Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật phân giải xenlulo được phân lập từ các mẫu đất dưới tán rừng thông đuôi ngựa (Piius massoniana) ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc

Chia sẻ: Tri Lễ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm xác định được đặc điểm sinh học, điều kiện sinh trưởng và phát triển tối ưu của các chủng vi sinh vật là cơ sở khoa học để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy xenlulo. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật phân giải xenlulo được phân lập từ các mẫu đất dưới tán rừng thông đuôi ngựa (Piius massoniana) ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM CAM VĂN SẰN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI XENLULO ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÁC MẪU ĐẤT DƯỚI TÁN RỪNG THÔNG ĐUÔI NGỰA (Pinus massoniana) Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : NLKH Khoa : Lâm nghiệp Khóa học : 2015 - 2019 Thái Nguyên - năm 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM CAM VĂN SẰN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI XENLULO ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÁC MẪU ĐẤT DƯỚI TÁN RỪNG THÔNG ĐUÔI NGỰA (Pinus massoniana) Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : NLKH Lớp : K47 NLKH Khoa : Lâm nghiệp Khóa học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn: TS. Vũ Văn Định Th.S. Phạm Thu Hà Thái Nguyên - năm 2019
i LỜI CẢM ƠN Trên cơ sở hợp tác giữa Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam và được sự phân công của khoa Lâm Nghiệp, trường Đại học nông Lâm Thái Nguyên tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật phân giải xenlulo được phân lập từ các mẫu đất dưới tán rừng thông đuôi ngựa (Piius massoniana) ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc”. Để hoàn thành khóa luận này trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Vũ Văn Định - Bộ môn Vi sinh vật Bảo vệ rừng, Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam là người thầy rất tận tâm, đã định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi bày tỏ lòng biết ơn tới cô giáo ThS. Phạm Thu Hà - Khoa Lâm Nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Tôi xin trân trọng cám ơn tới KS. Phạm Văn Nhật, KS. Trần Nhật Tân và các cán bộ Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong việc triển khai các thí nghiệm nghiên cứu. Tôi trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các cán bộ Khoa Lâm nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ và trang bị tôi kiến thức hữu ích và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè yêu quý đã luôn là nguồn động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2019 Sinh viên Cam Văn Sằn
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong khóa luận là kết quả thí nghiệm thực tế của tôi tại Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam, nếu có sai sót gì tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2019 XÁC NHẬN CỦA GVHD NGƯỜI VIẾT CAM ĐOAN Th.S. Phạm Thu Hà Cam Văn Sằn
iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU Chữ viết tắt/ký hiệu Giải nghĩa đầy đủ CFU : Đơn vị khuẩn lạc trong 1 ml hoặc 1 gam CT : Công thức D1.3 : Đường kính ngang ngực ĐC : Đối chứng Do : Đường kính gốc DTB : Đường kính trung bình DNA : Deoxyribonucleic acid Hdc : Chiều cao dưới cành Hvn : Chiều cao vút ngọn KV : Khu vực LSD : Khoảng sai dị MĐ : Mật độ ODB : Ô dạng bản OTC : Ô tiêu chuẩn PDA : Potato Dextrose Agar Sd : Sai tiêu chuẩn TCLN : Tổng cục Lâm nghiệp TB : Trung bình VSV : Vi sinh vật
iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Một số VSV sản xuất cellulase ......................................................... 7 Bảng 4.1. Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo trong các điều kiện ẩm độ khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy ...................................... 27 Bảng 4.2: Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo trong các điều kiện ẩm độ khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy ...................................... 29 Bảng 4.3: Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo trong các điều kiện ẩm độ khác nhau sau 12 ngày nuôi cấy .................................... 31 Bảng 4.4. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 3 ngày nuôi cây .................................................................. 33 Bảng 4.5. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 7 ngày nuôi cây .................................................................. 35 Bảng 4.6: Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 12 ngày nuôi cây ................................................................ 37 Bảng 4.7: Mức độ phân giải xenlulo của các chủng vsv ................................ 39 Biểu 4.8: Kết quả đánh giá sự phân hủy xenlulo của 3 chủng VSV ............... 41
