Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Chọn tạo các dòng đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng đột biến EMS trên hai giống ĐX208 và Taichung

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:209

Thêm vào BST

Báo xấu

67
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là tạo ra được nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác chọn tạo giống đậu xanh. Chọn tạo được từ 2-4 dòng đậu xanh đột biến ngắn ngày, có kiểu trái chín đồng loạt với năng suất cao hơn hoặc tương đương so với giống gốc, ít nhiễm giòi đục thân và bệnh đốm lá.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Chọn tạo các dòng đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng đột biến EMS trên hai giống ĐX208 và Taichung

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP TRẦN THỊ THANH THỦY CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU XANH (Vigna radiata L.) BẰNG ĐỘT BIẾN EMS TRÊN HAI GIỐNG ĐX208 VÀ TAICHUNG LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ NGÀNH 9620110 2019
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP TRẦN THỊ THANH THỦY CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU XANH (Vigna radiata L.) BẰNG ĐỘT BIẾN EMS TRÊN HAI GIỐNG ĐX208 VÀ TAICHUNG LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ NGÀNH 9620110 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS. TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN 2019
LỜI CẢM TẠ Trong quá trình thực hiện luận án “Chọn tạo các dòng đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng đột biến EMS trên hai giống ĐX208 và Taichung” tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô cùng bạn bè đồng nghiệp. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng đến PGs.TS. Trương Trọng Ngôn, thầy đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện cũng như hoàn chỉnh luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Phước Đằng, thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận án. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Khoa Sau Đại học, Quý thầy cô Bộ môn Di truyền và Chọn giống Cây trồng, Bộ môn Khoa học Cây trồng, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt công trình nghiên cứu này. Ngoài ra, tôi cũng không quên gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Huỳnh Kỳ - Trưởng Phòng Thí nghiệm Di truyền Chọn giống, ThS. Nguyễn Châu Thanh Tùng - Trưởng Phòng thí nghiệm Chọn giống và Ứng dụng Công nghệ Sinh học đã cung cấp nhiều kiến thức bổ ích, để tôi có thể thực hiện quá trình SSR-PCR, cũng như trong việc thiết kế mồi giải trình tự gen. Em Lâm Thị Trúc Linh, Trần Thanh Cao, Nguyễn Thị Diễm, Đặng Thị Xuân, Nguyễn Hoàng Tính, Văn Quốc Giang và các em sinh viên thực tập tốt nghiệp ngành Nông học và chuyên ngành Công nghệ giống cây trồng từ khóa 35 đến khóa 40 đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm. Sau cùng là lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn động viên khích lệ, tạo điều kiện về thời gian và công sức để tôi hoàn thành tốt luận án tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 24 tháng 04 năm 2019 Tác giả Trần Thị Thanh Thủy i
TÓM TẮT Chọn tạo giống đậu xanh bằng phương pháp đột biến bởi hóa chất Ethyl Methane Sulphonate đã được áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới. Việc lựa chọn và phát triển các đột biến thành các giống triển vọng được đề xuất cho nông dân đã được thực hiện thành công trên nhiều quốc gia, tuy nhiên ở Việt Nam vẫn còn ít thông tin. Nghiên cứu được thực hiện nhằm tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn giống đậu xanh và chọn được từ 2 đến 4 dòng đậu xanh đột biến ngắn ngày, năng suất cao, trái chín đồng loạt ở M6. Luận án được tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017 tại Trường Đại học Cần Thơ và Công ty Sinh Hóa Phù Sa. Các thí nghiệm ngoài đồng (M2-M6) được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố, 3 lần lặp lại, khoảng cách gieo 45x20 cm, 2 cây/hốc, sử dụng công thức phân 60N-60P2O5-40K2O. Nội dung nghiên cứu bao gồm (i) Gây tạo đột biến bởi ethyl methane sulphonate (EMS) lên giống ĐX208 và Taichung; (ii) Xác định