Khoá luận tốt nghiệp: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân giải polysaccharide

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân giải polysaccharide” với mong muốn tìm đƣợc một số chủng vi khuẩn có năng lực sinh hệ enzyme phân giải polysaccharide cao nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình khai thác và sử dụng nguồn nguyên liệu này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khoá luận tốt nghiệp: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân giải polysaccharide

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này, trƣớc hết tôi xin gửi đến cô - TS nguyễn Nhƣ Ngọc, TS. Trần Thị Thu Lan lời cảm ơn sâu sắc, ngƣời đã giúp đỡ tận tình hƣớng dẫn và theo dõi sát sao tôi trong quá trình hoàn thiện nghiên cứu này. Tôi cũng xin gửi đến nhà trƣờng, quý thầy, cô giáo trong viện Công nghệ sinh học vàbộ môn Vi sinh - Hóa sinh lời cảm ơn chân thành nhất vì đã tạo cho tôi có cơ hội đƣợc thực hiện đề tài, thể hiện sự sáng tạo của mình tại nơi mà tôi yêu thích, để tôi có cơ hội áp dụng những kiến thức mà các thầy cô giáo đã truyền đạt. Thông qua quá trình thực hiện để tài, tôi đã học hỏi đƣợc nhiều điều và rút ra cho mình nhiều kinh nghiệm quý báu để giúp ích cho công việc sau này của bản thân. Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình thực hiện, hoàn thiện đề tài này không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp từ các thầy, cô. Sinh viên thực hiện Lê Thị Huệ i
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i MỤC LỤC ............................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... iv DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. vi ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 3 1.1.Tổng quan về polysacharide............................................................................ 3 1.1.1. Cấu trúc polysaccharide .............................................................................. 3 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide ..................................................................... 6 1.1.3. Các enzyme phân giải polysaccharide ........................................................ 7 1.1.4. Vi sinh vật phân giải polysaccharide ........................................................ 12 CHƢƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................................................. 15 2.1. Mục tiêu........................................................................................................ 15 2.2. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................... 15 2.3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu. .......................................................... 15 2.3.1. Vật liệu ...................................................................................................... 15 2.3.2. Hóa chất..................................................................................................... 15 2.3.3. Thiết bị, dụng cụ........................................................................................ 16 2.3.4. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 17 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 17 2.4.1. Phƣơng pháp thu nhận mẫu ....................................................................... 17 2.4.2. Phân lập vi khuẩn thuần khiết ................................................................... 18 2.4.3. Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải polysaccharide mạnh. ...... 18 2.4.4. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh hóa của chủng tuyển chọn. ............. 25 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 29 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải polysaccharide ............................................................................................................................. 29 3.2: Tuyển chọn các chủng có khả năng phân giải polysaccharide mạnh. ......... 30 ii
3.2.1. Tuyển chọn dựa vào định tính ................................................................... 30 3.2.2. Tuyển chọn dựa vào xác định hàm lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp DNS ..................................................................................................................... 35 3.2.3.Tuyển chọn các chủng có hoạt độ của enzyme cellulase, amylase, pectinase. ............................................................................................................. 39 3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của hai chủng vi khuẩn TA và CM .... 39 3.3.1. Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc ............................................................ 39 3.3.2. Kết quả nhuộm gram ................................................................................. 40 3.4. Xác định đặc tính sinh hóa .......................................................................... 41 3.4.1. Khả năng lên men các loại đƣờng ............................................................. 41 3.4.2 . Kết quả phản ứng MR và phản ứng VP ................................................... 43 3.4.3. Phản ứng catalase, khử nitrate, citrate, thử nghiệm tính di động.............. 43 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 47 4.1. Kết luận ........................................................................................................ 47 4.2.Kiến nghị ....................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Ký hiệu 1 Vi sinh vật VSV 2 Microlit µl 3 Lỗ thạch LT 4 Optical density - mật độ quang OD 5 Môi trƣờng cơ bản MTCB 6 Môi trƣờng tối ƣu MTTƢ 7 Môi trƣờng nuôi cấy MTNC 8 35 – dinitrosalicylic DNS 9 Cellobiohydrolase CBH 10 Micromet µm 11 Dalton DA 12 Vòng /phút v/p 13 Môi trƣờng thích hợp MTTH 14 Cellobiohydrolase CBH 15 Endo glucannase EG 16 Carboxyl methylcellulose CMC 17 B – glucanase BG 18 Phản ứng p/ứ 19 Aspergillus niger A.nige 20 Kilodalton KDa 21 Isoelectrics point Ip 22 Microlit µl iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Một số chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 15 Bảng 2.2: Một số thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu....................................... 16 Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ................................................ 16 Bảng 2.4: Danh sách môi trƣờng sử dụng và thành phần ................................... 17 Bảng 2.5: Trị số OD540 nm đo đƣợc ở các nồng độ đƣờng glucose khác nhau khi phản ứng với thuốc thử DNS .............................................................................. 21 Bảng 2.6: Trị số OD575 nm đo đƣợc ở các nồng độ đƣờng monogalacturonan khác nhau khi phản ứng với thuốc thử DNS ....................................................... 24 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập ........................ 29 Bảng 3.2. Đƣờng kính vòng phân giảicellulose của các chủng vi khuẩn ........... 31 Bảng 3.3: Đƣờng kính vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn ........... 32 Bảng 3.4: Đƣờng kính vòng phân giải pectin của các chủng vi khuẩn............... 34 Bảng 3.5: Kết quảxác định khả năng phân giải CMC của các chủng vi khuẩn .. 36 Bảng 3.6: Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn ............................................................................................................................. 37 Bảng 3.7: Kết quả xác định khả năng phân giải pectin của các chủng VSV ...... 38 Bảng 3.8: Kết quả tuyển chọn các chủng có hoạt độ của enzyme cellulase, amylase, pectinase. .............................................................................................. 39 Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái khuẩn lạccủa hai chủng vi khuẩn CM và TA ..... 40 Bảng 3.10: Kết quả nhuộm gram các chủng vi khuẩn ........................................ 40 Bảng 3.11: Tổng kết các đặc tính sinh hóa của chủng TA và CM ..................... 