Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:48

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ; đánh giá tác dụng cải thiện khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC --------***-------- TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI-2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2016.Y Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. PHẠM THỊ NGUYỆT HẰNG 2. THS. ĐỖ THỊ QUỲNH HÀ NỘI-2021
LỜI CẢM ƠN Em muốn được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung ương, người thầy đã truyền cảm hứng, trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như kinh phí để em thực hiện đề tài khóa luận này. Em muốn gửi lời cảm ơn tới ThS. Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học cơ sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Cô đã cho em cơ hội được nghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lời khuyên quý báu, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp. Em muốn gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Y Dược học cơ sở, cô chủ nhiệm và các thầy cô bộ môn khác của Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, trong suốt khoảng thời gian 5 năm qua, đã cung cấp cho bản thân em rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập. Em xin cảm ơn tập thể các anh chị, cán bộ khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung ương đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trong quá trình thực nghiệm, cũng như chia sẻ những kinh nghiệm quý giá ứng dụng thực tế. Cuối cùng, em xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi em gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Hà Nội, ngày 29 tháng 5 năm 2021 Sinh viên Trương Thị Hoài Phương
MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về hội chứng tự kỷ ............................................................................. 2 1.1.1. Khái niệm về hội chứng tự kỷ................................................................ 2 1.1.2. Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ .............................................................. 2 1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ ............................................ 3 1.1.3.1 Yếu tố di truyền học ................................................................. 3 1.1.3.2 Yếu tố nguy cơ từ môi trường .................................................. 5 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ ......................... 6 1.1.5. Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ ......................................... 7 1.1.6. Một số mô hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ...................................... 7 1.2. Tổng quan về ruồi giấm ....................................................................................... 8 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển......................................... 8 1.2.2. Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm...................................... 9 1.2.2.1. Đặc điểm bên ngoài của ruồi giấm .......................................... 9 1.2.2.2. Hệ gen của ruồi giấm ............................................................... 9 1.2.2.3. Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm ............................................... 9 1.2.3. Mô hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ.......... 10 1.3. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa................................ 11 1.3.1. Tên gọi – vị trí phân loại ...................................................................... 11 1.3.2. Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng ........................................ 12 1.3.3. Thành phần hoá học và tác dụng sinh học ........................................... 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15 2.1. Dược liệu nghiên cứu ......................................................................................... 15 2.2. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 15 2.3. Hoá chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu .............................................................. 15 2.3.1. Hoá chất .................................................................................... 15 2.3.2. Dụng cụ, thiết bị ....................................................................... 16 2.4. Thiết kế thí nghiệm ............................................................................................ 