Khóa luận tốt nghiệp: Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:56

Thêm vào BST

Báo xấu

57
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xây dựng được quy trình Bradford tối ưu định lượng nồng độ protein huyết tương; ứng dụng được quy trình để phân tích nồng độ protein ở các bệnh nhân đái tháo đường type 2 type2

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp: Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2

z [Date]  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN NGỌC HÒA XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021  1
z  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN NGỌC HÒA XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. VŨ THỊ THƠM ThS. VŨ VÂN NGA HÀ NỘI – 2021 
LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này là thành quả đánh dấu sự kết thúc 5 năm rèn luyện miệt mài trên giảng đường Trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN, là tiền đề trang bị cho sinh viên chúng em những kỹ năng, kiến thức quý báu trước khi bước chân vào con đường lập nghiệp. Vì vậy, nó có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với mỗi sinh viên. Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, ngoài những kỹ năng, kiến thức và sự nỗ lực của chính mình, bản thân em còn nhận được sự giúp đỡ tận tình từ các thầy cô giáo, các giáo viên hướng dẫn cùng sự cổ vũ, động viên của gia đình, bạn bè. Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người đã đồng hành cùng em trong suốt chặng đường học vừa qua. Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS. Vũ Thị Thơm – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, hướng dẫn và truyền thụ đến em niềm đam mê học tập, nghiên cứu y sinh. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Ths. Vũ Vân Nga – Giảng viên Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở, người đã luôn đồng hành, tận tâm hướng dẫn và chỉ dạy những kiến thức, kỹ năng cần thiết, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận. Em cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến các cán bộ giáo viên bộ môn Y Dược Học Cơ Sở và các thầy cô, cán bộ Trường Đại học Y Dược đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để em có thể hoàn thành khóa luận này. Em xin cảm ơn đề tài “Hợp tác nghiên cứu kỹ thuật định lượng một số biomarker ở bệnh nhân bị bệnh võng mạc mắt do đái tháo đường”, mã số nhiệm vụ NĐT.69/CHN/19 – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ nghiên cứu này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn cổ vũ, động viên và khuyến khích em trong suốt chặng đường học tập vừa qua. Xin chúc cho những điều tốt đẹp nhất luôn luôn đồng hành cùng cuộc sống của mọi người. Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hòa
LỜI CAM ĐOAN Em tên là: Nguyễn Ngọc Hòa MSSV: 16100085 Là sinh viên lớp QHY 2016 ngành Dược học Em xin cam đoan đề tài: “Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương ở các bệnh nhân Đái tháo đường type 2” là một công trình nghiên cứu độc lập dưới sự đồng hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn: TS. Vũ Thị Thơm và Ths. Vũ Vân Nga – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở. Ngoài ra không có bất cứ sự sao chép của người khác. Đề tài, nội dung báo cáo thực tập là sản phẩm mà em đã nỗ lực nghiên cứu trong quá trình học tập tại trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN. Các số liệu, kết quả trình bày trong báo cáo là hoàn toàn trung thực, em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm, kỷ luật của bộ môn và nhà trường đề ra nếu như có vấn đề xảy ra. Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hòa
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường IFG Rối loạn đường huyết lúc đói (Impaired fasting glucose) IGT Rối loạn dung nạp glucose (Impaired glucose tolerance) HbA1c Lượng glucose gắn với hemoglobin (Hemoglobin glycated) WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) GDM Đái tháo đường thai kỳ (Gestational diabetes mellitus) ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association) BN Bệnh nhân OD Mật độ quang (Optical density) BL Mẫu trắng (Blank)
DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Tiêu chuẩn xét nghiệm bệnh ĐTĐ hoặc tiền ĐTĐ ở người 4 lớn không có triệu chứng theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association) Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo ADA 2020 5 Bảng 2.1. Vị trí tra mẫu chuẩn vào khay 96 giếng 19 Bảng 3.1. OD nền khay 96 giếng 21 Bảng 3.2. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 22 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Bảng 3.3. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 23 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Bảng 3.4. Tỉ lệ 1/10, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 24 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL Bảng 3.5. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p- 25 value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/10 Bảng 3.6. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 26 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Bảng 3.7. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 27 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Bảng 3.8. Tỉ lệ 1/20, OD đo được của protein chuẩn ở dãy nồng độ 0; 28 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL Bảng 3.9. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị p- 29 value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20
Bảng 3.10. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị 32 p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL, ở tỉ lệ 1/20 Bảng 3.11. Vị trí tra mẫu protein chuẩn và mẫu thử vào khay 96 giếng 32 Bảng 3.12. OD đo được của khay 96 giếng gồm protein chuẩn và mẫu 33 BN Bảng 3.13. Xử lý OD dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL BN 34 ĐTĐ để vẽ đường chuẩn Bảng 3.14. Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính toán giá trị 34 p-value cho phương trình đường chuẩn BN ĐTĐ Bảng 3.15. OD của mẫu protein BN ĐTĐ 34 Bảng 3.16. Nồng độ protein huyết tương trong mẫu đã pha loãng 300 35 lần (μg/mL) Bảng 3.17. Nồng độ protein huyết tương trong mẫu BN ban đầu (g/L) 35 Bảng 3.18. Phần trăm độ lệch nồng độ protein đo bằng phương pháp 37 Bradford và bằng máy hóa sinh bán tự động tại BV E.
DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1. Biểu đồ biểu diễn thành phần các protein trong huyết tương 8 Hình 3.1. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 22 μg/mL Hình 3.2. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 23 960 μg/mL Hình 3.3. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 24 1920 μg/mL Hình 3.4. Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 25 μg/mL sau phương pháp kiểm định trị số P Hình 3.5. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 26 μg/mL Hình 3.6. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 27 μg/mL Hình 3.7. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 28 1920 μg/mL Hình 3.8. Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 29 μg/mL sau kiểm định trị số P Hình 3.9. Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, ở tỉ 30 lệ 1/10 sau kiểm định trị số P Hình 3.10. So sánh 2 đường chuẩn tối ưu nhất tại 2 tỉ lệ 1/10 và 1/20 30 Hình 3.11. Đường chuẩn định lượng protein huyết tương BN ĐTĐ 33
[Date] MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 Chương 1 - TỔNG QUAN .........................................................................................2 1.1. Tổng quan về Đái tháo đường ....................................................................2 1.1.1. Dịch tễ bệnh ĐTĐ ..................................................................................2 1.1.2. Khái niệm ...............................................................................................2 1.1.3. Triệu chứng và biến chứng ...................................................................3 1.1.4. Chẩn đoán ..............................................................................................3 1.1.5. Phân loại ................................................................................................6 1.2. Tổng quan về protein huyết tương người ..................................................7 1.2.1. Khái niệm về huyết tương người ...........................................................7 1.2.2. Đặc điểm, thành phần, phân loại hệ protein huyết tương người ........7 1.2.3. Chức năng của các protein trong huyết tương.....................................9 1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết tương ........................10 1.3. Tổng quan các phương pháp định lượng protein ...................................10 1.3.1. Phương pháp Western blot- Định lượng protein bằng phương pháp kháng thể ...........................................................................................................11 1.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp khối phổ ..............................11 1.3.3. Định lượng protein bằng phương pháp đo quang .................................12 1.4. Tổng quan về phương pháp Bradford .....................................................13 1.4.1. Giới thiệu chung ..................................................................................13 1.4.2. Cơ chế ...................................................................................................13 1.4.3. Thuốc thử .............................................................................................14 1.4.4. Ưu điểm và hạn chế .............................................................................14 Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................15 2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................15 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................15 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ...........................................................................16 2.1.3. Hóa chất ...............................................................................................16 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................16 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................16