41 Bảng 3.12: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis. ........................... 46 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc amylose ................................................................................... 4 Hình 1.2: Hạt tinh bột trong lục lạp amylose ........................................................ 5 Hình 1.3: Cấu trúc amylopectin ............................................................................ 5 Hình 1.4: Cấu trúc cellulose .................................................................................. 6 Hình 1.5: Cấu trúc pectin ...................................................................................... 6 Hình 1.6: Sơ đồ hoạt động của các enzyme them gia thủy phân hoàn toàn cellulose. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt của mỗi enzyme.......................................... 8 Hình 1.7: Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase ............................ 10 Hình 1.8: Cơ chế tác động của pectinase vào phân tử pectin ............................. 11 Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn glucose................................................................ 21 Hình 2.2: Đồ thị đƣờng chuẩn glacturonic .......................................................... 24 Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc sau 1 ngày nuôi cấy của một số chủng phân lập đƣợc ..................................................................................................................... 30 Hình3.2: Hình ảnh vòng phân giải CMC của các chủng C1; C8; TA; H2, CM, L4......................................................................................................................... 31 Hình 3.4: Hình ảnh vòng phân giải pectin của các chủng có hoạt tính: H2, C8, CM, L4, TA. ........................................................................................................ 34 Hình 3.5: Hình ảnh thử enzyme cellulase với thuốc thử DNS............................ 36 Hình 3.6: Hình ảnh thử enzyme amylase với thuốc thử DNS ............................ 37 Hình 3.7: Hình ảnh thử enzyme pectinase với thuốc thử DNS........................... 38 Hình 3.8: Khả năng phân giải các loại đƣờng của chủng CM ............................ 41 Hình 3.9:Khả năng phân giải các loại đƣờng của chủng TA .............................. 42 Hình 3.10:Kết quả phản ứng MR và phản ứng VP ............................................. 43 Hình 3.11: Kết quả phản ứng hoạt hóa catalase .................................................. 43 Hình 3.12: kết quả phản ứng khử nitrate............................................................. 44 Hình 3.13: Kết quả phản ứng citrate ................................................................... 44 Hình 3.14: Kết quả thử nghiệm tính di động ...................................................... 45 vi
ĐẶT VẤN ĐỀ Carbohydrate là nhóm phân tử sinh học có mặt nhiều nhất trên trái đất,chiếm khoảng 80-90 % khối lƣợng khô ở thực vật và là chất dồi dào nhất trong các hợp chất hữu cơ tự nhiên, đặc biệt là cellulose, tinh bột và pectin… Hàng năm thực vật và tảo có khả năng biến - đổi hơn 100 tỷtấn CO2 và H2Othành glucose và sản phẩm hữu cơ khác nhƣ đƣờng và tinh bột là thức ăn chủ yếu của con ngƣời. Các hợp chất cacbonhydrate có ý nghĩa lớn đối với đời sống con ngƣời, tuy nhiên, với lƣợng sinh khối khổng lồ tạo ra hàng năm hiện nay trên trái đất chƣa thực sự đƣợc tận dụng một cách có hiệu quả để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị cao hơn mà chủ yếu là quá trình phân hủy diễn ra dƣới sự tác động của hệ enzyme trong các vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên. Vai trò của hệ enzyme phân hủy polysaccharide tự nhiên chủ yếu là góp phần vào việc khép kín chu trình cacbon trên trái đất. Hệ enzyme phân giải các hợp chất này là: cellulase, amylase, pectinase từ hệ VSV phong phú và đa dạng bao gồm cả vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm. Trong đó, vi khuẩn có vai trò đáng chú ý nhất trong quá trình phân giảicác hợp chất các bon do hệ enzyme từ vi khuẩn thƣờng có hoạt tính mạnh và phong phú. Để tận dụng khối lƣợng lớn nguồn nguyên liệu từ sinh khối, các nhà khoa học đã nghiên cứu để sản xuất và tối ƣu hóa quá trình chuyển hóa các hợp chất polysaccharide. Một trong những hƣớng chuyển hóa các hợp chất này hiệu quả và thân thiện với môi trƣờng nhất đó là con đƣờng sinh học đƣợc thực hiện bởi hệ enzyme từ vi sinh vật. Tuy nhiên, hiện nay hệ enzyme tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất polysaccharide hiệu quả nhƣ: cellulase, amylase, pectinase đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Ngoài ra, với điều kiện Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme là rất phong phú, vì thế việc nghiên cứu cải thiện và nâng cao hiệu suất quá trình sản xuất ra các enzyme từ VSV phân lập từ bản địa hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các VSV có khả năng sinh tổng hợp ra hệ enzyme phân giải polysaccharide, đặc biệt là cellulsae, pectinase, amylase sẽ giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ 1
tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen, cải tạo các chủng VSV công nghiệp sử dụng. Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các enzyme phân giải polysaccharide” với mong muốn tìm đƣợc một số chủng vi khuẩn có năng lực sinh hệ enzyme phân giải polysaccharide cao nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình khai thác và sử dụng nguồn nguyên liệu này. 2
CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Tổng quan về polysacharide Cacbonhydrate là hợp chất cấu tạo nên hầu hết các vật chất hữu cơ trong tự nhiên. Là hợp chất không những có vai trò quan trọng trong đời sống, nhƣ: cung cấp và dự trữ năng lƣợng,tạo cấu trúc, bảo vệ… mà còn đóng góp không nhỏ vào các ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp đồ uống và các sản phẩm lên men…[19]. Các hợp chất cacbonhydrate rất đa dạng và phong phú, tùy vào cấu tạo đƣợc chia thành các loại: polysaccharide (chứa hơn 10 đơn phân tử, nhƣ: amylose, cellulose, pectin, agar, chitin…), oligosaccharide (chứa từ 2 đến 10 đơn phân, nhƣ: saccharose, maltose, rafinose…) và monosaccharide (là đơn phân tử, nhƣ: glucose, fructose, galactose, xylose…). Hiện nay, lƣợng cacbonhydrate trên trái đất ngày càng lớn do sinh khối thực vật và phế phụ phẩm của các ngành nông nghiệp, lâm nghiệp…trong đó chiếm phần lớn là polysaccharide [20]. 1.1.1. Cấu trúc polysaccharide Polysaccharide đƣợc tạo thành từ các monosaccharide (> 10) liên kết với nhau bằng liên kết glucoside, còn rất ít nhóm – OH glucoside, không còn tính khử.Các monosaccharide trong polysaccharide có thể thuộc một hay nhiều loại khác nhau. Trong một số trƣờng hợp các gốc monosaccharide có chứa các nhóm khác nhau: acid sun furic, acid photphoric, acid axetic,... Các liên kết gluxit trong phân tử polysaccharide có thể là: anpha- gluxit hay beta- gluxit [11]. Polysacchride còn gọi là glycan, tùy thành phần monose có trong polysaccharide ngƣời ta chia chúng ra làm: homopolysaccharide (chỉ chứa một loạimonosaccharide) và heteropolysaccharide (có ít nhất 2 loại monosaccharide). Tùy vào kích thƣớc và đặc điểm cấu trúc của phân tử chúng có thể tạo dung dịch keo hoặc tan hoàn toàn trong nƣớc. Polysaccharide đóng vai trò quan trọng trong đời sống động vật, thực vật. Ở thực vật, polysaccharide chiếm 80-90% trọng lƣợng khô, tham gia vào thành phần các mô nâng đỡ, ví dụ cellulose, hay tích trữ dƣới dạng thực phẩm dự trữ với lƣợng lớn, ví dụ tinh bột. [15]. 3