16 2.4.1. Căn cứ để chọn mức liều 2 mg/ml và 4 mg/ml .................................... 16 2.4.2. Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu ............ 16 2.4.3. Thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu ...................... 18 2.4.4.Chia lô thí nghiệm................................................................................. 18 2.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 18 2.5.1. Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi ................. 18 2.5.1.1. Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm .................................................................................................... 18 2.5.1.2. Thử nghiệm đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành ........................................................................................ 19 2.5.1.3. Thử nghiệm đánh giá hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành ............................................................................... 20 2.3.1.4. Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành ................................................................................................... 21 2.5.2. Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa đối với khả năng sống sót của ruồi giấm Rugose trưởng thành ................. 22 2.6. Phân tích kết quả ..................................................................................... 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 24 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với ruồi giấm Rugose đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi............ 24
3.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ ............................................................................................................... 24 3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh đối với khả năng trèo của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ . 26 3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa tới khả năng cải thiện mức độ tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ ............................................................................................... 28 3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh tới sự thay đổi nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ .............................................................................................................................. 30 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa tới khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 35 1. Kết luận ................................................................................................................. 35 2. Đề xuất .................................................................................................................. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1 ABA Applied Behavioral Analysis Phân tích hành vi ứng dụng Attention deficit hyperactivity 2 ADHD Rối loạn tăng động giảm chú ý disorder 3 ASD Autism Spectrum Disorder Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ Diagnostic and statistical Cẩm nang thống kê và chẩn 4 DSM-5 manual of mental disorders đoán rối loạn tâm thần Gen Fragile X 5 FRM1 Fragile X Mental Retardation 1 Mental Retardation 1 6 NBEA Neurobeachin Gen Neurobeachin 7 TSC Tuberous Sclerosis Complex Hội chứng xơ cứng củ 8 TTRC Thạch tùng răng cưa
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) .......................... 5 Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái .................................................................................. 9 Hình 1.3: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm. ............................................................... 10 Hình 1.4: Cây Thạch tùng răng cưa. ........................................................................ 12 Hình 2.1: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng............... 19 Hình 2.2: Thiết kế thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng của ruồi giấm .............. 21 Hình 2.3: Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor .......................... 22 Hình 2.4: Mô hình đánh giá mức độ cải thiện khả năng sống sót ........................... 23 Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ............................................................................ 