. Khái niệm và mục đích của chiết ....................................................................10 2.2.2. Các phương pháp tách chiết ............................................................................10 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết ..........................................................12 2.3.1. Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược liệu .............................12 2.3.2. Những yếu tố thuộc về dung môi ....................................................................14 2.3.3. Những yếu tố thuộc về kỹ thuật ......................................................................15 2.4. Giới thiệu chung về các vi sinh vật thử nghiệm.................................................17 2.4.1. Tổng quan về Staphylococus aureus (S. aureus) ...........................................17
vi 2.4.2. Tổng quan về Escherichia coli (E. coli) .........................................................25 2.4.3. Tổng quan về Salmonella (Sal) ......................................................................30 PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU .........35 3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................35 3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ..........................................................................36 3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................36 3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................36 3.4.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu ......................................................................36 3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam III .....36 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................................37 3.5. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................41 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................42 4.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết tách tinh dầu từ lá Trầu không ................................................................................................................42 4.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu ...................42 4.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu .....43 4.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu ...................45 4.1.4. Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không..............................46 4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không ...........48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................51 5.1. Kết luận ..............................................................................................................51 5.2. Kiến nghị ............................................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................52 PHỤ LỤC
1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn dề Cây Trầu không có tên khoa học là Piper betle L. thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), là một trong những loài thực vật nhiệt đới quan trọng ở khu vực châu Á, được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Sri Lanka, Malaysia, Thái Lan, … Tên thường gọi của nó là Trầu (tiếng Việt) Betle (tiếng Anh), Paan (tiếng Ấn Độ), Phlu (tiếng Thái) và Sirih (tiếng Bahasa Indonesia) [33]. Lá trầu được nghiên cứu cho thấy trong lá có chứa một số chất dễ bay hơi [35], khoáng chất [30], glycosid [26], enzym, vitamin, các axit amin thiết yếu [21] và tanin [34]. Dịch chiết của lá Trầu không có các chất kháng khuẩn, kháng viêm và chống ung thư [31]. Các đặc tính chống oxy hóa và chống viêm của lá trầu được cho là do các thành phần hóa học khác nhau có trong lá. Lá trầu mà có hàm lượng phenol và flavonoid càng cao thì có hoạt tính chống oxy hóa và chống ung thư càng cao [36,32]. Chống lở loét cũng là do hàm lượng flavonoid trong lá trầu cao. Người ta đã thấy rằng khi chiết tách tinh dầu có trong lá Trầu có khả năng chữa lành vết loét dạ dày [35]. Còn ở nước ta, trong y học cổ truyền Việt Nam, lá trầu được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như nhai trầu để chắc răng, chữa viêm mủ chân răng, nước sắc lá trầu để rửa hoặc đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm, lá trầu ngâm trong nước sôi dùng nhỏ mắt để chữa bệnh viêm kết mạc... [10]. Ở Việt Nam PGS.TS. Nguyễn Quang Linh cùng các cộng sự ở Khoa Thủy sản – Đại học Nông Lâm Huế chế tạo ra hợp chất Bokashi. Cho dịch chiết lá Trầu lên men với các vi sinh vật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu là Eugenol, Chavicol, Estradiol, Cadinen, các hợp chất phenol và các vi sinh vật chủ yếu nhóm Lactobacillus. Chế phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn và có khả năng tăng cường vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môi trường, không gây tồn dư trong cơ thể động vật thủy sản; khi ao nuôi tôm được bổ sung chế phẩm, tôm sẽ khỏe và có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng hơn so với tôm không được bổ sung. Bokashi trầu ở nồng độ 4,5 ppm có khả năng ức chế hoạt động và ở nồng độ 7,5 ppm có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn: Vibrio, Aeromonas, E. coli,
2 Coliform, Staphylococcus. Còn ở nồng độ 5.000 ppm đến 10.000 ppm có khả năng ức chế các nấm: Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và các ký sinh trùng: Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Gregarine. Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi trầu có khả năng ức chế nấm Lagenium và Fusarium. Còn kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trường đại học Cần Thơ cho thấy, tinh dầu lá Trầu không biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật tốt. Nó có khả năng kháng vi khuẩn Gram dương như Bacillus subtillis và các loại nấm gây hại như Aspergillus niger và Fusarium oxysporum. Kết quả này cho thấy tiềm năng kháng khuẩn và kháng nấm của tinh dầu lá Trầu không có thể ứng dụng được vào thực tế. Qua các nghiên cứu cho ta thấy khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu nhằm đóng góp cơ sở khoa học cho tác dụng điều trị các bệnh do nhiễm khuẩn và nấm của tinh dầu Trầu không, đồng thời tinh dầu Trầu không có giá trị kinh tế cao, là mặt hàng hiện đang có nhu cầu lớn trên thị trường vì được sử dụng rất nhiều trong mỹ phẩm, trong y học và cả ngành nông nghiệp. Đồng thời bước đầu được sử dụng trong thủy hải sản. Xuất phát từ thực trạng trên em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu”. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không. - Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu - Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không - Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không
3 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá trầu không - Đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trầu không trên các vi sinh vật thử nghiệm - Đề tài động viên khích lệ sinh viên tham gia công tác nghiên cứu khoa học - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế, củng cố các kiến thức đã học. - Bổ sung kiến thức thông qua hoạt động nghiên cứu thực tiễn, trau dồi kiến thức bản thân, tích lũy kinh nghiệm thực tế, đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho công việc nghiên cứu và công tác sau này. - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Là cơ sở cho các thử nghiệm sử dụng các hoạt chất có tính kháng khuẩn sử dụng trong y học, dược học và đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của lá Trầu không.
4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về Trầu không 2.1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật học của trầu không Vị trí phân loại thực vật [10]: Trầu không còn có tên gọi khác là cây trầu, trầu cay, trầu thược tương, trầu mòlu (Campuchia). Bảng 2.1. Vị trí phân loại thực vật của lá trầu không [10] Giới Plante Ngành Magnoliophyta Lớp Magnoliophyta Bộ Piperales Họ Piperaceae Giống Piper Loài P. betle Hình 2.1. Cây Trầu không Đặc điểm thực vật học: Trầu không là một cây mọc leo, thân nhẵn. Lá mọc so le, cuống có bẹ, dài 1,5 - 3,5cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10 - 13cm, rộng 4,59cm, phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc) đầu lá nhọn, khi soi lên thấy rất nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, gân lá thường có năm gân. Hoa khác gốc mọc thành bông có cuống dài bằng cuống lá, mọc đối diện với lá, hoa đơn tính. Bông đực dài bằng phiến lá, trục bông phủ lông, lá bắc không cuống, không có lông, hình tròn hoặc hình trứng ngược. Nhị hoa, bao phấn hình bầu dục, chỉ nhị ngắn. Bông cái ngắn hơn, trục phủ lông [4]. Quả mọng, lồi, tròn, có những lông mềm ở đỉnh. Toàn cây có mùi thơm cay. Phân bố và thu hái: Cây Trầu được trồng khắp nơi ở nước ta để lấy lá, ăn trầu. Chúng còn được trồng nhiều ở các nước Châu Á, vùng nhiệt đới như Indonexia, Philipin [10]. Ở Việt Nam có 2 loại trầu chính là trầu mỡ và trầu quế. Lá trầu mỡ to