Sự phân bố phổ biến và thƣờng gặp nhất của polysacchridetrong cuộc sống chủ yếu là cellulose, tinh bột, pectin. 1.1.1.1. Tinh bột Là polysaccharide dự trữ của thực vật, do quang hợp tạo thành. Trong củ và hạt có từ 40- 70% tinh bột, các thành phần khác của cây xanh có ít hơn và chiếm khoảng từ 4 đến 20%. Tinh bột không hòa tan trong nƣớc, đun nóng thì hạt tinh bột phồng lên rất nhanh tạo thành dung dịch keo gọi là hồ tinh bột. Tinh bột có cấu tạo gồm hai phần: amylose và amylosepectin, ngoài ra còn có khoảng 2% phospho dƣới dạng ester. Tỷ lệ amylosepectin/amylose ở các đối tƣợng khác nhau là không giống nhau, tỷ lệ này ở gạo nếp là lớn hơn gạo tẻ [12]. *Amylose Chiếm đến 15-20% lƣợng tinh bột, do nhiều gốc α D- glucose liên kết với nhau thông qua C1-C4 tạo thành mạch thẳng không phân nhánh. Trong không gian nó cuộn lại thành hình xoắn ốc và đƣợc giữ bền vững nhờ các liên kết hydro. Theo một số liệu trong amylase còn có chứa các α D- glucopyranose dạng thuyền [19]. Hình 1.1: Cấu trúc amylose Amylose bắt màu xanh với iodine, màu này mấy đi khi đun nóng, hiện màu trở lại khi nguội. Một đặc trƣng hóa lý khác cần chú ý là nó bị kết tủa bởi rƣợu butylic. 4
Hình 1.2: Hạt tinh bột trong lục lạp amylose *Amylopectin Cấu tạo do các phân tử α D- glucose liên kết với nhau, nhƣng có phân nhánh. Chỗ phân nhánh là liên kết C1-C6 glucosidic [23]. Hình 1.3: Cấu trúc amylopectin 1.1.1.2. Cellulose Đƣợc cấu tạo bởi những phân tử β D- glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glucosidic. Chúng là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật. Đối với ngƣời thì cellulose không có giá trị dinh dƣỡng vì cellulose không bị thủy phân trong ống tiêu hóa. Một số nghiên cứu cho thấy nó có vai trò trong điều hòa tiêu hóa. Động vật ăn có thủy phân đƣợc cellulose nhờ enzyme cellulase [20]. Cellulose không tan trong nƣớc, tan trong dung dịch Schweitzer. Khi đun nóng với H2SO4, cellulose sẽ bị thủy phân thành các phân tử β D- glucose. Cellulose có ở dạng hình sợi dài, nhiều sợi kết hợp song song với nhau thành chùm nhờ các liên kết hydro, mỗi chùm (micelle) chứa khoảng 60 phân tử cellulose. Giữa các chùm có những khoảng trống, khi hóa gỗ khoảng trống này chứa đầy lignin và tà xem lớp lignin này nhƣ một lớp cement. Lignin là chất trùng hợp của coniferylic alcohol [28]. 5
Hình 1.4: Cấu trúc cellulose Các gốc –OH của cellulose có thể tạo ester với acid ví dụ: tạo nitro cellulose với HNO3, tạo acetyl cellulose với CH3COOH. 1.1.1.3. Pectin Là loại polysaccharide có nhiều trong quả, củ và thân cây, thành phần chính là galacturonic acid có nhóm –COOH bị methyl hóa. Ngƣời ta sử dụng rộng rãi pectin trong sản xuất keo [24]. Hình 1.5: Cấu trúc pectin 1.1.2. Ứng dụng của polysaccharide Chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, ở các dạng tự nhiênvà biến tính nhƣ các chất tạo độ đặc hay tạo gel, chất làm bền nhũ tƣơng và các hệ phân tán. Ngoài ra chúng còn đƣợc dùng làm chất tạo màng, bảo vệ bề mặt các loại thực phẩm nhạy cảm khỏi những biến đổi không mong muốn, thành phần thêm vào trong các thực phẩm ăn kiêng... [8]. Sản phẩm của quá trình phân giải polysaccharide bằng enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công 6
nghiệp khác nhau (sản xuất cồn, sản xuất bia, chế biến thực phẩm gia súc…), trong nông nghiệp, trong hóa học… Do vậy, việc sử dụng enzyme phân giải polysaccharide có vai trò quan trọng trong đời sống hiện nay [8]. 1.1.3. Các enzyme phân giải polysaccharide Enzyme thủy phân polysaccharide đƣợc tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn và nấm. Trong tự nhiên, sinh khối polysaccharide đƣợc phân hủy hoàn toàn bởi hỗn hợp các enzyme thủy phân từ vi sinh vật trong khu hệ đặc trƣng nhƣ ở ruột mối, dạ cỏ bò và một số môi trƣờng khắc nghiệt. Những khu hệ này có thể ƣa khí hoặc kỵ khí, chỉ bao gồm vi khuẩn hoặc chỉ bao gồm nấm hoặc có cả nấm và vi khuẩn [28]. Polysaccharide gồm ba thành phần phổ biến rộng trong tự nhiên: cellulose, tinh bột, pectin tƣơng ứng với ba nhóm enzyme phân giải riêng biệt là nhóm các enzyme cellulase, amylase, pectinase. Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trƣờng thế giới, các chế phẩm này đã đƣợc khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau (sản xuất cồn, sản xuất bia, chế biến thực phẩm gia súc...), trong nông nghiệp, trong hóa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lƣợng nguyên tử". Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng đƣợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase,…và một số enzym đặc biệt khác đã thu đƣợc rất nhiều lợi nhuận từ ngành này [20]. 1.1.3.1. Cellulase Là enzyme thuộc lớp glycosyl hydrolase (GHF), thủy phân các hợp chất polysaccharide và oligosaccharide đƣợc tìm thấy trong tự nhiên ( cellulose, tinh bột, chitin, xylan,..). Cellulase đƣợc chia thành ba nhóm lớn là exoglucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), endoglucanase (EC 3.2.1.4) và β-glucosidase (EC 3.2.1.21). Exoglucanase di chuyển dọc theo sợi cellulose và cắt cellulose thành cellobiose. Trong khi đó, endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên liên kết β- 1,4- glucoside bên trong sợi cllulose còn β- glucosidasecó khả năng thủy phân cellobiose thành glucose cũng nhƣ cắt glucose ra khỏi cellooligosaccharide. 7
Những enzyme này hỗ trợ nhau trong quá trình thủy phân cellulose bằng cách tạo ra những vị trí tiếp cận cho nhau, loại bỏ vật cản và hạn chế ảnh hƣởng của các chất ức chế[28]. Hình 1.6: Sơ đồ hoạt động của các enzyme them gia thủy phân hoàn toàn cellulose. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt của mỗi enzyme. Cellulase có cấu trúc gồm hai phần: vùng xúc tác (Catalytic domain _ CD) và một hoặc nhiều vùng liên kết với carbohydrate (Carbohydrate binding modules_CBMs) nối với nhau bởi đoạn peptide ngắn. Vùng CBM có nhiệm vụ neo bám vùng xúc tác với cơ chất, từ đó làm tăng hiệu quả thủy phân cho enzyme. Chúng có thể nằm ở đầu N hoặc đầu C của vùng CD [112]. CBM từ các enzyme khác nhau và nguồi sinh vật khác nhau đƣợc phân chia thành các họ dựa trên độ tƣơng đồng về trình tự amino acid và cấu trúc không gian ba chiều . Ở nấm hiếu khí, CBM luôn thuộc họ 1 với kích thƣớc nhỏ (khoảng 30 - 35 amino acid). Trong khi đó, CBM của cellulase vi khuẩn có kích thƣớc lớn khoảng 100 đến 150 amino acid, thƣờng thuộc họ 2 hoặc 3 [43]. Vùng xúc tác của cellulase có thể có hoạt tính endoglucanase hoặc exoglucanase(riêng β- glucosidae không có thành phần CBM [112]. Tùy thuộc hoạt tính xúc tác mà domain này có cấu hình lõi khác nhau. Trung tâm hoạt động của endoglucanase có dạng rãnh . Do đó, một chuỗi cellulose có thể đi vào trung tâm xúc tác ở vị trí ngẫu nhiên và các liên kết sẽ bị cắt dọc theo chuỗi cellulose. Ngƣợc lại, vùng hoạt động của exoglucanase cấu trúc theo dạng “đƣờng hầm”, tạo bởi một vòng dài các phân tử protein cuộn xung quanh vị trí xúc tác [19]. Kết quả là, cơ chấtchỉ có thể đƣợc đƣa vào từ một đầu của trung tâm xúc tác, sự thủy phân liên kết diễn ra bên trong “đƣờng hầm” và giải phóng sản phẩm cellobiose từ đầu còn lại. 8
Các cellulase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghệ thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh. 1.1.3.2. Amylase Là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nƣớc: R.R’ + H-OH => RH + R’OH Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. Amylase đƣợc chia thành hai nhóm:endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào).Thủy phân tinh bột -> dextrin + một ít maltoza.Dextrin có khả năng họat hóa cao đặc trƣng cho tính chất của enzyme này.Phân tử có 1 - 6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme -> tính bền nhiệt của enzyme, α - amylase của sinh vật có những đặc tính rất đặc trƣng về cơ chế tác động, chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt.Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu: Nấm mốc: pH=4,5 - 4,9, vi khuẩn: pH=5,9 - 6,1. pH