hiệu quả, hiệu suất đột biến ở M1; (iii) Đánh giá các biến dị hình thái, nông học và chọn dòng đột biến tốt ở M2, M3; (iv) Khảo nghiệm sơ khởi năng suất 32 dòng đậu xanh đột biến ở M4, M5; (v) Khảo nghiệm năng suất, thành phần năng suất và kiểu chín đồng loạt của 33 dòng đậu xanh đột biến ở M6; (vi) Phân tích gen liên quan đến tính trạng khối lượng 1.000 hạt và ngày trổ hoa của các dòng đột biến ở M6 bằng dấu SSR và dấu SNPs. Kết quả đã (1) tạo được nguồn vật liệu đột biến có tiềm năng năng suất cao; (2) Chọn được 11 dòng đậu xanh đột biến ở M6 (ĐX8-1-28-8B, ĐX6-5-1-10, ĐX4A-3-3-1, ĐX2-1-26-5, TC8-4-3-5B, TC8-1-20-3, TC6-6-15-8, TC6-6-24-4, TC6-3-13-8, TC4-6-10-1, TC4-1-12-10). Các dòng này có thời gian sinh trưởng ngắn (56-62 ngày), trái chín đồng loạt, năng suất cao (2,99 – 3,39 tấn/ha); (3) Ba mươi ba dòng đột biến ở M6 đều mang kiểu gen đồng hợp và kiểu gen giữa các dòng đột biến này đã thay đổi so với giống gốc (ĐX208, Taichung tương ứng) ở tính trạng khối lượng 1.000 hạt và ngày trổ hoa; (4) Trình tự gen giữa 6 dòng đậu xanh đột biến và 2 giống gốc đều khác nhau, dòng ĐX8-1-28-8B, ĐX6-6-28- 14, TC8-4-3-5B và TC2-1-33-11 khác biệt về mặt di truyền nhất so với giống ĐX208 và Taichung tương ứng; (5) Số trái trên cây, năng suất hạt/cây (g) và chiều cao cây (cm) ở M3 được kiểm soát bởi gen cộng tính, do đó có thể áp dụng bất kỳ phương pháp chọn lọc nào cũng có thể cải thiện được các tính trạng này; (6) Xử lý EMS ở nồng độ 0,2% EMS cho hiệu quả gây đột biến cao ở cả 2 giống ĐX208 và Taichung. Tuy nhiên, hiệu suất gây đột biến cao trên giống ĐX208 là 0,4% EMS và ở nồng độ 0,8% EMS ở giống Taichung. Từ khóa: hình thái học, đậu xanh, đột biến, quần thể, chín đồng loạt ii
ABSTRACT Breeding mungbean variety by Ethyl Methane Sulphonate (EMS) induced mutation has been doing research over the world. Selection and development mutants for new variety were proposed and sucessful in many countries; however, there is few this information in Viet Nam. This study was conducted with the aim to make the material source for the mungbean improvement and to breed from 2 to 4 mutant mungbean lines with short maturity duration, high yielding and synchronous pod maturity. The dissertation was carried out from 2013 to 2017 at Can Tho University and Phu Sa Biotech Company. The experiments in the field from M2-M6 were arranged in a randomized complete block design (RCBD), one factor, 3 replications, spacing of 45x20 cm, 2 plants per hill. The applied fertilizer was 60N-60P2O5-40K2O. The researches contents include (i) inducing mutations by EMS on two DX208 and Taichung varieties; (ii) Determining of mutagenic effectiveness and efficiency in M1 populations; (iii) Evaluating morphological and agronomic traits variations, selecting good mutant lines in M2 and M3; (iv) Preliminary seed yield trial of 32 selected mungbean lines in M4, M5 generations; (v) Assay of seed yield, yield components and synchronous pod maturity in 33 mungbean mutant lines at M6 generation; (vi) Genotyping analysis related to 1,000-seed weight and flowering dates of the elite mutant lines in M6 generation by Simple Sequence Repeat (SSR) and Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) markers. The results revealed that (i) a mutant source of precious materials with high yield potential was created; (2) there were 11 selected mutant mungbean lines in M6 (DX8-1-28-8B, DX6-5-1-10, DX4A-3-3-1, DX2-4-2-5, TC8-4-3-3, TC6-1-20-3, TC6-6-15-8, TC6-6-24-4, TC6-3-13-8, TC4 -6-10-1, TC4-1-12-10) with a short days to maturity (56-62 days), synchronous pod maturity, high yield (2.99 - 3.39 ton ha-1); (3) Thirty-three mutant mungbean lines in M6 are homozygous lines and the genotypes of these mutant lines have changed from the original varieties (DX208, Taichung); (4) It was determined that the gene sequencing of the 6 mutant mungbean lines differing from those of the original varieties, respectively; of which the DX8-1-28-8B, DX6-6-28-14, TC8-4-3-5B and TC2-1-33-11 lines have the most genetic differences; (5) The number of pods per plant, the seed yield per plant (g) and the plant height (cm) in M3 are controlled by the additive genes, therefore, these selective methods can be applie; (6) A concentration of 0.2% EMS resulted in high mutagenic effectiveness in the DX208 and Taichung varieties. However, the high mutagenic efficiency of the DX208 variety was 0.4% EMS and 0.8% EMS Taichung variety. Keywords: morphology, mungbean, mutan, population, synchrony iii
CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn của PGS.TS Trương Trọng Ngôn. Các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Ngày 24 tháng 04 năm 2019 Ngƣời hƣớng dẫn Nghiên cứu sinh Trần Thị Thanh Thủy iv
MỤC LỤC Lời cảm tạ ........................................................................................................... i Tóm tắt ............................................................................................................... ii Abstract ............................................................................................................. iii Mục lục .............................................................................................................. v Danh sách bảng .................................................................................................. x Danh sách hình ............................................................................................... xiii Danh mục từ viết tắt ........................................................................................ xv Chƣơng 1: Giới thiệu ....................................................................................... 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 2 1.2.1 Mục tiêu ............................................................................................ 2 1.2.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 3 1.4 Thời gian thực hiện ...................................................................................... 4 1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án .................................................. 4 1.5.1 Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 4 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................. 4 1.6 Những điểm mới của luận án ....................................................................... 4 Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu ......................................................................... 6 2.1 Nguồn gốc, phân loại và bộ gen cây đậu xanh ............................................ 6 2.1.1 Nguồn gốc ......................................................................................... 6 2.1.2 Phân loại thực vật ............................................................................. 6 2.1.3 Bộ gen cây đậu xanh ......................................................................... 6 2.2 Đặc điểm nông học của cây đậu xanh ......................................................... 7 2.2.1 Hệ rễ.................................................................................................. 7 2.2.2 Thân và cành ..................................................................................... 7 2.2.3 Lá ...................................................................................................... 7 v
2.2.4 Hoa .................................................................................................... 8 2.2.5 Trái .................................................................................................... 8 2.2.6 Hạt..................................................................................................... 9 2.3 Sâu và bệnh gây hại trên đậu xanh .............................................................. 9 2.4 Thời gian sinh trưởng và mùa vụ canh tác ................................................ 10 2.4.1 Thời gian sinh trưởng ..................................................................... 10 2.4.2 Mùa vụ canh tác .............................................................................. 11 2.5 Tình hình sản xuất và nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh ..................... 11 2.5.1 Vai trò của giống và việc cải thiện giống........................................ 