24 Hình 3.2: Kết quả đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành bằng thử nghiệm leo trèo ở các thời điểm 3, 7, 10 ngày tuổi................................................... 26 Hình 3.3: Khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ ........................................................................................................................... 28 Hình 3.4: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng hoạt động của ruồi giấm Rugose. ..................................................................................... 30 Hình 3.5: Kết quả phân tích mức độ vận động tại thời điểm buổi sáng của ruồi giấm trong 6 ngày. ............................................................................................................. 31 Hình 3.6: Đồ thị phân tích khả năng sống sót .......................................................... 33
ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder- ASD) là một rối loạn thần kinh phức tạp với những rối loạn về hành vi thường xuất hiện trong những năm đầu đời của trẻ, được đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng giao tiếp, tương tác xã hội kết hợp với những hành vi, sở thích hoặc hoạt động hạn chế và lặp đi lặp lại [34]. Gần đây, có nhiều sự thay đổi về nhận thức cũng như tiêu chuẩn chẩn đoán kết hợp với các yếu tố sinh học và môi trường, tỷ lệ tự kỷ đang gia tăng một cách nhanh chóng ở tất cả các quốc gia [24]. Nguyên nhân của tự kỷ đến nay vẫn chưa được xác định chính xác cũng như chưa có phương pháp hay thuốc điều trị đặc hiệu [11]. Trong khi đó, các thuốc tân dược hiện đang sử dụng mới chỉ giúp cải thiện triệu chứng, tuy nhiên, lại gây ra nhiều tác dụng không mong muốn nguy hiểm [32]. Do đó, nhu cầu nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu không hoặc có ít tác dụng không mong muốn để hỗ trợ và điều trị hội chứng tự kỷ là rất cần thiết và đang được thế giới quan tâm. Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis họ Thạch tùng (Thông đất) (Lycopodiaceae). Ở Việt Nam, cây mọc hoang dã tại một số vùng núi cao từ 1000 m trở lên, như là Lào Cai, Cao Bằng,… Theo kinh nghiệm dân gian, toàn cây Thạch tùng răng cưa được sử dụng để điều trị suy nhược thần kinh, mất trương lực cơ, cầm máu... [70] nhờ có các thành phần hoá học như alkaloid Huperzin A, Triterpen, Flavoles, và những acid Phenoliques…[21] Tại Việt Nam, việc nghiên cứu thuốc từ dược liệu nói chung và Thạch tùng răng cưa nói riêng nhằm hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ còn rất hạn chế. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose” với hai mục tiêu cụ thể sau: 1. Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ. 2. Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis). 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về hội chứng tự kỷ 1.1.1. Khái niệm về hội chứng tự kỷ Tự kỷ - “Autism” là tên gọi chứng rối loạn phát triển, đặc trưng bởi khiếm khuyết về mặt thiết lập các mối quan hệ, tương tác với xã hội, do nhà tâm lý học Leo Kanner đặt ra vào năm 1943 [49]. Chi tiết hành vi của nhóm trẻ mắc bệnh này được mô tả bao gồm: "Thiếu quan hệ tiếp xúc về mặt tình cảm với người khác; các thói quen thường ngày rất giống nhau về tính cách kỳ dị và tỉ mỉ; không có ngôn ngữ nói hoặc ngôn ngữ nói khác thường; rất thích xoay các đồ vật hình tròn; có kỹ năng mức cao về nhìn nhận không gian hoặc giỏi trí nhớ "vẹt", hình thức bên ngoài có vẻ hấp dẫn, nhanh nhẹn, thông minh" [34, 35, 40, 55, 59]. Năm 1979, Lorna Wing đã đưa ra thuật ngữ “Rối loạn phổ tự kỷ” (tên tiếng anh là “Autism Spectrum Disorder (ASD)”), do sự đa dạng triệu chứng biểu hiện [66]. Ngày nay, một thuật ngữ khác nữa được gọi để chỉ nhóm các rối loạn phức tạp này là “Hội chứng tự kỷ”. Người ta chia rối loạn phổ tự kỷ thành 5 phân loại bao gồm: rối loạn tự kỷ, rối loạn Asperger, rối loạn Rett, rối loạn Disintegrative và rối loạn phát triển lan toả không được chỉ định khác [8, 34]. Năm 2008, Liên hiệp quốc đưa ra khái niệm: “Tự kỷ là một dạng khuyết tật phát triển tồn tại suốt cuộc đời, thường xuất hiện trong 3 năm đầu đời. Tự kỷ là do rối loạn thần kinh, gây ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của não bộ. Tự kỷ có thể xảy ra ở bất cứ cá nhân nào, không phân biệt giới tính, chủng tộc hoặc điều kiện kinh tế - xã hội. Đặc điểm của tự kỷ là những khiếm khuyết về tương tác xã hội, giao tiếp ngôn ngữ, phi ngôn ngữ và có hành vi, sở thích, hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại”. Đây được coi là khái niệm tương đối đầy đủ và được đưa vào sử dụng phổ biến nhất. Những khiếm khuyết liên quan đến ASD hiện diện trong suốt cuộc đời và được coi là có tác động đáng kể về mặt chức năng, xã hội và tài chính đối với các cá nhân bị ảnh hưởng, gia đình và xã hội [23]. 