5 bản, dễ trồng. Trầu quế có vị cay, nhỏ lá, được ưa chuộng hơn trong tục ăn trầu. Trầu không được trồng bằng dây vào mùa xuân, người ta làm giàn cho cây leo lên. Cây trồng không ưa ẩm và Ca(OH)2, nên người ta thường trồng sát tường, cạnh bể nước để thuận tiện cho việc tưới và bón thêm vôi cũ. Lá được hái thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô, có khi tán bột dùng dần [3]. 2.1.2. Thành phần hóa học và công dụng của lá trầu không Theo phân tích, cứ 100g lá Trầu không thì có đến 85,4% độ ẩm, 3,1% protein, 0,8% chất béo, 2,3% muối khoáng, 2,3% chất xơ và 6,1% carbohydrat. Hàm lượng khoáng chất và vitamin chủ yếu là canxi, carotene, thiamin, riboflavin, niacin và vitamin C [3]. Trong lá trầu không có 0,8 - 1,8%, có khi đến 2,4% tinh dầu, tỷ trọng 0,958 thơm mùi creozot (củi đốt), vị nóng [3]. Theo Phạm Thế Chính và cs [5] tinh dầu lá trầu có chứa các hợp chất như là eugenol, eugeny acetat, chavicol và diacetoxylbenzen, các hợp chất này đều là dẫn xuất của phenol, có nhiệt độ sôi cao, tỷ trọng và chiết suất cao. Bảng 2.2. Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi [3] Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Nước 85 - 90% Thiamine 10 - 70μg/ 100g Protein 3 - 3,5% Riboflavin 1,9 - 30μg/ 100g Chất béo 0,4 - 1% Tanin 0,1 - 1,3% Chất khóang 2,3 - 3,3% Nitrogen 2 - 7% Chất xơ 2,3% Photphorus 0,005 - 0,6% Chlorophyll 0,01 - 0,25% Kali 1,1 - 4,6% Cacbohydrate 0,5 - 6,1% Canxi 0,2 - 0,5% Axit Nicotinic 0,63 - 0,89mg/ 100g Iod Sắt 0,005 - 0,007% Vitamin C 0,005 - 0,01% Tinh dầu 0,08 - 0,2% Vitamin A 1,99 - 2,99mg/ 100g Năng lượng 44Kcal/ 100g Nguồn: Từ điển thực vật 2, 2004 Công dụng của lá Trầu không: Ngoài công dụng để ăn trầu (lá Trầu không, vôi tôi, cau và vỏ cây), dân gian còn dùng nước lá trầu để sát trùng, chống lở loét, chống
6 viêm nhiễm… [3]. Các hợp chất polyphenol trong lá trầu có khả năng chống oxi hóa cao, ức chế một số nguyên nhân gây bệnh loét dạ dày. Nước pha lá trầu không còn được dùng làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết mạc, chữa bệnh chàm mặt của trẻ em. Có nơi còn giã lá trầu không đắp lên ngực để chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để chữa bệnh tắc sữa [3] Trầu không còn có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các vi trùng: tụ cầu, Subtilit và trực trùng E. coli [18]. Một số bài thuốc dân gian từ Trầu không [4] Bài thuốc chữa đau họng: Khi đau họng, dùng trầu không sẽ rất có công hiệu. Lấy lá trầu không và ít hoa quả xay nhuyễn lấy nước trộn thêm mật ong rồi ngậm thật lâu, nếu uống được thì càng tốt, sẽ giảm các kích thích gây ho. Bỏng nước sôi: Lá trầu hơ nhẹ để lá mềm ra rồi phết một lớp thầu dầu rồi đặt nhẹ lên vết bỏng. Cứ sau vài giờ lại thay một lá trầu mới. Sau vài lần, dịch trong vết bỏng sẽ tiêu hết, chỗ rộp không mọng nước, không gây mủ. Nên dùng vào ban đêm và vứt đi vào sáng sớm. Chữa đau mắt đỏ (viêm kết mạc): Lấy ba lá trầu không, năm đến mười lá dâu vò nát, cho vào ca, đổ ngập nước sôi để xông hơi con mắt đau. Xông mỗi lần 5 - 10 phút, ngày 2 lần. Thuốc giúp chóng hết viêm, mắt dịu. Rửa vết thương, vết bỏng bị nhiễm khuẩn: Lá trầu không và phèn đen mỗi thứ 20g vò nát hoặc giã nát, đổ 1,5lít nước, sắc lấy 1lít, rửa tại chỗ ngày 1lần. Ngoài ra Trầu không còn có tác dụng tăng sinh lực, làm sạch răng và làm ngọt miệng. 2.1.3. Một số nghiên cứu về trầu không 2.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Dưới tên gọi Bokashi Trầu, chế phẩm sinh học chiết xuất từ lá Trầu không của Trung tâm ươm tạo và chuyển giao công nghệ - Đại học Huế đã được Hội sở hữu trí tuệ Việt Nam trao giấy chứng nhận sản phẩm tin cậy. PGS.TS. Nguyễn Quang Linh, chủ nhiệm đề tài cho biết, lá trầu sau thu hái được làm sạch, làm khô nước và xay nhuyễn, ly tâm lấy được dịch chiết xuất lá Trầu. Cho dịch chiết lá Trầu lên men với các vi sinh vật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu là eugenol, chavicol, estradiol, cadinen, các hợp chất phenol và các vi sinh vật chủ yếu nhóm lactobacillus.