v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Bản đồ ranh giới huyện Tam Đảo ................................................... 19 Hình 4.1: 9 chủng VSV đánh giá điều kiện sinh trưởng phát triển ................ 26 Hình 4.2: Biểu đồ sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo trong các điều kiện ẩm độ khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy ........................ 27 Hình 4.3: Chủng VSV LSN6.2 và chủng khuẩn HBN1.1 sau 3 ngày phát triển ở ẩm độ 80% ..................................................................................... 28 Hình 4.4: Biểu đồ sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo trong các điều kiện ẩm độ khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy ........................ 29 Hình 4.5: Chủng VSV LSN6.2 và chủng khuẩn LSN5.2 sau 3 ngày phát triển ở ẩm độ 90% ..................................................................................... 30 Hình 4.6: Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo trong các điều kiện ẩm độ khác nhau sau 12 ngày nuôi cấy..................................... 31 Hình 4.7 Chủng VSV LSN6.2 và chủng VSV HBN3.1 sau 12 ngày phát triển ở ẩm độ 80% ..................................................................................... 32 Hình 4.8. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 3 ngày nuôi cấy .................................................................. 34 Hình 4.9: Chủng VSV LSN9.2 và chủng VSV SSN5.4 sau 3 ngày phát triển ở thang nhiệt độ 100C ........................................................................... 34 Hình 4.10. Biểu đồ đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 7 ngày nuôi cấy................................................. 36 Hình 4.11: Chủng VSV LSN7.1 và chủng VSV LSN 10.1 sau 12 ngày phát triển ở thang nhiệt độ 250C ............................................................... 36 Hình 4.12: Biểu đồ đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 12 ngày nuôi cây............................................... 38 Hình 4.13: Chủng VSV LSN6.1 và chủng VSV LSN 10.1 sau 12 ngày phát triển ở thang nhiệt độ 300C ............................................................... 38 Hình 4.14: Biểu đồ mức độ phân giải xenlulo của các chủng vsv .................. 40 Hình 4.15: Độ phân giải xenlulo từ không đến rất mạnh................................ 40 Hình 4.16: Các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenlulo cao được đưa vào thí nghiệm................................................................................... 42
vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU ...................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. v MỤC LỤC ........................................................................................................ vi PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2 1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ........................................................................... 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ...................................................... 3 2.1. Tổng quan tài liệu nghiên cứu .................................................................... 3 2.1.1. Tổng quan về Emzym xenlulo ................................................................ 3 2.1.1.1. Phân loại cellulase ................................................................................ 3 2.1.1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase................................................. 4 2.1.1.3. Ứng dụng của emzym cellulose ........................................................... 5 2.1.2. Vi sinh vật phân giải cellulose ................................................................ 7 2.1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ....................................................... 7 2.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước....................................................... 11 2.1.3. Chế phẩm vi sinh vật có chứa vi sinh vật phân giải cellulose .............. 14 2.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 14 2.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................... 16 2.2. Tổng quan khu vực nghiên cứu ................................................................ 18
vii 2.2.1. Vị trí địa lý ............................................................................................ 18 2.2.2. Điều kiện địa hình ................................................................................. 19 2.2.3. Điều kiện khí hậu thời tiết ..................................................................... 20 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, PHAM VI, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 21 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 21 3.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 21 3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 21 3.3.1. Đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ không khí đến sự sinh trưởng của các chủng VSV phân giải xenlulo ......................................................................... 21 3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV phân giải xenlulo. ................................................................................... 21 3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22 3.4.1. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV phân giải xenlulo ......................................................................... 22 3.4.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV phân giải xenlulo ................................................................... 22 3.4.3. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenlulo ....... 23 3.4.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng .... 23 3.4.3.2. Thí nghiệm các chủng rất mạnh đối với vật liệu cháy (trong bình thí nghiệm) ...................................................................................................... 24 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 26 4.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của ẩm độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV phân giải xenlulo .................................................................................... 27 4.1.1. Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo sau 7 ngày nuôi cấy ........................................................................................................... 28
