Kỹ thuật chuyển gen

Chia sẻ: Lê Thanh Hưng | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

140
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật chuyển gen

KỸ THUẬT CHUYỂN GEN WEDNESDAY, 12. MARCH 2008, 11:25 BIẾN ĐỔI GEN Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của các cơ thế chuyển gen. Ngày nay việc ứng dụng các giống cây trồng và cật nuôi chuyển gen càng trở nên phổ biến. Người ta ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng hơn một nửa đậu tương và khoảng một phần ba ngũ cốc được trồng từ những hạt giống có chuyển gen. Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. 1. Chuyển gen trực tiếp bao gồm các phương pháp sau: - Kỹ thuật siêu âm - Kỹ thuật điện xung - Kỹ thuật PEG - Kỹ thuật vi tiêm - Kỹ thuật bắn gen - Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt 2. Chuyển gen gián tiếp - Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens - Chuyển gen nhờ virus và phage Sau đây là chi tiết một số phương pháp: PEG Mediated Transformation of Arabidopsis thaliana (var. Columbia O and Landsberg) Cell Suspensions Protoplasts 1. Use cells 3 day after sub cultivation 2. Split the cells in 1 tube (10 ml), spin the cells at 400 g for 5 min. 3. Wash once with wall digestion buffer without enzymes (10 ml). 4. Re-suspend pellet in digestion solution (7 ml) and dispense into a Petri dish. 5. Incubate at 26°C in the dark for 6 hours shaking at 50 rpm. 6. Collect protoplasts in 1 tube by centrifugation at 100 g for 5 min. 7. Wash once in wall digestion solution without enzymes (10 ml). 8. Centrifuge 100 g for 5 min 9. Remove supernatant and dissolve pellet in remaining solution, add slowly 10 ml W5 solution, mix gently and centrifuge 100 g for 5 min 10. Resuspend pellets in 10 ml of W5 solution, take aliquot for counting, store 20 min in the dark
at 4°C. For protoplasts use always cut tips. 11. Centrifuge 100 g for 5 min, remove all of W5 solution, resuspend pellet in MMM solution to a density of 1-2 x 106 pps/ml. 12. Redistribute l), add very g/ g of plasmid DNA (about 1 l into tubes, add 30 samples of 250 l PEG solution, mix gently and incubate 15-30 min. slowly 250 13. Gradually add 10 ml of W5 solution; this needs to be done very slowly. 14. Centrifuge 100 g 5 min, 4°C. 15. Dissolve pellet in 1,6 ml of K3 solution. 16. Incubate at 26°C in the dark for 20 hours. Reference: Negrutiu, I., Shillito,R.D., Potrykus, I., Biasini,G. and Sala,F. Hybrid genes in the analysis of transformation conditions I. Setting up a simple method for direct gene transfer in plant protoplasts. Plant Mol. Biol., 8, 363-373, 1987. Solutions: • Wall digestion solution: for 15 ml: 1% Cellulase 0,150 g 0,25% Macerozym 0,037 g 8 mM CaCl2 (8 mM CaCl2 • 2H2O) 0,013 g (0,018 g) 0,4 M Mannitol 1,093 g pH = 5,5 steril filtrate • Wall digestion solution without enzymes: for 40 ml: 8 mM CaCl2 • 2H2O 0,048 g 0,4 M Mannitol 2,910 g pH = 5,5 steril filtrate • W5 solution for 1 liter: 154 mM NaCl 8,900 g 125 mM CaCl2
(125 mM CaCl2 • 2H2O) 13,873 g (= 18,377 g) 5 mM KCl 0,373 g 5 mM Glucose 0,990 g pH = 5.8 - 6.0 autoclave • MMM solution for 0.5 liter: 15 mM MgCl2 • 6H2O = 1,524 g 0.1% MES = 0,500 g 0.5 M Mannitol = 46,042 g pH = 5,8 autoclave • PEG solution for 100 ml: 40% PEG 4000 = 40 g 0.4M Mannitol = 7,285 g 0.1 M Ca(NO3)2• 4H2O = 2,361 g pH = 8 – 9 with 1-2 drops KOH 1N (the pH needs 1-2 hours to stabilize) autoclave frozen in 1 ml aliquots • K3 solution for 100 ml: 10 ml macro stock + 0,1 ml micro stock + 0,1 ml vitamins stock + 0,5 ml EDTA stock + 1 ml Ca-Phosphate stock + 10 mg Myo-Inositol + 25 mg D(+)-Xylose + 13,7 g Sucrose pH = 5,6 filter sterile and frozen in 10 ml aliquots for 1 liter macro stock: 1,5 g NaH2PO4 • H2O 9,0 g CaCl2 • 2H2O 25 g KNO3 2,5 g NH4NO3