7 Chế phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn và có khả năng tăng cường vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môi trường, không gây tồn dư trong cơ thể động vật thủy sản. Khi ao nuôi tôm được bổ sung chế phẩm, tôm sẽ khỏe và có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng hơn so với tôm không được bổ sung. Bokashi trầu ở nồng độ 4,5 ppm có khả năng ức chế hoạt động và ở nồng độ 7,5 ppm có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn Vibrio, Aeromonas, E. coli, Coliform, Staphylococcus. Bokashi trầu ở nồng độ 5.000 đến 10.000 ppm có khả năng ức chế các nấm Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và các ký sinh trùng Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Gregarine. Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi trầu có khả năng ức chế nấm Lagenium và Fusarium. Phạm Thị Thắm và cộng sự đã phân lập các hợp chất trong thân cây Trầu không, kết quả thu được cho thấy các lớp chất trong thân cây Trầu không đã được phân lập lớp thành 3 chất có độ phân cực khác nhau nhờ sử dụng dung môi chiết theo độ phân cực tăng dần. Lớp chất kém phân cực được phân bố vào dung môi chiết n-hexan (cặn chiết H), lớp chất có độ phân cực trung bình được phân bố vào dung môi diclometan (cặn chiết D), cặn chiết có độ phân cực cao được phân bố trong dung môi etyl acetat (cặn chiết E). Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết H, D, E đã được nghiên cứu, kết quả cho thấy hai cặn chiết D và E có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm. Nguyễn Chí Thiện và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không (Piper betel L.), họ hồ tiêu (Piperaceae). Tinh dầu lá trầu không được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đạt hiệu suất 0,63%. Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá Trầu không được xác định là hợp chất 4-Allyl-1,2diacetoxybenzene với hàm lượng 34,55%. Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu được đánh giá bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Phạm Thế Chính với bài báo “Thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu (Piper betle L.) trồng tại Hải Dương”. Trong thí nghiệm sử dụng phương pháp chưng cất lôi
8 cuốn hơi nước đặc biệt có hiệu ứng muối kết hợp với đun hồi lưu, đã tách thành công tinh dầu lá trầu được trồng tại Hải Dương với hiệu suất đạt 1,01%. Tinh lá trầu tách được có tỷ trọng cao là 0,963 và chiết suất lớn là 1,5362. Bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS), họ đã khẳng định tinh dầu lá trầu trồng tại Hải Dương có thành phần hóa học chính là eugenol, với hàm lượng lên tới 77,24%. Từ tinh dầu này họ đã sử dụng phương pháp sắc ký cột thường nhồi bằng silica gel theo phương pháp nhồi ướt với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/etyl axetat, 10/1…; đã phân lập được eugenol tinh khiết và đã khẳng định được cấu trúc của nó bằng các phương pháp phổ hiện đại IR, MS, 1H&13C-NMR. 2.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Theo nghiên cứu “Steam and Water Distillation of Piper Betle, Ocimum Basilicum, Cymbopogon Winterianus, and Citrus Hystrix Leaves for Activity of Insect Repellent against Mosquito” của tác giả Engrid Juni Astuti cho thấy lá trầu, lá húng quế, lá sả đỏ có chứa tinh dầu có khả năng có hoạt tính đuổi muỗi thay thế một số chất có hoạt tính đuổi muỗi như DEET. Mục tiêu của đề tài: Để có được loại đuổi muỗi tự nhiên từ tinh dầu. Phương pháp: Chưng cất hơi nước để thu được tinh dầu, GC-MS để biết hàm lượng hóa học của nó. Thử nghiệm hoạt tính dễ bay hơi của tinh dầu đối với côn trùng trong các nồng độ khác nhau để chống muỗi vằn (Aedes aegypti) sử dụng với đối tượng là chuột trong 6 giờ. Kết quả: Chưng cất hơi nước và nước thu được dầu với 0,56% v / b (lá trầu), 0,33% v / b (lá húng quế), 1,7025% (lá sả đỏ) và 0,693% (lá chanh). Trong của tinh dầu của lá trầu GC-MS Piper chứa các hợp chất 4- Allylphenyl acetate (19,284%) và C10H12O2 (Trans-isoeugenol) (18,485%), tinh dầu của lá húng quế chứa hợp chất z-citral (54,201%), tinh dầu lá sả đỏ chứa các hợp chất C10H18O (Citronellal) (35,843%) và tinh dầu của lá chanh chứa C10H18O Citronellal (66,550%). Kết quả của thí nghiệm này cho thấy rằng sự kết hợp giữa tinh dầu lá Trầu không và tinh dầu lá Húng quế có hoạt tính đuổi côn trùng không khác với DEET 13%, ngoại trừ nồng độ thấp hơn 50:50. Trong khi sự kết hợp của tinh dầu lá Sả đỏ và tinh dầu lá chanh cho thấy có sự khác biệt về bảo vệ giữa các nhóm điều trị và có sự khác biệt về bảo vệ ở khoảng thời gian thử nghiệm vì giá trị p