1.1.2. Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ Theo thống kê mới nhất của Tổ chức Y tế Thế giới WHO (2021), người ta ước tính rằng trên toàn thế giới cứ 270 người thì có một người mắc ASD. Ước tính này đại diện cho một con số trung bình và tỷ lệ hiện mắc được báo cáo khác nhau đáng kể giữa các nghiên cứu. Tuy nhiên, một số nghiên cứu được kiểm soát tốt đã báo cáo những con số cao hơn đáng kể. Tỷ lệ mắc ASD ở nhiều quốc gia có thu nhập thấp và trung bình vẫn chưa được biết rõ [65]. 2
Tỷ lệ trẻ em mắc ASD ngày càng tăng ở mọi quốc gia. Một công bố của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) vào năm 2014 đã cho biết tỷ lệ rối loạn phổ tự kỷ là 1/68, tức cứ 68 trẻ thì có 1 trẻ mắc ASD, tăng 30% so với năm 2012 [2]. Xét về giới tính, theo nhiều nghiên cứu ở nhiều quốc gia khác nhau bao gồm cả Việt Nam, ASD có tỷ lệ gặp ở trẻ em nam cao gấp 3 lần so với trẻ em gái [31, 37, 41, 46, 48, 63, 64]. Tại Việt Nam, theo thống kê sơ bộ của Bộ Lao Động - Thương Binh và Xã Hội, Việt Nam có khoảng 200000 người mắc chứng tự kỷ và số lượng trẻ được chẩn đoán và điều trị ngày càng tăng lên, nếu tính theo cách tính của Tổ chức Y tế Thế giới, con số này ước chừng 500000 người [1]. Nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và cộng sự năm 2019 cho thấy: tỷ lệ mắc ASD ở trẻ 18-30 tháng tuổi ở miền Bắc Việt Nam là khoảng 75.2/10000 trẻ. Tỷ lệ mắc ASD ở trẻ em được tìm thấy trong nghiên cứu này khá tương đồng với tỷ lệ mắc ASD trung bình trên thế giới với tỷ lệ khoảng 0.76%. Cũng trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy những trẻ em sống ở thành phố có tỷ lệ mắc rối loạn phổ tự kỷ cao hơn trẻ em sống ở nông thôn. Mức độ đô thị hóa ngày càng tăng, dẫn đến trẻ có nguy cơ mắc hội chứng càng cao hơn. Một điểm đáng lưu ý nữa là tỷ lệ mắc ASD cao hơn ở những trẻ có mẹ làm nông nghiệp. Phát hiện này cho thấy có thể có mối quan hệ giữa ASD và thực hành canh tác, đặc biệt là việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật phổ biến ở Việt Nam [31]. 1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ Nguyên nhân gây ra rối loạn phổ tự kỷ hiện vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Vì rối loạn rất phức tạp và không có hai người mắc chứng tự kỷ giống hệt nhau nên có lẽ có nhiều nguyên nhân gây ra hội chứng này. Các bằng chứng khoa học hiện có cho thấy có thể có nhiều yếu tố khiến trẻ có nhiều khả năng mắc ASD, bao gồm các yếu tố về môi trường và di truyền. 1.1.3.1. Yếu tố di truyền học Theo một nghiên cứu về khả năng di truyền của các rối loạn phổ tự kỷ năm 2015, tiền sử gia đình là một trong những yếu tố đáng chú ý làm tăng khả năng mắc ASD. Ước tính có từ 64% đến 91% rủi ro là do tiền sử gia đình có người mắc hội chứng [8]. Mặc dù, đã chỉ ra rằng ASD có nguyên nhân đa yếu tố phức tạp, nhưng các nghiên cứu song sinh đã chứng minh được có sự đóng góp mạnh mẽ về mặt di truyền. Các nghiên cứu về sự liên hệ giữa tỷ lệ tự kỷ với các anh chị em trong gia đình có trẻ tự kỷ cho thấy, trong các trẻ sinh đôi cùng trứng, khi có một đứa trẻ bị tự kỷ thì nguy cơ mắc chứng tự kỷ của đứa trẻ còn lại có thể lên tới 70-90%. Tỷ lệ này ở trẻ sinh đôi khác trứng 3
chỉ khoảng 30% và 3-19% ở anh chị em nói chung. Hơn nữa, tỷ lệ là gấp đôi giữa các anh chị em cùng huyết thống so với các anh chị em cùng mẹ khác cha. Những kết quả này đã cung cấp bằng chứng cho thấy yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ASD. Từ đó, mở ra những nỗ lực lớn trong nghiên cứu để cố gắng làm sáng tỏ các yếu tố di truyền gây ra hội chứng này [68]. Các rối loạn di truyền đơn gen liên quan đến ASD Trong nhiều nghiên cứu, các rối loạn đơn gen đã được phát hiện xuất hiện đồng thời với ASD. Một số được báo cáo phổ biến nhất là bệnh xơ cứng củ và hội chứng Fragile X, ít gặp hơn là bệnh Phenylketon niệu và hội chứng Smith-Lemli-Opitz. Tỷ lệ ASD gặp trong các rối loạn này cũng tăng lên nhưng không tìm thấy ở tất cả các cá thể mang đột biến [25]. Nguyên nhân dẫn đến hội chứng Fragile X là sự mở rộng của bộ ba nucleotid CGG lặp lại trong vùng 5’ chưa được dịch mã của gen Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) [28]. Biết rằng hai trong bốn loại nucleotid là