2.2.1. Thu nhận mẫu máu từ bệnh nhân ......................................................16 2.2.2. Phân lập huyết tương từ mẫu máu bệnh nhân, vận chuyển, bảo quản và lưu trữ ...........................................................................................................16 2.2.3. Tối ưu hóa quy trình thử nghiệm Bradford .......................................17 2.2.4. Xác định nồng độ protein trong mẫu huyết tương bệnh nhân ĐTĐ type 2 bằng phương pháp Bradford ..................................................................20 2.3. Phương pháp xử lý số liệu. ...........................................................................21 2.4. Đạo đức nghiên cứu ......................................................................................21 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................22 3.1. Kết quả tối ưu hóa quy trình xác định hàm lượng protein trong mẫu huyết tương bằng phương pháp Bradford ........................................................22 3.2. Kết quả xác định hàm lượng protein trong mẫu huyết tương bằng phương pháp Bradford .......................................................................................33 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả đo nồng độ protein huyết tương bằng phương pháp Bradford .......................................................................................39 3.4. Một số lưu ý ...................................................................................................40 3.5. Một số hạn chế của đề tài .............................................................................41 KẾT LUẬN ..............................................................................................................42 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO
[Date] ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh không lây nhiễm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người dân trên toàn thế giới, gây những tác động lớn đến toàn thế giới ở thế kỷ XXI. Tại Việt Nam, hiện có tới 3,53 triệu người đang “chung sống” với căn bệnh ĐTĐ, và mỗi ngày có ít nhất 80 trường hợp tử vong vì các biến chứng liên quan [2, 7]. Trong đó, đa phần là ĐTĐ type 2, chiếm đến 90 – 95 % số lượng bệnh nhân mắc phải. Cùng với các tế bào máu, huyết tương đóng vai trò quan trọng trong sinh lý cơ thể. Phân tích huyết tương lâm sàng là quy trình chẩn đoán phổ biến trong y học và các dấu ấn sinh học huyết tương được sử dụng để phân loại bệnh nhân và hỗ trợ các quyết định điều trị [15]. Định lượng protein huyết tương là một bước quan trọng để xử lý các mẫu protein, phân lập và xác định đặc tính; đây là bước tiên quyết trước khi gửi protein để phân tích và phân tách sắc ký, điện di hoặc hóa miễn dịch [8, 13]. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp dùng để định lượng nồng độ protein huyết tương, trong đó, các xét nghiệm protein đo màu, chẳng hạn như xét nghiệm Bradford, xét nghiệm Lowry, xét nghiệm axit bicinchoninic và xét nghiệm biuret … được sử dụng rộng rãi. Mỗi thử nghiệm đều có những ưu điểm và nhược điểm liên quan đến độ nhạy, tính dễ thực hiện, khoảng tuyến tính, độ chính xác và sự thay đổi giữa những phòng thí nghiệm khác nhau [13]. Điểm mấu chốt là bất kỳ phương pháp nào được sử dụng để định lượng nồng độ protein thì đều cần được hiệu chuẩn thường xuyên [19]. Phương pháp Bradford phân tích protein là một phương pháp có thể thực hiện nhanh, ứng dụng được ở nhiều nơi với các hóa chất, thiết bị cơ bản, chi phí thấp, có độ nhạy cao. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2” với hai mục tiêu: 1. Xây dựng được quy trình Bradford tối ưu định lượng nồng độ protein huyết tương 2. Ứng dụng được quy trình để phân tích nồng độ protein ở các BN ĐTĐ type2 1
Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Đái tháo đường 1.1.1. Dịch tễ bệnh ĐTĐ Đái tháo đường là một bệnh không lây nhiễm đang có sự gia tăng nhanh chóng tỉ lệ mắc và các biến chứng trên toàn cầu. Trên thế giới, năm 2015, ngoài 415 triệu người (độ tuổi từ 20- 79) đang mắc bệnh đái tháo đường, có 318 triệu người trưởng thành bị rối loạn dung nạp glucose, khiến họ có nguy cơ cao mắc bệnh trong tương lai [18]. Đến năm 2019, ĐTĐ đứng thứ 3 trong tổng số 10 nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và là nguyên nhân thứ tư gây tử vong ở phụ nữ [11]. Tại Việt Nam, năm 2015, ước tính có 3,5 triệu người trưởng thành từ 20–79 tuổi mắc ĐTĐ, là nguyên nhân gây ra 53.400 ca tử vong. Các nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở người trưởng thành Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2016 là 3,7–6,0% [18]. Mỗi ngày có ít nhất 80 trường hợp tử vong vì các biến chứng liên quan ĐTĐ [2]. Dự báo, số người mắc bệnh có thể tăng lên 6,3 triệu vào năm 2045. Với những số liệu nói trên, Việt Nam được xếp nằm trong 10 quốc gia có tỷ lệ gia tăng bệnh nhân ĐTĐ cao nhất thế giới với tỷ lệ bệnh nhân tăng 5,5% mỗi năm. Tuy nhiên, theo Bộ Y tế cả nước mới có chỉ có 29% người bệnh ĐTĐ được quản lý tại các cơ sở y tế, trong khi số chưa được quản lý theo số liệu thống kê năm 2015 là 71% [2]. 1.1.2. Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) là tình trạng mạn tính xảy ra khi cơ thể sản xuất không đủ insulin hoặc không thể sử dụng insulin, và được chẩn đoán dựa vào nồng độ glucose máu. Insulin là một loại hormone được sản xuất trong tuyến tụy, có chức năng vận chuyển glucose từ máu đi vào các tế bào của cơ thể để chuyển hóa thành năng lượng. Việc thiếu hoặc hoạt động không hiệu quả của insulin ở một người bị bệnh đái tháo đường có nghĩa là glucose vẫn lưu thông trong máu nhưng không được vận chuyển vào các tế bào. Theo thời gian, nồng độ cao của glucose trong máu (được gọi là tăng đường huyết) gây ra tổn thương nhiều mô trong cơ thể, dẫn đến sự phát triển của các biến chứng sức khỏe gây tàn phế và đe dọa tính mạng [7, 18]. 2
1.1.3. Triệu chứng và biến chứng Sự tăng đường huyết mạn tính của bệnh đái tháo đường có liên quan đến tổn thương lâu dài, rối loạn chức năng và suy các cơ quan khác nhau, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu [5]. Một số quá trình có liên quan đến sự phát triển của bệnh đái tháo đường bao gồm sự phá hủy tự miễn dịch của các tế bào β tuyến tụy dẫn đến việc bài tiết insulin không đầy đủ hoặc do những bất thường dẫn đến sự kháng lại hoạt động của insulin làm giảm phản ứng của mô đối với insulin tại một hoặc nhiều điểm trong con đường hoạt động phức tạp của hormone. Hai yếu tố này thường cùng tồn tại ở cùng một bệnh nhân [5]. Sự thiếu insulin hoạt động trên các mô đích là cơ sở gây ra những bất thường trong chuyển hóa carbohydrate, chất béo và protein trong bệnh đái tháo đường. Các triệu chứng của tăng đường huyết rõ rệt bao gồm “4 nhiều”: đái nhiều, uống nhiều, ăn nhiều, gầy sút cân nhiều và mờ mắt. Hậu quả cấp tính, đe dọa tính