1,34 g (NH4) 2SO4 2,5 g MgSO4 • 7H2O add H2O up 1 liter autoclave for 100 ml micro stock: 75 mg KI 300 mg H3BO3 1 g MnSO4 • 7H2O (0,6 g MnSO4 • H2O) 200 mg ZnSO4 • 7H2O 25 mg Na2MoO4 • 2H2O 2,5 mg CuSO4 • 5H2O 2,5 mg CoCl2 • 6H2O add H2O up 100 ml filtrate sterile and freeze for 100 ml vitamins stock: 100 mg Nicotinacid 100 mg Pyridoxin • HCl 1 g Thiamin • HCl add H2O up 100 ml filtrate sterile and freeze for 1 liter EDTA stock: 7,46 g EDTA solve in 300 ml H2O (gently warm to dissolve) 5,56 g Fe(II)SO4 • 7H2O solve in 300 ml H2O (gently warm to dissolve) mix and add H2O up 1 liter autoclave and keep in the dark for 200 ml Ca-Phosphate stock: 1,26 g CaHPO4 • 2H2O solve in H2O add H2O up 200 ml pH = 3 with 25% HCl autoclave and keep in the dark DNA extraction : 96 well plate protocol
Phenol / Chloroform / IAA protocol Solutions 1. 5% CTAB / Phosphate buffer (120mM pH 8.0) a. make 10% CTAB in 0.7M NaCl (heat to dissolve) b. make 240mM phosphate biffer pH 8.0 c. mix 50/50 of the above two solutions d. autoclave 2. Phenol pH 8.0 (P in the protocol) 3. Chloroform / Isoamyl alcohol (24 : 1) (C/I in the protocol) 4. 30% PEG in 1.6M NaCl (autoclave) 5. Cold 70% ethanol 6. Sterile ultrapure water or TE buffer pH 7-8 (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) Protocol 1. 5% CTAB / Phosphate buffer (120mM pH 8.0) a. make 10% CTAB in 0.7M NaCl (heat to dissolve) b. make 240mM phosphate biffer pH 8.0 c. mix 50/50 of the above two solutions d. autoclave 2. Phenol pH 8.0 (P in the protocol) 3. Chloroform / Isoamyl alcohol (24 : 1) (C/I in the protocol) 4. 30% PEG in 1.6M NaCl (autoclave) 5. Cold 70% ethanol 6. Sterile ultrapure water or TE buffer pH 7-8 (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) 1. Weigh 0.5g of soil and mix with 1g of glass beads (0.5g of 106μm and 0.5g of 500μm) in a 2ml deep-well plate 2. Add 0.5ml of CTAB buffer 3. Add 0.25ml of P and 0.25 ml of C / I 4. Seal the plate tightly * 5. Place the plate in the Minibeadbeater and lyse for 3 minutes 6. Cool on ice 7. Centrifuge for 10 minutes, full speed (full speed for deepwell plates depends on the centrifuge used, might be around 3000 rpm), 4°C 8. Extract top aqueous layer to a new plate ** 9. Add an equal volume of C / I and vortex to form an emulsion 10. Centrifuge for 10 minutes, full speed, 4°C 11. Extract the top layer to a new plate again** 12. Precipitate DNA by adding two volumes of 30% PEG and mix well (sodium acetate + ethanol or isopropanol could be used)
13. Leave at least 2h at +4°C 14. Centrifuge for 10 minutes, full speed, 4°C 15. Pour off supernatant (I flip the plate over) and wash the pellet with cold 70% ethanol 16. Centrifuge for 10 minutes, full speed, 4°C 17. Remove carefully all ethanol traces and let air dry 18. Resuspend pellet in 30 μl of water or TE (put 5 minutes at 55°C to help dissolution) 19. Keep at -20°C until used * always seal the plate tightly for vortex and centrifugation steps in order to avoid crosscontamination **for steps 8 and 11, I assumed that the supernatant volume is constant and between 0.3- 0.5ml ( I set up the volume on a multichannel pipette and collect the top layer) Another protocol that may be adapted to your needs is well described at this website : http://bioplasticscollaborative.coafes.umn.edu/uniplate_dna_extraction.htm