11 2.5.2 Trên thế giới .................................................................................... 11 2.5.3 Ở Việt Nam ..................................................................................... 13 2.6 Ý nghĩa của đột biến cảm ứng trong chọn tạo giống cây trồng ................. 15 2.7 Cơ sở khoa học và vai trò của chọn giống đột biến cảm ứng .................... 16 2.7.1 Cơ sở khoa học của chọn giống đột biến cảm ứng ......................... 16 2.7.2 Vai trò của đột biến cảm ứng .................................................................. 16 2.7.3 Mục tiêu của phương pháp chọn giống đột biến cảm ứng ............. 17 2.8 Cơ sở di truyền của đột biến ...................................................................... 18 2.9 Các tác nhân gây đột biến .......................................................................... 19 2.9.1 Cơ chế gây đột biến của tác nhân phóng xạ ................................... 20 2.9.2 Cơ chế gây đột biến của tác nhân hóa học ..................................... 21 2.9.3 Cơ chế tác động của Ethyl Methane Sulphonate ............................ 22 2.10 Sự biểu hiện của các kiểu đột biến .......................................................... 24 2.10.1 Các loại đột biến ........................................................................... 24 2.10.2 Những biểu hiện của đột biến ....................................................... 24 2.11 Quá trình phát sinh đột biến và cách nghiên cứu chúng .......................... 24 2.11.1 Chuẩn bị vật liệu đối với cây sinh sản bằng hạt ........................... 24 2.11.2 Chọn tác nhân gây đột biến và liều lượng xử lý ........................... 25 2.11.3 Theo dõi và chọn lọc đột biến ....................................................... 26 2.12 Các biểu hiện hình thái ở cây đột biến .................................................... 32 vi
2.12.1 Đột biến liên quan đến diệp lục .................................................... 32 2.12.2 Đột biến về hình dạng và kích thước lá ........................................ 35 2.12.3 Đột biến về hoa ............................................................................. 35 2.12.4 Đột biến dạng trái ......................................................................... 36 2.12.5 Đột biến về đặc tính trổ hoa sớm và trổ hoa muộn....................... 37 2.12.6 Đột biến đặc tính chín sớm và chín muộn .................................... 37 2.13 Tình hình phát triển giống cây trồng đột biến ......................................... 38 2.14 Hệ số di truyền và hệ số phương sai ........................................................ 40 2.15 So sánh kiểu gen của dòng đột biến và giống gốc ................................... 42 2.16 Các nghiên cứu về tạo giống cây trồng bằng xử lý EMS ........................ 42 2.16.1 Trên thế giới .................................................................................. 42 2.16.2 Ở Việt Nam ................................................................................... 44 2.17 Giải trình tự DNA và kỹ thuật SSR ......................................................... 45 2.17.1 Giải trình tự DNA ......................................................................... 45 2.17.2 Kỹ thuật SSR ........................................................................ 45 Chƣơng 3: Vật liệu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ...................... 47 3.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................ 47 3.2 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 47 3.2.1 Vật liệu............................................................................................ 47 3.2.2 Thiết bị vật tư và hóa chất .............................................................. 48 3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu....................................................... 51 3.3.1 Gây tạo đột biến bằng hóa chất EMS ............................................. 51 3.3.2 Nghiên cứu các quần thể đậu xanh đột biến ở thế hệ M1 ............... 51 3.3.3 Khảo sát các quần thể đậu xanh đột biến ở thế hệ M2 và M3 ......... 52 3.3.4 Khảo nghiệm các dòng đậu xanh đột biến từ M4 đến M5 ............... 53 3.3.5 Khảo nghiệm các dòng đậu xanh đột biến ở thế hệ M6 .................. 53 3.3.6 Kỹ thuật canh tác ............................................................................ 54 3.3.7 Phương pháp thu thập các chỉ tiêu ngoài đồng ............................... 54 3.3.8 Phương pháp ước lược các thông số biến dị di truyền ................... 58 vii