Adenin và Cytosin có thể bị methyl hóa, do đó, sự mở rộng này dẫn đến sự siêu methyl hoá promoter của FMR1 và đi kèm với đó là sự ức chế phiên mã [61]. Trong khi 1-3% trẻ em được chẩn đoán tự kỷ có hội chứng Fragile X thì khoảng 18-33% số trẻ mắc hội chứng Fragile X có hành vi tự kỷ [34]. Phức hợp xơ cứng củ - Tuberous Sclerosis Complex (TSC) là một chứng rối loạn di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi các khối u lành tính trong não và nhiều mô, cơ quan khác, chứng động kinh và suy giảm nhận thức. TSC là do đột biến gen TSC1 hoặc TSC2 mã hóa hamartin và tuberin tương ứng. Tỷ lệ hiện mắc ASD ở TSC được ước tính nằm trong khoảng từ 36% đến 50% [61]. Nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen Các nhà khoa học đã phát hiện được nhiều gen liên quan đến hội chứng tự kỷ khi nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen và phân tích toàn bộ vùng mã hoá. Chúng có chức năng và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như phiên mã và tái cấu trúc sợi nhiễm sắc, tổng hợp và phân huỷ protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương tế bào và hình thành các synap thần kinh (Hình 1.3) [14, 25, 61, 68]. 4
Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) với các chức năng sinh học khác nhau [61]. Các nghiên cứu di truyền gần đây đã xác định gen Neurobeachin (NBEA) là gen đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của ASD. Gen này bị phá vỡ ở bệnh nhân mắc chứng tự kỷ vô căn [67]. Báo cáo ban đầu cho thấy đột biến chuyển đoạn nhiễm sắc thể với điểm đứt gãy trên gen NBEA là nguyên nhân dẫn đến tự kỷ vô căn ở trẻ nam [13, 62]. Kết quả một nghiên cứu năm 2009 còn cho biết đột biến mất đoạn gen này cũng liên quan đến hội chứng tự kỷ [48]. NBEA mã hóa protein neo A-kinase (AKAP) liên kết với tiểu đơn vị điều hòa của protein kinase A (PKA), được xác định là protein đặc hiệu của tế bào thần kinh, có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển não. Các nghiên cứu trên mô hình động vật chỉ ra vai trò của NBEA trong nhiều quá trình của tế bào như cấu tạo võng mạc, trao đổi và giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh qua màng tế bào, tham gia duy trì trí nhớ ngắn hạn [61, 62]. 1.1.3.2. Yếu tố nguy cơ từ môi trường Các yếu tố môi trường có thể đóng vai trò nhất định trong cơ chế bệnh sinh ASD. Một số đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp đã mô tả các yếu tố nguy cơ trước khi sinh và chu sinh, cũng như các yếu tố chế độ ăn uống và lối sống của bà mẹ. Trong nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã chỉ ra tuổi cha và tuổi mẹ cao có liên quan độc lập tới nguy cơ mắc ASD. Điều này cũng làm tăng nguy cơ mắc ASD ở đời con [19]. Các yếu tố trước khi sinh bao gồm tình trạng trao đổi chất của mẹ, tăng huyết áp, tiểu đường thai kỳ, chảy máu khi mang thai hoặc tiền sử gia đình mắc bệnh tự miễn cũng 5
có liên quan đến nguy cơ mắc ASD và chậm phát triển kết hợp. Hơn nữa, nguy cơ gia tăng cũng được tìm thấy đối với trẻ sinh ra đầu tiên so với trẻ sinh ra thứ ba trở lên [26]. Nhiễm trùng tử cung có liên quan đến sự gia tăng đáng kể nguy cơ mắc bệnh tự kỷ. Mối liên hệ giữa nhiễm trùng của mẹ trong thời kỳ mang thai và sinh con với nguy cơ tự kỷ cũng được củng cố bởi các kết quả trên mô hình động vật. Nhiễm virus thai kỳ kích hoạt phản ứng miễn dịch của mẹ, có thể gây ảnh hưởng tới sự phát triển não bộ của thai nhi [30]. Một số phân tích gộp được đề cập gần đây cho thấy quá trình phơi nhiễm với thuốc trong thời kỳ mang thai có thể làm tăng nguy cơ tự kỷ với trẻ được sinh ra [26]. Phơi nhiễm trước khi sinh với Valproat đã được xác nhận là một trong những yếu tố nguy cơ đối với ASD, đặc biệt là trong ba tháng đầu của thai kỳ [16]. Thai nhi tiếp xúc với Valproat có nguy cơ mắc ASD cao gấp 8 lần [40]. Đối với thuốc chống trầm cảm, bao gồm các chất ức chế tái hấp thu serotonin có chọn lọc, các nghiên cứu được kiểm soát tốt cho thấy không có rủi ro không rõ ràng [40], mặc dù có ý kiến cho rằng việc tiếp xúc với thuốc chống trầm cảm khi mang thai làm tăng nhẹ nguy cơ mắc ASD, đặc biệt là trong 3 tháng đầu. 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ ASD có thể ảnh hướng tới sự phát triển sớm của não và tái tổ chức thần kinh. Hiện nay, vẫn chưa có dấu ấn đặc hiệu để chẩn đoán ASD do vậy việc xác nhận chẩn đoán ASD vẫn phải dựa trên đánh giá rối loạn hành vi được ghi trong cẩm nang thống kê và chẩn đoán rối loạn tâm thần của Hiệp hội Tâm thần Hoa Kỳ (DSM-5), được xuất bản năm 2013 [10]. Trẻ mắc hội chứng này thường biểu hiện sự suy giảm và bất thường ở 3 khía cạnh hành vi chính là tương tác xã hội, khả năng giao tiếp và hành vi có tính lặp lại. Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm việc xuất hiện của ít nhất 3 dấu hiệu của sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp đi lặp lại các hành vi có phản ứng quá mức. Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng giao tiếp bao gồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm khuôn mặt hay ngôn ngữ cơ thể. Các hành vi của trẻ có tính lặp đi lặp lại và dập khuôn. Trẻ không hứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội. Trẻ tự kỷ cũng có những thiếu hụt trong khả năng học tập và nhận thức, thiếu hụt ngôn ngữ, động kinh, bất thường vận động, lo lắng và các vấn đề về đường tiêu hóa [45, 61] đi kèm với rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học [51]. Ngoài ra, DSM-5 nhận định rằng ASD có thể đi kèm với các rối loạn khác, bao gồm các rối loạn di truyền (ví dụ, hội chứng Fragile X) và các vấn đề về sức khoẻ tâm thần (ví dụ, rối loạn tăng động giảm chú ý - Attention deficit hyperactivity disorder - ADHD) [40]. 6
1.1.5. Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ Hiện nay, bệnh nhân được chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ có thể tiếp cận với hai phương thức điều trị là: dùng thuốc hoặc không dùng thuốc: Với hướng điều trị không dùng thuốc, các phương pháp can thiệp đã được phát triển và nghiên cứu để điều chỉnh hành vi cho trẻ nhỏ. Những can thiệp này có thể làm giảm các triệu chứng, cải thiện khả năng nhận thức, kỹ năng sống hàng ngày và tối đa hóa khả năng hoạt động và tham gia vào cộng đồng của trẻ. Liệu pháp quản lý hành vi được sử dụng để cố gắng củng cố các hành vi mong muốn và giảm các hành vi không mong muốn. Trị liệu hành vi thường dựa trên phân tích hành vi ứng dụng (ABA) đã được chấp nhận rộng rãi giữa các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và được sử dụng trong nhiều trường học và phòng khám điều trị. Sự tiến bộ của trẻ được theo dõi và đo lường theo thời gian trị liệu thông qua các bảng kiểm tra hành vi và ngôn ngữ [71]. Với hướng điều trị bằng thuốc, hiện tại, chưa có loại thuốc nào có thể điều trị triệt căn cho rối loạn phổ tự kỷ. Nhưng vẫn có một số loại thuốc đã được chứng minh là có thể hỗ trợ điều trị một số triệu chứng liên quan đến ASD, đặc biệt là một số hành vi nhất định. Risperidon và Aripiprazol thuộc nhóm thuốc chống loạn thần đã được xác nhận là có thể cải thiện các triệu chứng khó chịu hoặc kích động ở trẻ em và thanh thiếu niên mắc ASD. Phần lớn trẻ em sử dụng hai loại thuốc này được cải thiện về việc cáu kỉnh và kích động, bao gồm gây hấn, tự gây thương tích và các hành vi gây rối khác. Nhưng cả hai loại thuốc này cũng có thể gây ra tác dụng không mong muốn, bao gồm an thần và tăng cân, làm tăng nguy cơ mắc các vấn đề sức khỏe sau này. Một vài loại thuốc như Methylphenidat, Atomoxetin và Guanfacin thường được sử dụng để điều trị rối loạn tăng động giảm chú ý (ADHD), cũng cho thấy lợi ích đối với các triệu chứng ADHD ở khoảng 25% trẻ mắc ASD. Tuy nhiên, với mỗi loại thuốc này, khả năng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn ở những người mắc ASD lại cao hơn so với những người mắc ADHD nói chung [40]. Các chuyên gia cũng khuyến cáo việc sử dụng thuốc điều trị cho bệnh nhân ASD cần thận trọng, nên ưu tiên cho các phương pháp điều trị có nguy cơ thấp hơn, bao gồm các can thiệp về hành vi hoặc tâm lý xã hội [33]. 1.1.6. Một số mô hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ Trong thập kỷ qua, các mô hình động vật bao gồm các loài linh trưởng, loài gặm nhấm (điển hình là chuột) và ruồi giấm đã góp phần không nhỏ trong việc nghiên cứu để tìm hiểu đặc tính, chức năng của các gen liên quan đến ASD. Tìm hiểu các mô hình loài gặm nhấm cho nghiên cứu ASD, nhìn chung có 2 loại mô hình chính là mô hình di truyền và mô hình không di truyền [61]. Các mô hình di 7