mạng của bệnh nhân là tăng đường huyết với nhiễm toan ceton hoặc tình trạng tăng thẩm thấu do tăng glucose máu. Các biến chứng lâu dài của bệnh ĐTĐ bao gồm bệnh võng mạc với khả năng mất thị lực; bệnh thận dẫn đến suy thận; bệnh thần kinh ngoại biên với nguy cơ loét bàn chân, cắt cụt chi và khớp; và bệnh thần kinh tự trị gây ra các triệu chứng tiêu hóa, sinh dục, tim mạch và rối loạn chức năng tình dục. Bệnh nhân mắc ĐTĐ có tỷ lệ mắc bệnh tim mạch, động mạch ngoại biên và mạch máu não do xơ vữa động mạch tăng. Tăng huyết áp và các bất thường về chuyển hóa lipoprotein cũng thường thấy ở những người bệnh ĐTĐ.[5] 1.1.4. Chẩn đoán 1.1.4.1. Đối tượng nguy cơ cao “Tiền ĐTĐ” là một thuật ngữ thực tế được dùng để chỉ tình trạng rối loạn đường huyết lúc đói (Impaired Fasting Glucose), rối loạn dung nạp glucose (Impaired Glucose Tolerance) hoặc hemoglobin glycated (HbA1c) từ 6,0% đến 6,4%, mỗi loại đều khiến người bệnh có nguy cơ cao phát triển bệnh ĐTĐ và các biến chứng của bệnh [4]. 3
Nên theo dõi tình trạng cơ thể thường xuyên để sàng lọc và chẩn đoán sớm ĐTĐ. Các thử nghiệm chẩn đoán xác định ĐTĐ nên được xem xét và thực hiện ở các đối tượng sau: Bảng 1.1. Tiêu chuẩn xét nghiệm bệnh ĐTĐ hoặc tiền ĐTĐ ở người lớn không có triệu chứng theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association)[4] 1. Thử nghiệm nên được xem xét ở người thừa cân hoặc béo phì (chỉ số khối cơ thể BMI ≥25 kg / m 2 hoặc ≥23 kg / m 2 ở người Mỹ gốc Á) người lớn có một hoặc nhiều yếu tố nguy cơ sau: • Người thân cấp một như cha, mẹ, anh, chị, em ruột mắc bệnh ĐTĐ • Chủng tộc / dân tộc có nguy cơ cao (ví dụ: Người Mỹ gốc Phi, Người Latinh, Người Mỹ bản địa, Người Mỹ gốc Á, Người dân đảo Thái Bình Dương) • Tiền sử bệnh tim mạch • Tăng huyết áp (≥140/90 mmHg hoặc đang điều trị tăng huyết áp) • Mức cholesterol HDL 250 mg / dL (2,82 mmol / L) • Phụ nữ mắc hội chứng buồng trứng đa nang • Không hoạt động thể chất • Các tình trạng lâm sàng khác liên quan đến kháng insulin (ví dụ: béo phì nặng, acanthosis nigricans) 2. Bệnh nhân tiền ĐTĐ (HbA1c ≥5,7% [39 mmol / mol], IGT, hoặc IFG) nên được kiểm tra hàng năm. 3. Những phụ nữ được chẩn đoán mắc ĐTĐ thai kỳ (Gestational Diabetes Mellitus) nên làm xét nghiệm suốt đời ít nhất 3 năm một lần. 4. Đối với tất cả các bệnh nhân khác, xét nghiệm nên bắt đầu từ 45 tuổi. 5. Nếu kết quả bình thường, việc thử nghiệm nên được lặp lại tối thiểu trong khoảng thời gian 3 năm, có cân nhắc việc thử nghiệm thường xuyên hơn tùy thuộc vào kết quả ban đầu và tình trạng rủi ro. 4
1.1.4.2. Chẩn đoán xác định ĐTĐ Trừ khi có chẩn đoán lâm sàng rõ ràng (ví dụ: bệnh nhân đang trong cơn khủng hoảng tăng đường huyết hoặc có các triệu chứng cổ điển của tăng đường huyết và đường huyết tương ngẫu nhiên ≥200 mg / dL [11,1 mmol/L]), chẩn đoán yêu cầu hai kết quả xét nghiệm bất thường từ cùng một mẫu [21] hoặc trong hai mẫu thử nghiệm riêng biệt. Nếu sử dụng hai mẫu thử nghiệm riêng biệt, thì thử nghiệm thứ hai, có thể là lặp lại thử nghiệm ban đầu hoặc thử nghiệm khác, được thực hiện ngay lập tức. Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo ADA 2020 [4] 1. Đường huyết lúc đói ≥126 mg/dL (7,0 mmol/L). Bệnh nhân nhịn ăn, (không nạp calo trong ít nhất 8 giờ) * HOẶC LÀ 2. Glucose huyết tương thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống ≥200 mg/dL (11,1 mmol/L). Thử nghiệm phải được thực hiện theo mô tả của WHO, sử dụng một lượng đường chứa tương đương 75 g glucose khan hòa tan trong nước *. HOẶC LÀ 3. HbA1c ≥6,5% (48 mmol / mol) * HOẶC LÀ 4. Ở một bệnh nhân có các triệu chứng cổ điển của tăng đường huyết, glucose huyết tương ngẫu nhiên ≥200 mg/dL (11,1 mmol/L). * - Trong trường hợp không có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết (bao gồm tiểu nhiều, uống nhiều, ăn nhiều, sụt cân không rõ nguyên nhân), chẩn đoán đòi hỏi hai kết quả xét nghiệm bất thường từ cùng một mẫu hoặc trong hai mẫu xét nghiệm riêng biệt. 5