3.3.9 Đánh giá mức độ nhiễm sâu bệnh và đổ ngã .................................. 60 3.3.10 Phương pháp dấu phân tử ở thế hệ M6 ......................................... 61 3.3.11 Phương pháp đánh giá độ thuần ................................................... 65 3.3.12 Phân tích khoảng cách di truyền ................................................... 66 3.3.13 Phương pháp tính chỉ số Pi và chỉ số Theta.................................. 66 3.4 Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 67 Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận .................................................................. 68 4.1 Ghi nhận tổng quát..................................................................................... 68 4.2 Sức sống của các quần thể đậu xanh ở M1, vụ Thu Đông 2013 ................ 69 4.2.1 Tỉ lệ sống ở các quần thể đậu xanh ở thời điểm 15 NSKG ............ 70 4.2.2 Tỉ lệ sống của cây lúc trổ ................................................................ 70 4.2.3 Tỉ lệ gây chết so với đối chứng....................................................... 71 4.3 Hiệu quả và hiệu suất đột biến................................................................... 72 4.3.1 Tần số đột biến................................................................................ 72 4.3.2 Hiệu quả đột biến (Mutagenic Effectiveness) ................................ 72 4.3.3 Hiệu suất đột biến (Mutagenic Efficiency) ..................................... 73 4.4 Kết quả nghiên cứu các quần thể đậu xanh từ M1 đến M3 ........................ 73 4.4.1 Đặc tính sinh trưởng của các quần thể đậu xanh từ M1 đến M3 ............. 73 4.4.2 Biến dị hình thái lá ở các quần thể đậu xanh đột biến từ M1-M3 ... 75 4.4.3 Đặc tính nông học của các quần thể đậu xanh ở M1, M2 và M3 ..... 81 4.5 Nhận xét về kết quả nghiên cứu các quần thể đậu xanh ở M1, M2 và M3 . 89 4.6 Ước lược thông số di truyền các quần thể đậu xanh ở M3 ........................ 89 4.7 Kết quả khảo sát các đặc tính sinh trưởng, hình thái và nông học ở các dòng đột biến ở M4, M5 và M6 ......................................................................... 93 4.7.1 Đặc tính sinh trưởng của các giống/dòng đậu xanh ở M4 – M6 ...... 94 4.7.2 Đặc tính hình thái của các giống/dòng đậu xanh ở M4 – M6 .......... 99 4.7.3 Đặc tính nông học ở các giống/dòng đậu xanh từ M4 đến M6 ...... 101 4.7.4 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu xanh từ thế hệ M4 đến M6 ................................................................................... 112 viii
4.8 Phân tích kiểu gen bằng dấu SSR ............................................................ 120 4.8.1 Kết quả ly trích và kiểm tra DNA từ lá đậu xanh ......................... 120 4.8.2 Kết quả kiểm tra kiểu gen của các dòng đậu xanh đột biến ......... 124 4.8.3 Mối quan hệ di truyền giữa các giống/dòng đậu xanh dựa trên phân tích SSR ................................................................................................. 126 4.9 Kết quả giải trình tự gen liên quan đến khối lượng 1.000 hạt ................. 130 4.9.1 Kết quả khuếch đại gen ................................................................ 131 4.9.2 Kết quả giải trình tự gen ............................................................... 131 Chƣơng 5 Kết luận và đề xuất .................................................................... 136 5.1 Kết luận .................................................................................................... 136 5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 136 Danh mục liệt kê các bài báo đã công bố ................................................... 138 Tài liệu tham khảo ....................................................................................... 139 Phụ chƣơng................................................................................................... 148 ix
DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Diện tích và năng suất đậu xanh ở Việt Nam từ 2012-2015 13 2.2 Liều lượng và nồng độ của các tác nhân gây đột biến được sử 26 dụng cho một số cây trồng 2.3 Sơ đồ chọn giống đột biến bằng hạt đối với cây trồng tự thụ 32 phấn 2.4 Số giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp đột biến ở 40 một số quốc gia tính đến năm 2007 3.1 Trình tự 17 đoạn mồi SSR, kích thước (KT) và nhóm liên kết 50 (NLK) được sử dụng trong thí nghiệm 3.2 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 52 3.3 Bảng phân tích phương sai 58 3.4 Thành phần phản ứng nhân gen khối lượng 1.000 hạt 65 4.1 Sức sống ở các quần thể đậu xanh đột biến giai đoạn 15 70 NSKG và trổ hoa vụ Thu Đông 2013 4.2 Tần số đột biến, hiệu quả và hiệu suất đột biến ở các quần thể 72 đậu xanh đột biến thế hệ M1, vụ Thu Đông 2013 4.3 Đặc tính sinh trưởng của các quần thể đậu xanh ở M1, M2 và 74 M3 4.4 Tỉ lệ các dạng biến dị trên lá ở các quần thể ĐX208 đột biến ở 76 M1, M2 và M3 4.5 Tỉ lệ các dạng biến dị trên lá ở các quần thể Taichung đột biến 76 ở M1, M2 và M3 4.6 Chiều cao cây lúc chín (cm) và số trái trên cây của các quần 82 thể đậu xanh trong 2 thí nghiệm ở M1, M2 và M3, vụ Thu Đông 2013, Đông Xuân 2013-2014 và Xuân Hè 2014 4.7 Chiều dài trái và số hạt trên trái của các quần thể đậu xanh 84 trong 2 thí nghiệm ở M1, M2 và M3, vụ Thu Đông 2013, Đông Xuân 2013-2014 và Xuân Hè 2014 4.8 Khối lượng 1.000 hạt và năng suất hạt (g/cây) của các quần 86 thể đậu xanh trong 2 thí nghiệm ở M1, M2 và M3, vụ Thu x
Đông 2013, Đông Xuân 2013-2014 và Xuân Hè 2014 4.9 Tỉ lệ cá thể cho trái chín đồng loạt và không đồng loạt ở các 87 quần thể đậu xanh đột biến thế hệ M3 vụ Xuân Hè 2014 4.10 Danh sách 32 cá thể đậu xanh đột biến được tuyển chọn ở M3 88 4.11 Thông số di truyền ở 4 tính trạng số lượng của 4 quần thể 90 ĐX208 và quần thể ĐX208 (ĐC) 4.12 Thông số di truyền ở 4 tính trạng số lượng của 4 quần thể 91 Taichung đột biến và quần thể Taichung (ĐC) 4.13 Đặc tính sinh trưởng của các dòng đậu xanh đột biến ở M4 và 95 2 giống đối chứng (ĐX208 và Taichung) vụ Thu Đông 2014 4.14 Đặc tính sinh trưởng của các dòng đậu xanh đột biến ở M5 và 96 2 giống đối chứng (ĐX208 và Taichung) vụ Thu Đông 2015 4.15 Đặc tính sinh trưởng của các dòng đậu xanh đột biến ở M6 và 97 giống đối chứng ĐX208 vụ Đông Xuân 2016 4.16 Chiều cao cây lúc chín, số lóng và số cành của các giống/dòng 102 đậu xanh thế hệ M4 vụ Thu Đông 2014 4.17 Chiều cao cây lúc chín, số lóng và số cành của các giống/dòng 103 đậu xanh ở thế hệ M5 vụ Thu Đông 2015 4.18 Chiều cao cây lúc chín, số lóng và số cành của các giống/dòng 104 đậu xanh ở thế hệ M6 vụ Đông Xuân 2015-2016 4.19 Số trái/cây, chiều dài trái, số hạt/trái của các giống/dòng đậu 108 xanh ở thế hệ M4 vụ Thu Đông 2014 4.20 Số trái/cây, chiều dài trái, số hạt/trái của các giống/dòng đậu 110 xanh ở thế hệ M5 vụ Thu Đông 2015 4.21 Số trái/cây, chiều dài trái, số hạt/trái của các giống/dòng đậu 111 xanh ở thế hệ M6 vụ Đông Xuân 2015-2016 4.22 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu 114 xanh ở thế hệ M4 vụ Thu Đông 2014 4.23 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu 115 xanh ở thế hệ M5 vụ Thu Đông 2015 4.24 Thành phần năng suất và năng suất của các giống/dòng đậu 116 xanh ở thế hệ M6 vụ Đông Xuân 2015-2016 4.25 Danh sách các dòng đậu xanh đột biến ưu tú ở M6 được tuyển 119 xi
chọn trong vụ Đông Xuân 2015-2016 4.26 Danh sách 35 giống/dòng đậu xanh được sử dụng để phân tích 121 kiểu gen 4.27 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của 35 giống/dòng đậu 123 xanh 4.28 Danh sách 6 dòng đậu xanh đột biến ở M6 và 2 giống gốc 130 (ĐX208 và Taichung) sử dụng để giải trình tự gen 4.29 Sự sai khác trong trình tự nucleotide ở đoạn gen từ vị trí 461- 134 500 nucleotide của 3 dòng ĐX208 đột biến và giống ĐX208 4.30 Sự sai khác trong trình tự nucleotide ở đoạn gen từ vị trí 461- 135 500 nucleotide của 3 dòng Taichung đột biến và giống Taichung xii
DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Tỉ lệ đóng góp của các tác nhân đột biến trong tạo giống cây 20 trồng tại Nhật năm 2008 2.2 Hiện tượng alkyl hóa Guanine gây ra đồng hoán GC →AT 22 2.3 Hiện tượng alkyl hóa Thymine gây ra đồng hoán TA → CG 23 2.4 Số lượng giống cây trồng đột biến trên thế giới năm 1969- 39 2014 2.5 Tỉ lệ các giống đột biến ở các châu lục năm 2008 39 3.1 Vật liệu dùng để gây đột biến 48 4.1 Đột biến dạng Xantha (A) và Albina (B) 77 4.2 Các kiểu đột biến dạng Maculata 78 4.3 Các kiểu đột biến dạng Viridis 78 4.4 Các kiểu đột biến dạng Alboviridis 78 4.5 Đột biến về hình dạng lá ở thế hệ M3 79 4.6 Biến dị về số lượng lá đơn ở quần thể ĐX208 đột biến 80 4.7 Các dạng đột biến số lượng lá chét 80 4.8 Đột biến màu sắc trục hạ diệp ở M5 100 4.9 Màu vỏ trái, dạng trái, màu hoa, màu vỏ hạt và dạng hạt của 101 dòng ĐX8-1-28-8A và dòng ĐX4-6-1-1 4.10 Kiểu chín đồng loạt của dòng TC8-4-3-5B (A) và kiểu chín 119 đồng loạt từng phần của giống Taichung (ĐC) (B) 4.11 Màu sắc hạt và cỡ hạt của 11 dòng đậu xanh đột biến triển 120 vọng ở M6 được tuyển chọn trong vụ Đông Xuân 2015-2016 4.12 Kết quả điện di kiểm tra DNA 6 dòng ĐX208 đột biến và 121 giống ĐX208 (ĐC) 4.13 Kết quả điện di kiểm tra DNA 7 dòng Taichung đột biến và 122 giống Taichung (ĐC) 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR 13 dòng ĐX208 đột biến và 124 giống gốc (ĐX208) với cặp mồi MBSSR039 xiii
4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR 20 dòng Taichung đột biến và 125 giống gốc (Taichung) với cặp mồi MBSSR039 4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 20 dòng Taichung đột 126 biến và giống Taichung (ĐC) với cặp mồi CEDAAG002 4.17 Mối quan hệ di truyền của 13 dòng ĐX208 đột biến và giống 128 ĐX208 (giống gốc) 4.18 Mối quan hệ di truyền của 20 dòng Taichung đột biến và 129 giống Taichung (giống gốc) 4.19 Hình điện di kết quả khuếch đại gen VrSrThr 127 4.20 Sự khác biệt vị trí các nucleotide của 3 dòng đậu xanh đột 131 biến so với giống gốc ĐX208 4.21 Sự sai khác vị trí các nucleotide của 3 dòng đậu xanh 132 Taichung đột biến so với giống gốc Taichung 4.22 Mức độ biến dị vị trí các nucleotide ở 3 dòng ĐX208 đột biến 133 (A) và 3 dòng Taichung đột biến (B) so với giống gốc ĐX208 và Taichung tương ứng xiv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AVRDC Asian Vegetable Research and Development Center BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair CNSH Công nghệ Sinh học CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide CV Coefficient of Variation DAFF Department of Agriculture, Fisheries and Forestry DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long ĐC Đối chứng ĐHCT Đại học Cần Thơ EMS Ethyl Methane Sulphonate EtBr Ethidium Bromide FAO Food and Agriculture Organization GA Genetic Advance GAM Genetic Advance as percent of Mean GBS Genotyping by Sequencing GCV Genotypic Coefficient of Variance h2b Heritability in broad sense IAEA International Atomic Energy Agency IBPGR International Board for Plant Genetic Resources KL Khối lượng LOC Lethality Over Control M1 Thế hệ đột biến thứ 1 M2 Thế hệ đột biến thứ 2 M3 Thế hệ đột biến thứ 3 M4 Thế hệ đột biến thứ 4 M5 Thế hệ đột biến thứ 5 M6 Thế hệ đột biến thứ 6 mRNA Messenger Ribonucleic Acid NCBI National Center for Biotechnology Information NLK Nhóm liên kết NSKG Ngày sau khi gieo NSTT Năng suất thực tế OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction xv
PCV Phenotypic Coefficient of Variance RNA Ribonucleic Acid SA Sodium Azide SHƯD Sinh học Ứng dụng SNPs Single Nucleotide Polymorphisms SSR Simple Sequence Repeat TEMED Tetra methyl ethylene diamine UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean xvi