viii 4.1.2. Sinh trưởng và phát triển của VSV phân giải xenlulo sau 12 ngày nuôi cấy ........................................................................................................... 30 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng VSV ................................................................................................ 33 4.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 3 ngày nuôi cây ................................................................................ 33 4.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 7 ngày nuôi cây ................................................................................ 35 4.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng VSV sau 12 ngày nuôi cây .............................................................................. 37 4.3. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenlulo .......... 39 4.3.1. Phương pháp xác định phân giải hoạt tính xenlulo của các chủng ....... 39 4.3.2. Thí nghiệm các chủng rất mạnh đối với vật liệu cháy (trong bình thí nghiệm) ...................................................................................................... 41 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 43 5.1. Kết luận .................................................................................................... 43 5.2. Tồn tại ...................................................................................................... 43 5.3. Kiến nghị .................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44 I. TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 44 II. TIÊNG ANH............................................................................................... 48
1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trái đất cả chúng ta đang ngày càng đối mặt với các vấn đề nghiêm trọng về thiên tai và khí hậu biểu hiện ở việc nhiệt độ trái đất ngày một nóng lên, lũ quét và hạn hán diễn ra thường xuyên liên tục trên hầu khắp các địa phương, tình trạng sa mạc hóa ngày một tăng. Những vấn đề thiên tai nêu trên ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của hàng triệu người trên khắp các lục địa. Một trong những nguyên nhân gây nên các vấn đề thiên tai đó là tình hình cháy rừng và chặt phá rừng xảy ra rất thường xuyên với quy mô diện tích vô cùng lớn trên rất nhiều kiểu rừng đặc biệt là rừng Thông. Với đặc tính của rừng Thông là lớp thảm khô thảm mục có khối lượng rất lớn và trong lá cũng như cành khô có chứa một lượng tinh dầu mỗi khi xảy ra cháy thì mức độ tàn phá là vô cùng lớn. Việc kiểm soát cháy rừng Thông rất khó khăn bởi đặc tính của lớp thực bì lớp thảm khô thảm mục có khối lượng rất lớn. Đứng trước những yêu cầu về tình hình hiện tại muốn giảm thiểu được cháy rừng Thông cũng như giảm thiểu được mức độ gây hại mỗi khi sẩy ra cháy chúng ta cần giảm thiểu được ở mức tối đa lớp vật liệu cháy là lá và cành cây khô cũng như lớp thực bì ở dưới tán rừng. Có rất nhiều các biện pháp được đưa ra như đốt trước, làm băng trắng, băng xanh cản lửa nhưng dường như các biện pháp trên chưa mang lại hiệu quả cao. Hiện nay trên thế giới việc đưa các vi sinh vật vào phục vụ đời sống đang trở nên phổ biến. Không nằm ngoài xu thế đó việc đưa các vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo dưới tán rừng Thông nhằm nâng cao hiệu quả của việc phòng trống cháy rừng Thông là hết sức cần thiết. Nhằm phục vụ công tác nghiên cứu phát triển những lợi ích của các chủng VSV này tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật phân giải
2 xenlulo được phân lập từ các mẫu đất dưới tán rừng thông đuôi ngựa (Pinus massoniana) ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc”. Xác định được đặc điểm sinh học như điều kiện sinh trưởng và phát triển tối ưu nhất cho các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy xenlulo cao ứng dụng vào trong sản xuất chế phẩm sinh học phân hủy xenlulo nhanh, để phục vụ trong lĩnh vực sản xuất Nông - Lâm nghiệp và ứng dụng trong phòng chống cháy rừng. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được đặc điểm sinh học, điều kiện sinh trưởng và phát triển tối ưu của các chủng vi sinh vật là cơ sở khoa học để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy xenlulo. 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Đề tài góp phần bổ sung cơ sở lý luận trong việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy nhanh xenlulo. 1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn - Là cơ sở để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm phân hủy nhanh xenlulo phục vụ trong lĩnh vực sản xuất Nông - Lâm nghiệp và phòng chống cháy rừng. - Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với việc nghiên cứu khoa học, kỹ năng thực hành học trong phòng thí nghiệm. Qua đó kết hợp với các kiến thức lý thuyết đã được học sinh viên sẽ có những hiểu biết chuyên sâu về chuyên nghành đào tạo.