1.1.5. Phân loại Việc chẩn đoán rõ một trường hợp mắc ĐTĐ nhóm nào là một việc không dễ dàng vì có những trường hợp có sự chuyển biến, nên với nhiều bệnh nhân chỉ có thể đưa ra thông tin định nhóm ở thời điểm khám khi đó. Ví dụ như một bệnh nhân mắc ĐTĐ thai kì, sau sinh tiếp tục tăng đường huyết và có thể chuyển chẩn đoán thành ĐTĐ type 2 [4]. Phân loại ĐTĐ được Hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ (ADA) trình vào năm 1997 và được WHO phê chuẩn và sử dụng đến thời điểm này. Dựa trên cơ chế bệnh sinh, ĐTĐ được phân thành 3 thể chính: • Đái tháo đường type 1 Trước đây ĐTĐ type 1 còn được gọi với các thuật ngữ như ĐTĐ phụ thuộc insulin hoặc ĐTĐ khởi phát ở tuổi vị thành niên. Thể bệnh này chỉ chiếm 5–10% những người mắc bệnh ĐTĐ. Nó là kết quả của sự phá hủy tự miễn dịch của tế bào beta đảo tụy, do sự tương tác giữa tính nhạy cảm di truyền, miễn dịch rối loạn và các yếu tố môi trường [24]. Ở dạng bệnh ĐTĐ này, tốc độ phá hủy tế bào β khá nhanh ở các bệnh nhân ít tuổi, đặc biệt là trẻ em và thanh thiếu niên, nhiễm toan ceton có thể là biểu hiện đầu tiên của bệnh. Do tế bào beta bị phá hủy, bệnh nhân không còn hoặc còn rất ít insulin, vì vậy, sử dụng insulin là điều trị bắt buộc. • Đái tháo đường type 2 ĐTĐ type 2 chiếm 90–95% những người mắc bệnh ĐTĐ, trước đây được gọi là bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin hoặc bệnh ĐTĐ khởi phát ở người lớn. Thể bệnh này và các biến chứng của bệnh là những ví dụ điển hình về các bệnh đa nguyên và phức tạp do sự tương tác giữa nhiều yếu tố di truyền và môi trường [24]. Những người bệnh không xảy ra sự phá hủy tự miễn dịch của tế bào β mà họ thiếu insulin tương đối và tình trạng đề kháng insulin. Do đó, sự bài tiết insulin bị khiếm khuyết ở những bệnh nhân này và không đủ để bù đắp cho tình trạng kháng insulin. Tình trạng kháng insulin có thể cải thiện khi giảm cân và / hoặc điều trị bằng thuốc làm giảm đề kháng insulin nhưng hiếm khi được phục hồi trở lại bình thường. • Đái tháo đường thai kỳ (GDM) GDM đã được định nghĩa là bất kỳ mức độ không dung nạp glucose nào khi khởi phát hoặc ghi nhận đầu tiên trong thời kỳ mang thai. Định nghĩa được áp dụng cho dù tình trạng này có kéo dài sau khi mang thai hay không và không loại trừ khả 6
năng không dung nạp glucose không được phát hiện có thể đã xảy ra trước hoặc bắt đầu đồng thời với thời kỳ mang thai. 1.2. Tổng quan về protein huyết tương người 1.2.1. Khái niệm về huyết tương người Máu là một mô lỏng bao gồm khoảng 55% chất lỏng được gọi là huyết tương và 45% tế bào máu. Ba loại tế bào chính trong máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. 92% huyết tương bao gồm nước và 8% còn lại bao gồm protein, chất chuyển hóa và ion. Huyết tương của người khỏe mạnh thường là dịch màu vàng nhạt, trong suốt và thay đổi theo tình trạng sinh lý trong cơ thể, ví dụ như sau khi ăn, huyết tương có màu vàng đậm hơn và sẽ nhạt đi thành vàng chanh sau khoảng vài giờ sau đó. Cùng với các tế bào máu, huyết tương đóng vai trò quan trọng trong sinh lý cơ thể. Phân tích huyết tương lâm sàng là quy trình chẩn đoán phổ biến trong y học và các dấu ấn sinh học huyết tương được sử dụng để phân loại bệnh nhân và hỗ trợ các quyết định điều trị [15]. Huyết tương có thể