9 kết hợp của 2 lá: lá Trầu không và lá Húng quế hoặc lá Sả đỏ và lá chanh có khả năng như một loại thuốc chống côn trùng tự nhiên thay thế DEET. [23] Trong nghiên cứu này, tinh dầu được chiết tách từ 7 loại lá trầu khác nhau tại các tỉnh địa phương khác nhau (Bangla, Bagerhati, Manikdanga, Meetha, Kalibangla, Chhaanchi và Ghanagete) với mục đích cho thấy các loại giống khác nhau thì có các thành phần hóa học và có tính chất ức chế enzyme của các loại là khác nhau. Các loại tinh dầu này ức chế glucuronidase, liên quan đến bài tiết xenobamel, và cho thấy các đặc tính gây độc tế bào. Nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng tiềm năng của tinh dầu lá Trầu không (Piper betle L.) trong lĩnh vực y tế và mỹ phẩm. [35] Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới các đặc tính chống oxy hóa và chống viêm của việc chiết tách lá Trầu không (Piper betle L.) đã được nghiên cứu. Các dung môi được sử dụng là nước, ethanol, ethyl acetate và hexane. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng để xác định cấu hình hóa học và nồng độ của các hợp chất có trong lá trầu không, cụ thể là hydroxychavicol (HC) và eugenol (EU). Khả năng chống oxy hóa của các chất có trong lá Trầu không được đánh giá bằng cách sử dụng hai xét nghiệm quét gốc superoxide-xanthine / xanthine oxyase superoxide (xét nghiệm SOD) và xét nghiệm diệt gốc tự do 1,2-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH). Các xét nghiệm chống viêm được sử dụng là các xét nghiệm ức chế hyaluronidase (HYA), xanthine oxyase (XOD) và lipoxygenase (LOX). Kết quả HPLC cho thấy HC và EU được phát hiện trong tất cả các loại dung môi chiết nhưng nồng độ cao nhất là trong nước. Năng suất chiết cao nhất thu được bằng cách sử dụng nước. Tất cả các dung dịch chiết đều có khả năng chống oxy hóa cao nhưng với việc chiết bằng nước cho thấy sự ức chế là mạnh nhất. Các chất có trong dịch chiết cũng thể hiện sự ức chế đáng kể trong các xét nghiệm XOD và LOX. Kết quả chỉ ra rằng hoạt tính sinh học của dung dịch chiết có liên quan đến HC và EU. [36]
10 2.2. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật: [16] 2.2.1. Khái niệm và mục đích của chiết Khái niệm: Là quá trình tách và phân ly một hoặc một số chất ra khỏi nguyên liệu dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng với một pha lỏng không hòa tan với nó. Mục đích của chiết: là chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của các chất nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu. Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên. 2.2.2. Các phương pháp tách chiết Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước: Nguyên tắc: Dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt hai chất đều bay hơi. Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng áp suất của môi trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước. Ưu điểm: Thiết bị gọn gàng, dễ chế tạo, quy trình sản xuất đơn giản. Trong quá trình chưng cất có thể phân chia các cấu tử bằng cách ngưng tụ từng phần theo thời gian. Thời gian tương đối nhanh, nếu chưng cất gián tiếp thì mất khoảng 6 - 10 giờ, nếu thực hiện liên tục thì mất 30 phút đến 1 giờ. Có thể tiến hành chưng cất với các cấu tử chịu được nhiệt độ cao. Nhược điểm: Không áp dụng phương pháp này với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất kéo dài, tốn rất nhiều hơi và nước ngưng tụ. Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử bị thủy phân. Không có khả năng tách các thành phần khó bay hơi trong các thành phần của nguyên liệu. Hàm lượng tinh dầu còn lại trong nước chưng tương đối lớn. Tách chiết bằng dung môi: Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng
11 thích hợp ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung môi với bên ngoài dung môi do chênh lệch nồng độ. Sau khi chiết phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu. Yêu cầu của dung môi chiết: Có nhiệt độ sôi thấp, nhưng không quá thấp để hạn chế tổn thất dung môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi. Không tương tác hóa học với tinh dầu. Có khả năng thu hồi tái sử dụng. Độ nhớt thấp để không làm giảm tốc độ khuếch tán. Có khả năng hòa tan tinh dầu lớn, nhưng hòa tan hợp chất không được hòa tan nước để tránh làm loãng dung môi và hạn chế khả năng hòa tan tinh dầu của dung môi. Dung môi phải tinh khiết, không được ăn mòn thiết bị, không gây mùi lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người. Khi bay hơi dung môi không để lại cặn vì cặn còn lại từ dung môi có thể ảnh hưởng xấu hoặc phá hủy mùi thơm của tinh dầu. Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm. Tách chiết bằng soxlet: Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi. Các dung môi thường dùng là n-hexan (C6H14), diclometan (CH2Cl2), etanol (C2H5OH). Chiết ngâm: Là phương pháp ngâm dược liệu với một loại dung môi với vài ba lần lắc hoặc khuấy ở nhiệt độ phòng. Gồm: phương pháp ngâm một lần, ngâm nhiều lần và ngâm nóng. Đây là phương pháp phổ biển trong các phương pháp tách chiết thực vật vì đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền. Phương pháp ngấm kiệt: Chiết xuất ngấm kiệt được tiến hành bằng cách thường xuyên tách các chất chiết ra khỏi nguyên liệu. Phương pháp này thường xuyên dùng dung môi sạch nên có nhược điểm là mất nhiều thời gian. Chiết siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng khả năng chiết xuất. Chiết siêu âm là phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20000Hz. Dùng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa hai pha
12 bằng cách phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp. Chiết xuất ngược dòng: Nguyên tắc của chiết xuất ngược dòng là hướng di chuyển của dung môi ngược dòng với hướng di chuyển của nguyên liệu, bản chất là phương pháp chiết xuất nhiều lần được cải tiến để tận dụng khả năng hòa tan của dung môi. Nguyên liệu lần lượt được chiết bằng những dịch chiết có nồng độ hoạt chất giảm dần, nguyên liệu kiệt nhất sẽ được chiết xuất bằng dung môi mới và dùng làm dung môi chiết cho các bình tiếp theo. Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn: Thay vì sử dụng các loại dung môi hữu cơ chúng ta có thể sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (31,10C, 73 atm), nước ở trạng thái siêu tới hạn (3740C, 218 atm) hay chất lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng, hệ hai pha, hệ thống không có dung môi sử dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit, silic oxit và nhôm. Sử dụng phương pháp chiết này cho phép thu được sản phẩm có độ tinh khiết, có màu sắc và hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biến đổi như trong các phương pháp chiết khác. 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: [16] 2.3.1. Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược liệu Màng tế bào dược liệu Màng tế bào dược liệu có ảnh hưởng nhiều đến quá trình khuếch tán. Đối với thực vật còn non hay mỏng mềm như cỏ cây, hoa lá, thành phần của màng tế bào chủ yếu là cellulose. Cellulose có tính chất không tan trong nước và không tan trong các dung môi khác, bền vững ở nhiệt độ cao, có tính mềm dẻo đàn hồi. Đối với dược liệu loại này, dung môi dễ thấm vào dược liệu, do đó chỉ cần xay thô dược liệu. Nếu xay mịn, dễ kéo theo nhiều tạp vào dịch chiết. Đối với dược liệu đã già, rắn chắc như hạt, gỗ, rễ, vỏ thân... thì màng tế bào có thể bị hóa bần, hoá cutin, hoặc có thể bị phủ thêm một lớp sáp... đó là những chất có bản chất lipid, có tính chất không thấm nước và khí, do đó dung môi khó thấm vào dược liệu. Một số loài thực vật khi già màng tế bào có thể bị hoá gỗ, hoá khoáng, bị phủ thêm lớp dioxyt silic hoặc canxi carbonat, màng tế bào trở nên dày, rắn chắc, nên