K THU T CHUY N GENỸ Ậ Ể
WEDNESDAY, 12. MARCH 2008, 11:25
BI N ĐI GENẾ Ổ
Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạn DNA, RNA) vào tế bào vật
chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và
tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein
đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của các cơ
thế chuyển gen. Ngày nay việc ứng dụng các giống cây trồng và cật nuôi chuyển gen càng trở
nên phổ biến. Người ta ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng hơn một
nửa đậu tương và khoảng một phần ba ngũ cốc được trồng từ những hạt giống có chuyển gen.
Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp.
1. Chuyển gen trực tiếp bao gồm các phương pháp sau:
- Kỹ thuật siêu âm
- Kỹ thuật điện xung
- Kỹ thuật PEG
- Kỹ thuật vi tiêm
- Kỹ thuật bắn gen
- Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt
2. Chuyển gen gián tiếp
- Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens
- Chuyển gen nhờ virus và phage
Sau đây là chi tiết một số phương pháp:
PEG Mediated Transformation of
Arabidopsis thaliana (var. Columbia O and Landsberg) Cell Suspensions Protoplasts
1. Use cells 3 day after sub cultivation
2. Split the cells in 1 tube (10 ml), spin the cells at 400 g for 5 min.
3. Wash once with wall digestion buffer without enzymes (10 ml).
4. Re-suspend pellet in digestion solution (7 ml) and dispense into a Petri dish.
5. Incubate at 26°C in the dark for 6 hours shaking at 50 rpm.
6. Collect protoplasts in 1 tube by centrifugation at 100 g for 5 min.
7. Wash once in wall digestion solution without enzymes (10 ml).
8. Centrifuge 100 g for 5 min
9. Remove supernatant and dissolve pellet in remaining solution, add slowly 10 ml W5 solution,
mix gently and centrifuge 100 g for 5 min
10. Resuspend pellets in 10 ml of W5 solution, take aliquot for counting, store 20 min in the dark
at 4°C. For protoplasts use always cut tips.
11. Centrifuge 100 g for 5 min, remove all of W5 solution, resuspend pellet in MMM solution to a
density of 1-2 x 106 pps/ml.
12. Redistribute l), add veryg/g of plasmid DNA (about 1 l into tubes, add 30 samples of 250
l PEG solution, mix gently and incubate 15-30 min.slowly 250
13. Gradually add 10 ml of W5 solution; this needs to be done very slowly.
14. Centrifuge 100 g 5 min, 4°C.
15. Dissolve pellet in 1,6 ml of K3 solution.
16. Incubate at 26°C in the dark for 20 hours.
Reference:
Negrutiu, I., Shillito,R.D., Potrykus, I., Biasini,G. and Sala,F. Hybrid genes in the analysis of
transformation conditions I. Setting up a simple method for direct gene transfer in plant
protoplasts. Plant Mol. Biol., 8, 363-373, 1987.