được tách ra khỏi máu toàn phần bằng quá trình ly tâm, tức là quay máu toàn phần với chất chống đông máu trong máy ly tâm. Huyết tương nhẹ hơn, vì vậy nó tạo thành lớp màu vàng phía trên, trong khi các tế bào máu dày đặc hơn rơi xuống phía dưới. Huyết tương thu được được đông lạnh trong vòng 24 giờ để bảo tồn chức năng của các yếu tố đông máu và các globulin miễn dịch. Huyết tương được rã đông trước khi sử dụng và có thời hạn sử dụng 1 năm [15]. Thành phần huyết tương thường bao gồm: • Chất đông máu, chủ yếu là fibrinogen, hỗ trợ quá trình đông máu • Các protein huyết tương, chẳng hạn như albumin và globulin, giúp duy trì áp suất thẩm thấu keo ở khoảng 25 mmHg • Các chất điện giải như natri, kali, bicarbonat, clorua và canxi giúp duy trì độ pH trong máu • Các globulin miễn dịch giúp chống lại nhiễm trùng và các lượng nhỏ khác nhau của các enzym, hormone và vitamin 1.2.2. Đặc điểm, thành phần, phân loại hệ protein huyết tương người Protein huyết tương đại diện cho một phần quan trọng của proteome người. Nồng độ protein trong huyết tương người bình thường rơi vào khoảng 60-70 g/L. Người ta ước tính rằng huyết tương có thể chứa tới 40.000 loại protein khác nhau, 7
mỗi loại có một chức năng hoặc một bộ chức năng cụ thể, mỗi loại nằm dưới sự kiểm soát di truyền riêng biệt và mỗi loại có sự thay đổi nồng độ cụ thể trong các điều kiện sinh lý và bệnh lý khác nhau. Nồng độ bình thường của protein huyết tương bao gồm một phạm vi rất rộng từ vài microgam đến vài gam trên 100 mL huyết tương. Các protein huyết tương có chức năng như các enzym, chất ức chế proteinase, kháng thể, yếu tố đông máu, thành phần bổ thể, tiền chất kinin và các chất vận chuyển hormone, vitamin, kim loại, lipid và các chất khác cần thiết cho chức năng bình thường của cơ thể [3]. Trong đó, một số protein hàm lượng cao chiếm đến 99% protein tổng số như Albumin, IgG, transferrin, lipoprotein… Hình 1.1. Biểu đồ biểu diễn thành phần các protein trong huyết tương [22] Các protein cấu thành nên hệ protein huyết tương có thể được phân loại theo chức năng thành ba lớp khác nhau. • Lớp đầu tiên chứa nhiều protein có vai trò chức năng trong máu. Chúng bao gồm albumin huyết tương người (chiếm khoảng một nửa protein tổng số); apolipoprotein, có vai trò quan trọng trong vận chuyển lipid và cân bằng nội môi; các protein giai đoạn cấp tính của phản ứng miễn dịch bẩm sinh; và các protein đông máu. • Lớp thứ hai là các protein rò rỉ mô không có chức năng chuyên dụng trong tuần hoàn. Ví dụ như các enzym như aspartate aminotransferase (ASAT) và alanin aminotransferase (ALAT), được sử dụng để chẩn đoán các bệnh gan, hay troponin tim. 8
• Lớp thứ ba là các phân tử tín hiệu như hormone protein nhỏ (ví dụ, insulin) và cytokine, thường có lượng rất thấp ở trạng thái ổn định và được điều chỉnh khi cần thiết [12] 1.2.3. Chức năng của các protein trong huyết tương Các protein trong huyết tương đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh lý và bệnh lý xảy ra trong cơ thể người [15]. Dưới đây là một số chức năng tiêu biểu: • Chức năng miễn dịch: bao gồm các Ig và các bổ thể tham gia vào các quá trình bảo vệ cơ thể như thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên, giúp hệ miễn dịch nhận biết và tiêu diệt các tác nhân lạ như vi khuẩn hoặc virus… • Cung cấp dinh dưỡng: Protein huyết tương là nguồn chính cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể khi được yêu cầu. • Chức năng xúc tác: Enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh học từ đơn giản đến phức tạp trong các quá trình sinh lý và bệnh lý của cơ thể • Chức năng