truyền ASD gây ra ở chuột có thể được thiết lập bằng cách nhắm mục tiêu vào các gen tương đồng của chuột với các gen có liên quan tới ASD ở người như FMR1, NBEA,... Cụ thể, chuột đực bị loại bỏ gen FMR1 có biểu hiện thiếu tương tác xã hội, sự hiếu động và suy giảm nhận thức. Những điều này là tương đồng với các triệu chứng tự kỷ ở người. NBEA đơn bội có thể gây ra rối loạn chức năng nhận thức và kiểu hình giống ASD, bao gồm những thiếu hụt trong hành vi xã hội, phản ứng sợ hãi có điều kiện, học tập không gian và trí nhớ ở chuột [61]. Mặt khác, các mô hình tự kỷ không di truyền trên chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Các mô hình này được gây ra do phơi nhiễm trước khi sinh với các tác nhân hóa học như Axit Valproic (VPA), Thalidomid và Ethanol trong khi mang thai, nhiễm virus hoặc viêm [61]. Trong số các yếu tố này, phơi nhiễm VPA, một loại thuốc chống động kinh và ổn định tâm trạng dùng cho bệnh nhân khi mang thai có thể làm tăng đáng kể tỷ lệ ASD ở con sinh ra [17, 44]. Nghiên cứu lâm sàng đã xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến việc sử dụng VPA, bao gồm dị tật bẩm sinh, chậm phát triển, giảm chức năng nhận thức và tự kỷ. Hội chứng tự kỷ do VPA gây ra có thể do khiếm khuyết trong sự phát triển tế bào thần kinh của tiểu não, hệ limbic và thân não gây ra sự gián đoạn trong kết nối synap giữa các tế bào thần kinh [61]. Bên cạnh đó, trong những năm gần đây, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mô hình để mô phỏng chứng rối loạn tự kỷ ở người với mục tiêu xác định được tác động của các yếu tố về gen, môi trường đến các hành vi, biểu hiện, khả năng vận động, các thay đổi về nhịp sinh học của ruồi giấm. Một số gen có liên quan và đã được sử dụng để gây mô hình ruồi giấm tự kỷ trên thế giới như: gen Rugose, dFMR… [61]. Việc tổng hợp nhiều dữ liệu nghiên cứu sử dụng mô hình ruồi giấm biến đổi gen cho hội chứng tự kỷ cũng góp phần xác định được vai trò của các nhóm gen liên quan, làm sáng tỏ cơ chế phân tử của ASD. 1.2. Tổng quan về ruồi giấm 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển Ruồi giấm có tên khoa học Drosophila melanogaster thuộc họ Drosophilidae, là sinh vật được sử dụng trong lĩnh vực di truyền học từ đầu những năm 1900. Nó phân bố ở tất cả các châu lục, bao gồm cả hầu hết các đảo. Hiện nay, ruồi giấm là sinh vật mô hình được sử dụng rộng rãi không chỉ trong di truyền học cổ điển và phân tử, mà còn với nhiều kỹ thuật sinh hóa, sinh học tế bào và sinh lý học mới, để nghiên cứu các vấn đề đòi hỏi cách tiếp cận đa ngành, chẳng hạn như sinh học phát triển và sinh học thần kinh [22, 54]. 8
1.2.2. Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm 1.2.2.1. Đặc điểm bên ngoài của ruồi giấm Ruồi giấm có màu vàng nâu với các vòng đen ngang bụng. Con cái trưởng thành có kích thước dài khoảng 2.5 mm, con đực nhỏ hơn với phần bụng sẫm màu. Dễ dàng phân biệt được con đực và con cái nhờ sự khác nhau về màu sắc với mảng đen rõ rệt ở bụng [42]. Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái [18]. 1.2.2.2. Hệ gen của ruồi giấm Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 139.5 triệu cặp base gồm khoảng 17000 gen phân bố trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể. Sự đơn giản này là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [7, 50]. 1.2.2.3. Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm Vòng đời của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành. Một con ruồi cái có thể đẻ tới 2000 trứng trong suốt cuộc đời của nó. Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 18-24h. Phôi này, sau đó, lột xác 2 lần qua ba giai đoạn ấu trùng khác nhau trước khi hoá nhộng và trải qua quá trình biến thái, cuối cùng, trở thành ruồi giấm trưởng thành. Ở 25°C, sự phát triển để thành một con ruồi trưởng thành chỉ mất khoảng 10 ngày kể từ khi xảy ra hiện tượng thụ tinh. Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm trưởng thành khi là khoảng 60-70 ngày [22, 29, 50]. 9
Hình 1.3: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm [22]. 1.2.3. Mô hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ Năm 2015, tác giả Wise và cộng sự đã nghiên cứu và xác định được mối liên quan giữa đột biến gen Rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện của rối loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm [67]. Nghiên cứu khác cũng cho thấy các đột biến mất chức năng của gen Rugose thể hiện cấu trúc synap bất thường ở ấu trùng và khiếm khuyết trong các tương tác xã hội và suy giảm vận động ở ruồi trưởng thành [67]. Những phát hiện này chỉ ra rằng đột biến gen Rugose biểu hiện các đặc điểm kiểu hình tương tự như ASD ở con người. Do đó, sử dụng ruồi giấm đột biến gen Rugose có thể là một mô hình phù hợp để nghiên cứu ASD, đồng thời qua đó, chúng ta có thể hiểu biết rõ ràng hơn về vai trò của gen NBEA trong rối loạn phổ tự kỷ ở người. Với những ưu điểm của mình, ruồi giấm (Drosophila