Solutions:
• Wall digestion solution:
for 15 ml:
1% Cellulase 0,150 g
0,25% Macerozym 0,037 g
8 mM CaCl2
(8 mM CaCl2 • 2H2O) 0,013 g
(0,018 g)
0,4 M Mannitol 1,093 g
pH = 5,5
steril filtrate
• Wall digestion solution without enzymes:
for 40 ml:
8 mM CaCl2 • 2H2O 0,048 g
0,4 M Mannitol 2,910 g
pH = 5,5
steril filtrate
• W5 solution
for 1 liter:
154 mM NaCl 8,900 g
125 mM CaCl2
(125 mM CaCl2 • 2H2O) 13,873 g
(= 18,377 g)
5 mM KCl 0,373 g
5 mM Glucose 0,990 g
pH = 5.8 - 6.0
autoclave
• MMM solution for 0.5 liter:
15 mM MgCl2 • 6H2O = 1,524 g
0.1% MES = 0,500 g
0.5 M Mannitol = 46,042 g
pH = 5,8
autoclave
• PEG solution for 100 ml:
40% PEG 4000 = 40 g
0.4M Mannitol = 7,285 g
0.1 M Ca(NO3)2• 4H2O = 2,361 g
pH = 8 – 9 with 1-2 drops KOH 1N (the pH needs 1-2 hours to stabilize)
autoclave
frozen in 1 ml aliquots
• K3 solution
for 100 ml:
10 ml macro stock
+ 0,1 ml micro stock
+ 0,1 ml vitamins stock
+ 0,5 ml EDTA stock + 1 ml Ca-Phosphate stock
+ 10 mg Myo-Inositol
+ 25 mg D(+)-Xylose
+ 13,7 g Sucrose
pH = 5,6
filter sterile and frozen in 10 ml aliquots
for 1 liter macro stock:
1,5 g NaH2PO4 • H2O
9,0 g CaCl2 • 2H2O
25 g KNO3
2,5 g NH4NO3
1,34 g (NH4) 2SO4
2,5 g MgSO4 • 7H2O
add H2O up 1 liter
autoclave
for 100 ml micro stock:
75 mg KI
300 mg H3BO3
1 g MnSO4 • 7H2O (0,6 g MnSO4 • H2O)
200 mg ZnSO4 • 7H2O
25 mg Na2MoO4 • 2H2O
2,5 mg CuSO4 • 5H2O
2,5 mg CoCl2 • 6H2O
add H2O up 100 ml
filtrate sterile and freeze
for 100 ml vitamins stock:
100 mg Nicotinacid
100 mg Pyridoxin • HCl
1 g Thiamin • HCl
add H2O up 100 ml
filtrate sterile and freeze
for 1 liter EDTA stock:
7,46 g EDTA solve in 300 ml H2O (gently warm to dissolve)
5,56 g Fe(II)SO4 • 7H2O solve in 300 ml H2O (gently warm to dissolve)
mix and add H2O up 1 liter
autoclave and keep in the dark
for 200 ml Ca-Phosphate stock:
1,26 g CaHPO4 • 2H2O solve in H2O
add H2O up 200 ml
pH = 3 with 25% HCl
autoclave and keep in the dark
DNA extraction : 96 well plate protocol
Phenol / Chloroform / IAA protocol
Solutions
1. 5% CTAB / Phosphate buffer (120mM pH 8.0)
a. make 10% CTAB in 0.7M NaCl (heat to dissolve)
b. make 240mM phosphate biffer pH 8.0
c. mix 50/50 of the above two solutions
d. autoclave
2. Phenol pH 8.0 (P in the protocol)
3. Chloroform / Isoamyl alcohol (24 : 1) (C/I in the protocol)
4. 30% PEG in 1.6M NaCl (autoclave)
5. Cold 70% ethanol
6. Sterile ultrapure water or TE buffer pH 7-8 (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)
Protocol
1. 5% CTAB / Phosphate buffer (120mM pH 8.0)
a. make 10% CTAB in 0.7M NaCl (heat to dissolve)
b. make 240mM phosphate biffer pH 8.0
c. mix 50/50 of the above two solutions
d. autoclave
2. Phenol pH 8.0 (P in the protocol)
3. Chloroform / Isoamyl alcohol (24 : 1) (C/I in the protocol)
4. 30% PEG in 1.6M NaCl (autoclave)
5. Cold 70% ethanol
6. Sterile ultrapure water or TE buffer pH 7-8 (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)
1. Weigh 0.5g of soil and mix with 1g of glass beads (0.5g of 106μm and 0.5g of
500μm) in a 2ml deep-well plate
2. Add 0.5ml of CTAB buffer
3. Add 0.25ml of P and 0.25 ml of C / I
4. Seal the plate tightly *
5. Place the plate in the Minibeadbeater and lyse for 3 minutes
6. Cool on ice
7. Centrifuge for 10 minutes, full speed (full speed for deepwell plates depends on the
centrifuge used, might be around 3000 rpm), 4°C
8. Extract top aqueous layer to a new plate **
9. Add an equal volume of C / I and vortex to form an emulsion
10. Centrifuge for 10 minutes, full speed, 4°C
11. Extract the top layer to a new plate again**
12. Precipitate DNA by adding two volumes of 30% PEG and mix well (sodium acetate +
ethanol or isopropanol could be used)