Hình 1.7: Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase Cơ chế tác dụng:Quá trình thủy phân tinh bột bởi (-amylase là quá trình đa giai đoạn): Giai đoạn dextrin hóa và giai đoạn đƣờng hóa. Giai đoạn dextrin hóa: Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lƣợng lớn dextrin phân tử thấp ((-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). Giai đoạn đƣờng hóa:Các dextrin phân tử thấp vừa đƣợc tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi (-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dƣới tác dụng của (-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose này lại bị phân cắt tiếp tục nên các mạch polyglucose cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân củaα- amylase chứa 13% glucose và 87% mantose.Tác dụng của α- amylase lên amylopectin cũng xay ra tƣơng tự, nhƣng vì α- amylase không phân cắt đƣợc liên kết α- 1,6 glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đƣờng nói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dexstrin phân tử thấp và isomaltose(8%) . Ứng dụng:Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trƣờng thế giới, các chế phẩm này đã đƣợc khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không chỉ đƣợc ứng dụng trong y học mà còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau (sản xuất cồn, sản xuất bia, chế 10
biến thực phẩm gia súc,...), trong nông nghiệp, trong hóa học…"ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lƣợng nguyên tử". Theo thời gian, enzym công nghiệp ngày càng đƣợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulose, ligase, amylase,…và một số enzym đặc biệt khác đã thu đƣợc rất nhiều lợi nhuận từ ngành này [22]. 1.1.3.3. Pectinase Enzym pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy các polymer pectin.Sản phẩm tạo thành: acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol... Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase đƣợc chia thành 3 nhóm chính: Pectin methylesterase (PME), thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong các hợp chất pectin, pectin transeliminase, những enzyme thủy phân hoặc phân hủy liên kết α-1,4 glycoside trong các oligo-D-galacturonate [19]. Hình 1.8: Cơ chế tác động của pectinase vào phân tử pectin Cơ chế hoạt động của enzym pectinase[23][50]: Nhóm 1: Pectin methylesterase (PME) (EC.3.1.1.11): Enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân góc ester trong phân tử pectin tạo ra nhóm axit cacboxylic tự do và pectin trở nên tích điện âm, làm giảm mức độ ester hóa của cơ chất và giải phóng ra methanol. Chế phẩm PME thƣờng đƣợc ứng dụng trong sản xuất pectin để tạo ra sản phẩm với những mức độ ester hóa khác nhau. Ngoài ra, enzyme này còn đƣợc sử dụng để tách pectin ra khỏi nƣớc trái cây nhằm làm tăng độ trong cho sản phẩm. Nhóm 2: Thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong các hợp chất 11
pectin: Polygalacturonase (PG) gồm có ba enzyme: Endo PG (EC.3.2.1.15): thủy phân liên kết α-1,4 glycoside tại những vị trí ở giữa mạch của phân tử acid pectic hay pectinic, nhóm này có có tác động làm giảm rỏ rệt về độ nhớt. Exo PG (EC.3.2.1.67): thủy phân liên kết α-1,4 glycoside từ đầu không khử của phân tử acid petic hay acid petinic và tạo ra sản phẩm là D-galacturonate. Exo PG (EC.3.2.1.82): thủy phân liên kết α-1,4 glycoside từ đầu không khử của phân tử acid petic hay acid petinic và tạo ra sản phẩm là digalacturonate. Hai nhóm exo không làm giảm đáng kể độ nhớt. Polymethylgalacturonase (PGM) gồm hai enzyme: Endo PGM: thủy phân liên kết α-1,4 glycoside tại những vị trí ở giữa mạch phân tử pectin. Exo PGM: thủy phân liên kết α-1,4 glycoside từ đầu không khử của phân tử pectin và tạo ra sản phẩm là galacturonate. Nhóm 3: Pectin transeliminase: Những enzyme này xúc tác phản ứng phân giải liên kết α-1,4 glycoside trong các hợp chất pectin nhƣng không có sự tham gia của phân tử nƣớc. Tƣơng tự các nhóm enzyme thủy phân liên kết α-1,4glycoside trong các hợp chất pectin, các enzyme pectin transeliminase cũng đƣợc chia thành hai nhóm sau đây: Polygalacturonatelyase (PGL) gồm hai enzyme: Endo PGL (EC.4.2.2.2): xúc tác trên cơ chất là acid pectic hay acid pectinic, liên kết bị phân hủy nằm ở những vị trí giữa mạch của phân tử cơ chất. Exo PGL (EC.4.2.2.2): xúc tác trên cơ chất là acid pectic hay acid pectinic, liên kết bị phân hủy nằm ở vị trí đầu không khử của phân tử cơ chất. Polymethylgalacturonatelyase (PMGL) gồm các enzyme: Endo PGML (EC.4.2.2.10): xúc tác trên cơ chất là pectin, liên kết bị phân hủy nằm ở vị trí giữa mạch của phân tử cơ chất. Exo PMGL: xúc tác trên cơ chất là pectin, liên kết bị phân hủy nằm ở vị trí đầu không khử của phân tử cơ chất. Nhóm 4: Những enzyme thủy phân hoặc phân hủy liên kết α-1,4 glycoside trong các oligo-D-galacturonate [50]. Ứng dụng pectinase: Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase đƣợc chia làm 2 nhóm chính là : pectinase acid và peatinase kiềm. Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, đƣợc dùng trong ly trích và chế biến các loại trái cây, rƣợu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm đƣợc ly trích chủ yếu từ vi khuẩn đƣợc dùng trong chế biến các loài cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nƣớc thải, lên men trà, cà phê [45]. 1.1.4. Vi sinh vật phân giải polysaccharide 12
Đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải polysaccharide và khả năng phân giải polysaccharide của chúng. Các vi sinh vật phân giải polysaccharide chủ yếu đƣợc phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ nhƣ bò, cừu, dê [16] và côn trùng nhƣ bọ cánh cứng, mối [17,18]. Ngoài ra chúng còn đƣợc tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, đất, bùn từ nƣớc thải [13].Từ đó phân lập đƣợc vi sinh vật phân giải nhƣ: nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn,nấm đốm, nấm mục,...Nhƣng phổ biến nhất và đƣợc ứng dụng nhiều, hiệu quả trong đời sống là: nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn. 1.4.1.1. Nấm mốc Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy polysaccharide[30]. Các polysacchride từ nấm thƣờng có hoạt lực cao và dƣờng nhƣ không có các dạng vật lý phức tạp nhƣ enzyme này từ vi khuẩn. Nấm mốc khá phổ biến trong trong tự nhiên và có hiệu lực sản sinh enzyme phân giải polysacchride bao gồm: Acremonium spp., Chaetomium spp., Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy polysaccharide ở nhiều môi trƣờng khác nhau [7,30]. 1.4.1.2. Vi khuẩn Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào không có nhân điển hình, có đầy đủ đặc điểm của một vi sinh vật nhƣ khả năng tự tổng hợp chất dinh dƣỡng để sinh trƣởng và nhân lên. Trong tự nhiên vi khuẩn đƣợc sử dụng phân hủy xác hữu cơ trong (động vật, thực vật) thành chất vô cơ. Và đƣợc nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực phân hủy polysaccharide nhƣ: Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, 13
Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng đƣợc phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn [17,19,20]. Trong lòng đất ngƣời ta cũng phân lập đƣợc các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí nhƣ Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus . Đối với các dòng ƣa ấm, pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và 550C, còn đối với các dòng ƣa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 750C [21]. 1.4.1.3. Xạ khuẩn Xạ khuẩn thuộc nhóm Procaryotes, có cấu tạo nhân đơn giản giống nhƣ vi khuẩn. Tuy vậy, đa số tế bào xạ khuẩn lại có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh phức tạp và có nhiều màu sắc giống nhƣ nấm mốc. Chúng chiếm ƣu thế trong đất phèn khô [23].Xạ khuẩn còn đƣợc biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh nhƣ streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin.Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dƣợc phẩm cũng nhƣ trong nông nghiệp.Chúng tham gia vào các quá trình phân giải polysaccharide trong đất nhƣ xenluloza, tinh bột v.v.... góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên nhƣ: Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản sinh cellulase đƣợc quan tâm nghiên cứu. Một số loài đáng chú ý thuộc giống này nhƣ Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans [24,25,26]. Thermoactimnomyces đƣợc tìm thấy trong trầm tích đại dƣơng, Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khả năng phân hủy cellulose [27, 28, 29]. 14