điều hòa: Những protein này tuy có hàm lượng nhỏ, nhưng chúng vai trò rất quan trọng trong cơ thể, bao gồm các hormone, các cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme… Nhìn chung, các protein này có thời gian lưu hành trong huyết tương khá ngắn. Chúng được tiết ra để điều hòa các phản ứng, sau đó được pha loãng để làm giảm nồng độ xuống mức hoạt động không hiệu quả. • Áp suất thẩm thấu và cân bằng nước: Protein huyết tương giúp cân bằng áp suất thẩm thấu vào khoảng 25 mm Hg. Albumin huyết tương chủ yếu chịu trách nhiệm cho chức năng này vì trọng lượng phân tử thấp và lượng định lượng so với các protein khác. Tuy nhiên, trong tình trạng mất protein như trong các bệnh thận, một tỷ lệ lớn nước di chuyển đến các mô có thể gây ra phù. • Chức năng đệm: Protein huyết tương đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì độ pH của cơ thể, bằng cách thực hiện quá trình asampholytes. • Vận chuyển lipid: Một trong những chức năng quan trọng nhất của protein huyết tương là cung cấp lipid và các chất hòa tan lipid trong cơ thể. Các axit béo và bilirubin được vận chuyển chủ yếu bởi albumin, trong khi cholesterol và phospholipids được chuyển bởi các lipoprotein, globulin cũng vận chuyển các vitamin tan trong chất béo. 9
• Vận chuyển các muối phức hợp khác: Protein huyết tương cũng giúp vận chuyển các kim loại và các chất khác, ví dụ như thyroxine, v.v. Ngoài ra, trong huyết tương còn có các sản phẩm rò rỉ mô: Đây là những protein thường hoạt động trong các tế bào nhưng có thể được giải phóng vào huyết tương do hậu quả của sự chết hoặc tổn thương mô. Những protein này là những dấu hiệu chẩn đoán quan trọng nhất, được ứng dụng rất nhiều trong y học chẩn đoán và theo dõi điều trị, ví dụ như creatine kinase hoặc myoglobin được sử dụng trong chẩn đoán nhồi máu cơ tim 1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết tương Protein là cỗ máy phân tử chịu trách nhiệm thực hiện hầu hết các chức năng xúc tác và cấu trúc, cũng như nhiều tín hiệu của cơ thể sống. Do đó, phép đo protein mang lại nhiều cơ hội để phát hiện và xác định đặc điểm của các trục trặc phân tử liên quan đến bệnh tật và sự tiến triển của nó như biểu hiện ở từng bệnh nhân. Do máu và huyết tương là những mẫu bệnh phẩm lâm sàng chiếm ưu thế áp đảo để phân tích phân tử thường quy, các phân tử hiện diện trong máu có tiềm năng chẩn đoán rộng nhất. Trong đó, protein thường có ý nghĩa lâm sàng lớn nhất. Protein cung cấp một bức tranh toàn cảnh về tình trạng hiện tại của bệnh nhân. Các xét nghiệm protein hiện tại cung cấp nhiều thông tin lâm sàng, bao gồm chẩn đoán xác định các biến cố cấp tính. Ví dụ: troponin tim được giải phóng vào máu sau nhồi máu cơ tim, dự đoán nguy cơ bệnh tật (Protein phản ứng C (CRP) tăng trong bệnh mạch vành) và phát hiện bệnh tái phát (thyroglobulin trong ung thư tuyến giáp di căn sau khi cắt bỏ tuyến giáp) [6] Những thành công này đã làm dấy lên hy vọng về các xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng mới và cải tiến cho nhiều chỉ định bệnh và do đó, đã góp phần khẳng định ý nghĩa của việc nghiên cứu, phát hiện ra các dấu ấn sinh học protein huyết tương mới. 1.3. Tổng quan các phương pháp định lượng protein Có nhiều phương pháp để định lượng hàm lượng protein trong mẫu. Trên thực tế một phương pháp với ưu điểm tuyệt đối không tồn tại: các phương pháp sẽ đều có ưu điểm và nhược điểm. Việc lựa chọn một phương pháp thích hợp sẽ phụ thuộc vào bản chất của protein có trong mẫu, vào độ tinh khiết của dịch chiết, vào độ nhạy và độ chính xác cần thiết và tốc độ mong muốn. Các phương pháp thường 10