3 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1. Tổng quan tài liệu nghiên cứu 2.1.1. Tổng quan về Emzym xenlulo Xenlulo là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy xenlulo thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình khả và cộng sự, 2007).[14] Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân xenlulo tạo thành các phân tử đường β-glucose. Theo nghiên cứu của một số tác giả, xenlulo bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β- (1,4)-glucanase hay enzyme C1, Endo-β-glucanase hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase: Exo-1,4-gluconase giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo và định hình hoặc xenlulo đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ ràng nhưng khi có một endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. β-1,4-glucosidase thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tinh thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. 2.1.1.1. Phân loại cellulase Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân xenlulo thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glycoside tạo thành các phân tử đường β-glucose.
4 Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại: - 1,4-  -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) - 1,4-  -D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) -  -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò và mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus… Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4-glucoside và tác động vào chuỗi xenlulo một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc xenlulo theo kiểu tùy tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi xenlulo và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên xenlulo vô định hình hoặc xenlulo đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên xenlulo kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt. ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase. 2.1.1.2. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân xenlulo thành cellobiose và cuối cùng thành glucose.
5 Sự phân giải xenlulo dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3 giai đoạn chủ yếu sau: Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, xenlulo bị thủy phân thành xenlulo hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, xenlulo hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose. Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose. Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy xenlulo trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm. 2.1.1.3. Ứng dụng của emzym cellulose Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp... Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất chế phẩm vi sinh. Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu
6 lignoxenlulo và xenlulo trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng lượng khác. Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin.Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết.Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy. Enzyme cellulase được bổ sung vào nhiều giai đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất giấy. Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyme cellulase để giữ màu vải sáng, bền và không bị sờn cũ. Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải jean và tạo ra các vệt “stone washed”. Trước đây các vệt “stone washed” được làm thủ công bằng cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra những sợi chỉ trắng. Hiện nay người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean thay cho việc sử dụng đá bọt. Enzyme cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên vải jean đã nhuộm màu để tạo ra các vệt “stone washed”. Các vệt “stone washed” được tạo ra bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt. Ngoài ra, người ta có thể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm hàm lượng cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt. Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất.
7 2.1.2. Vi sinh vật phân giải cellulose 2.1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Một số VSV đã được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều về khả năng phân giải xenlulo được thể hiện bảng 2.1. Bảng 2.1. Một số VSV sản xuất cellulase Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn Aspergillus niger Actinomyces aureus Preudomonas A.oryzae Act.cellulose Fluorescens A.terreus Act.diastaticus B.megaterium A.syndovii Act. roseus B.mensenteroides A. flavus Act.griseus Clostridium sp. Fusarium culmorum Act.melamocylas Acetobacter xylinum Fusarium oxysporum Act.coelicolor Vi khuẩn dạ cỏ Mucor pusilus Act.candidus Ruminoccus albus Pen. notatum Act.chromogenes Ruminobacter parum Penicillium spp Act. hygroscopicus Bacteroides Trichoderma lignorum Act.griseofulvin Amylophillus sp. Trichoderma reesei Act.ochroleucus Clos.butiricum Trichoderma viride Act.thermofulcus Clos.locheheadil Trichoderma konongi Act.xanthostrums Cellulosemonas Thermonospora curvata Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải xenlulo và khả năng phân giải xenlulo của chúng. Các vi sinh vật phân giải xenlulo trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn chủ yếu được phân lập từ hệ tiêu hóa động
8 vật ăn cỏ như bò, cừu, dê, và côn trùng như bọ cánh cứng, mối [43]. Ngoài ra chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước thải [34]. - Vi khuẩn: Vi khuẩn phân giải xenlulo bao gồm Clostridium, Bacteroidessucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccussulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata,Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides,Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn [43]. Trong lòng đất người ta cũng phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí như Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus. Đối với các dòng ưa ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và 550C, còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 750C [56]. - Xạ khuẩn: Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm. Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên. ADN của xạ khuẩn rất giàu G+C chiếm 57-75 % [50]. Chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô [45].Xạ khuẩn còn được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh như streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin. Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông nghiệp.Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu.Một số loài đáng chú ý thuộc giống nay như Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans [46].