melanogaster) đã được đưa vào sử dụng trong lĩnh vực di truyền học rất sớm từ những năm đầu thế kỉ XX: - Các nhà khoa học đã giải trình tự toàn bộ hệ gen của ruồi giấm và phát hiện có khoảng 60% gen tương đồng với bộ gen của người, khoảng 75% các gen bệnh ở người đã biết có sự trùng khớp dễ nhận biết trong bộ gen của ruồi giấm [7, 9]. - So với các thử nghiệm trên động vật khác như chuột, khỉ,…, sử dụng ruồi giấm trong nghiên cứu ít vấp phải các vấn đề liên quan đến đạo đức trong nghiên cứu y sinh học hơn. - Ruồi giấm phát triển nhanh (khoảng 10 ngày để thành ruồi trưởng thành), đẻ trứng nhiều (có thể tới 100 trứng/ngày) nên cho phép có thể tạo ra lượng lớn ruồi trong một thời gian ngắn, nghiên cứu nhiều thế hệ trong vòng vài tuần [7, 29]. - Ruồi giấm có kích thước nhỏ nên tiết kiệm chi phí nguyên vật liệu và không gian khi làm thí nghiệm. - Điều kiện sống đơn giản giúp dễ dàng tạo quần thể lớn ruồi, là tiềm năng trong sàng lọc dược chất và thuốc. 10
- Dễ dàng và an toàn khi gây mê ruồi giấm. Hơn nữa, hình thái ruồi cũng rất dễ nhận biết khi được gây mê. - Trong khi con người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể, D.melanogaster chỉ có 4. Sự đơn giản này là một trong những lý do khiến ruồi giấm thuộc những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [29]. Sử dụng ruồi giấm làm đối tượng nghiên cứu, T.H. Morgan – cha đẻ của mô hình này đã phát hiện ra quy luật di truyền liên kết gen và liên kết giới tính, từ đó, đặt nền móng cho di truyền học hiện đại. Đến ngày nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng ruồi giấm để xây dựng mô hình nghiên cứu bệnh trên người. Trong đó, có các bệnh thoái hóa thần kinh, ví dụ các mô hình ruồi giấm chuyển gen mã hóa các protein gây bệnh Alzhermer như β- amyloid, Tau, … [60]. Với nhiều ưu điểm đã được ghi nhận, kết hợp yếu tố dễ quan sát và định lượng, chúng tôi quyết định sử dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen Rugose để nghiên cứu tác dụng sinh học và đánh giá khả năng kéo dài tuổi thọ của cao chiết cồn TTRC. Mặc dù, có nhiều lợi thế cho việc sử dụng D. melanogaster để nghiên cứu các bệnh ở người, nhưng vẫn tồn tại một số nhược điểm : - Thiếu phương pháp để đo lường xu hướng hành vi. - Tác dụng thuốc có khác biệt đáng kể khi so sánh với các nghiên cứu ở người. Tóm lại, việc sử dụng D. melanogaster làm sinh vật mẫu rất tốt vì nhiều lý do, nhưng chúng cũng có những nhược điểm chưa thể khắc phục. Thế nhưng, mô hình sử dụng ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ này vẫn rất quan trọng khi cung cấp được những bằng chứng khoa học làm tiền đề tiếp tục đánh giá tác dụng điều trị tự kỷ của các dược liệu Việt Nam trên mô hình động vật thực nghiệm trong thời gian tới. 1.3. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa 1.3.1. Tên gọi – vị trí phân loại - Thạch tùng răng cưa (cây Thông đất) có tên khoa học: Huperzia serrata (Thunb.) Trevis. - Tên tương tự: Lycopodium Serrata (Thunb.) Trevis. - Vị trí phân loại của loài Huperzia serrata trong hệ thống phân loại thực vật: Ngành: Thạch tùng (Lycopodiophyta); Lớp: Thạch tùng (Lycopodiopsida); Bộ: Thạch tùng (Lycopodiales); 11
Họ: Thông đất (Lycopodiaceae) [69] hoặc Huperziaceae [21]; Chi: Huperzia; Loài: H. Serrata. 1.3.2. Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng Cây thân đứng, mọc ở đất cao từ 10-40 cm, thân đơn hay lưỡng phân 1-2 lần hình trụ, đường kính khoảng 2mm. Lá hình bầu dục đầu nhọn, dài 15 mm, rộng 3 mm; phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cưa. Túi bào tử ở nách lá, hình thận, màu vàng tươi [5]. Hình 1.4: Cây Thạch tùng răng cưa [3]. 1: Ảnh chụp tại thực địa; 2: Phần ngọn của cây; 3: Lá; 4: Túi bào tử mọc ở nách lá; 5,6: Túi bào tử đã mở; 7: Túi bào tử hình thận. Cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, đất mùn ở dưới tán rừng quanh năm ẩm ướt, độ mùn cao, ở độ cao 1000m so với mặt nước biển. Loài thực vật này được biết nhiều ở Trung Quốc dưới tên gọi là Qian Ceng Ta, trong các bài thuốc chữa bệnh như: cầm máu, lợi tiểu… Còn ở các nước phương Tây, đặc biệt là Hoa Kỳ, Thạch tùng răng cưa được sử dụng như thức ăn bổ trợ, bán rộng rãi trên thị trường. Loại cây này hiện nay còn được nghiên cứu nhiều với tác dụng tăng cường trí nhớ và điều trị bệnh Alzheimer . Ở Việt Nam, cây Thạch tùng răng cưa được tìm thấy nhiều ở Sapa (Lào Cai) và Đà Lạt (Lâm Đồng) [6]. Bộ phận dùng là phần thân cây trên mặt đất, có thể dùng tươi hoặc sấy khô để bảo quản lâu dài [69]. 12