9 Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương, Streptosporangium trong quặng apatit cũng là nhưng loài có khả năng phân hủy xenlulo [46]. - Nấm: Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy xenlulo [58]. Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi khuẩn. Một số chủng nấm nhưAcremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichodermaviride, penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusariumsolani,Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger,Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy xenlulo ở nhiều môi trường khác nhau [58]. Theo Sivakumaran (2014) phân lập được 21 chủng từ các nguồn vật liệu khác nhau như mùn cưa, lá rụng…. Trong đó lựa chọn loài nấm có khả năng phân giải xenlulo bằng phương pháp giấy lọc và phương pháp dùng thuốc thử DNS.Kết quả cho thấy Helminthosporium sp. và Cladosporium sp. là hai loài có khả năng phân giải mạnh nhất sau đó là Trichoderma sp và Aspergillus sp. Trong một nghiên cứu khác trên rơm rạ, thu được 25 loài khác nhau thuộc ngành Ascomycetes và Basidiomycetes, trong đó loài Trichoderma harzianum có khả năng phân giải xenlulo tốt nhất (Lee et al., 2011).[61] Theo nghiên cứu của V. Makeshkumar và P.U. Mahalingam (2011) 6 loại nấm bệnh có khả năng phân giải xenlulo (Fusarium sp., Aspergillusfumigatus, Cladosporium sp., Aspergillusflavus, Pyricularia sp. và Nigrospora sp.) đã được phân lập và thử nghiệm các chủng nấm phân giải xenlulo chiếu qua tia UV kết quả cho thấy nấm Fusarium phát triển tốt nhất và có quá trình phân giải xenlulo hiệu quả nhất. Do đó nghiên cứu đã đề xuất sử
10 dụng dòng nấm đột biến này để ủ chất thải hữu cơ khác nhau. Bên cạnh đó một số nhóm nấm khác như Trichoderma koningii, Sporotrichum thermophila, Myceliophthora thermophila cũng được nghiên cứu cho thấy có khả năng phân giải xenlulo tốt (Reddy.BR, Narasimha G và Babu GVAK (1998).[62] Các loài nấm mốc có khả năng sinh nhiều cellulase thuộc các giống Allernaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium...Chúng được tách ra từ đất xung quanh vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose.Ngoài ra các chủng nấm lớn thuộc lớp Basidomycetes cũng được đánh giá có khả năng sinh xenlulo mạnh. Lamot, Voets (1979)[ 49] đã 7 chủng vi sinh vật phân giải xenluloza để phân hủy xenlophan như: Aspergillus.sp, Penicillium.sp, 2 loài Chaetomium, 1 loài Sclerotium rolfsii, 2 loài xạ khuẩn Streptomyces. Tác giả nhận thấy nếu để riêng rẽ từng loại vi sinh vật tác dụng thì sự phân giải hầu như không diễn ra, còn khi hỗn hợp các chủng nói trên thì sự phận giả xenlophan bị phân hủy. Sau khi 7 chủng trong thời gian 100 ngày 85% xenlophan bị phân hủy sản phẩm cuối cùng được làm phân bón bao gồm: 30% protein, 60% đường hòa tan, 10% các gốc còn lại. Tại New Delhi- Ấn Độ Gaur và Bhardwaj (1985)[39] đã phân lập và tuyển chọn được rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenluloza. Sau đó tác giả đã sử dụng chủng nấm Trichurus spiralis, Trichoderma viride, Paecilomyces fusisporus, Aspergillus.Sp để đưa vào đống ủ (rơm rạ, lá khô) kết quả cho thấy: hàm lượng C hữu cơ giảm từ 48% xuống 25% trong vòng 1 tháng đầu tiên của quá trình ủ và chỉ trong vòng 8-10 tuần rơm rạ đã phân hủy hoàn toàn thành một loại phân hữu cơ có chất lượng tốt. Trong phân chứa khoáng 1,7 %N và tỷ lệ C/N là 12:3. Ở Nhật Bản đã phân lập và tuyển chọn ra một hỗn hợp các vi sinh vật có ích thuộc nhóm yếm khí và hiếu khí gồm: Nấm men, vi khuẩn quang hợp, xạ khuẩn, vi khuẩn lactic, nấm lên men và chế tạo ra được một chế phẩm vi