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là cây họ đậu quan trọng, chiếm gần 10 diện tích và 5 sản lượng các loài họ đậu ăn hạt ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới. Đậu xanh chứa rất ít hàm lượng oligosaccharides – loại đường gây chứng đầy hơi, nhưng rất giàu đạm, khoáng chất, vitamin và là nguồn sắt chất lượng cao, đặc biệt tốt đối với phụ nữ và trẻ em thiếu máu, (Kim et al., 2015). Với thành phần dinh dưỡng như trên, đậu xanh đã trở thành một loại thực phẩm linh hoạt trong khẩu phần ăn của con người, là nguồn dược liệu được ưa chuộng (Myers, 2000). Ngoài ra, đậu xanh còn là nguồn thức ăn gia súc tốt để sản xuất thịt và sữa chất lượng cao (Boelt et al., 2014). Thêm vào đó, cây đậu xanh rất thích hợp cho việc xen canh và luân canh với nhiều loại cây trồng khác do có chu kỳ sinh trưởng ngắn, kỹ thuật canh tác đơn giản, thích ứng rộng với môi trường. Hơn nữa, với khả năng cố định đạm ở nốt rễ khi kết hợp với vi khuẩn Rhizobium trong đất cho phép đậu xanh phát triển mạnh trong đất thiếu đạm và có thể cải tạo được kết cấu đất (War et al., 2017). Trước tình hình biến đổi khí hậu hiện nay, hạn mặn đang là vấn đề nghiêm trọng, với khả năng chịu hạn khá, đậu xanh được xem như một cây trồng có tiềm năng đáp ứng được nhu cầu cấp thiết này (Rao, 2016). Ở Việt Nam, đậu xanh được trồng nhiều ở vùng Duyên hải Nam Trung Bộ và Tây nguyên. Hiện nay, chưa có một thống kê chính thức về cây trồng này, tuy nhiên theo số liệu thu thập được thì đậu xanh có năng suất bình quân khoảng 0,7 tấn/ha, và biến động lớn giữa các vùng miền (Nguyễn Văn Chương và ctv., 2014). Nguyên nhân cơ bản dẫn đến năng suất đậu xanh thấp có thể là do đậu xanh thường được trồng trên đất xấu, nông dân sử dụng giống cũ của địa phương không được chọn lọc, kiểu trái chín không đồng loạt. Nghiên cứu cho thấy chỉ có khoảng 65 trái đậu xanh được thu hoạch trong vòng 70-75 ngày sau khi gieo (NSKG), 18% trong lần thu hoạch thứ hai 75-80 NSKG và 17% trong lần thu hoạch thứ ba 90-95 NSKG (Rahman, 1991). Để rút ngắn thời gian và giảm chi phí thu hoạch thì việc chọn tạo giống đậu xanh mới năng suất cao, mang kiểu gen trái chín đồng loạt là tiêu chí quan trọng trong công tác chọn tạo và cải thiện giống đậu xanh hiện nay. Trong những năm gần đây, đột biến cảm ứng đã được chứng minh là một công nghệ khả thi, bền vững, hiệu quả cao, được chấp nhận về mặt môi trường, linh hoạt và chi phí thấp để tăng cường cải thiện giống cây trồng. Đột biến cảm ứng cho phép thoát được bế tắc của tính bất thụ bằng cách tạo các 1
biến dị hữu ích và đem lại bước tiến đáng kể cho công tác chọn giống đậu xanh (Lagoda, 2009). Hóa chất Ethyl Methane Sulphonate (EMS) là tác nhân gây đột biến hiệu quả về phổ biểu hiện và được sử dụng phổ biến (Auti and Apparao, 2009). Trên thế giới, EMS đã được sử dụng thành công trong việc tạo ra giống mới có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng sâu, bệnh, chống chịu được các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh trên một số giống cây trồng như: lúa (Singh et al., 1998; Talebi et al., 2012), đậu trắng (Girija and Dhanavel, 2009), đậu nành (Song et al., 2010; Satpute and Fultambkar, 2012), đậu xanh (Sandhu et al., 2003; Roychowdhury et al., 2012; Mishra and Singh, 2014). Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu tạo giống đột biến bằng hóa chất EMS rất ít, số lượng của những nghiên cứu này còn giới hạn, hầu hết các giống đột biến đã được công bố đều sử dụng tác nhân vật lý để gây đột biến. Hiện nay, phân tích kiểu gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử DNA đã và đang được phát triển mạnh, là một trong những kỹ thuật giúp cho phương pháp chọn giống đột biến cảm ứng trở nên nhanh chóng và có hiệu quả hơn. Việc phối hợp giữa phương pháp chọn giống bằng đột biến cảm ứng và kỹ thuật sinh học phân tử sẽ rút ngắn thời gian chọn tạo từ 3-4 thế hệ so với phương pháp chọn giống truyền thống (Điêu Thị Mai Hoa, 2006), đồng thời định hướng nhanh kiểu gen mong muốn và gia tăng hiệu quả của các giống đột biến. Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất đậu xanh và nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học, vật liệu cho công tác chọn tạo giống cũng như giống đậu xanh mới luận án “Chọn tạo các dòng đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng đột biến EMS trên hai giống ĐX208 và Taichung” đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu - Tạo ra được nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác chọn tạo giống đậu xanh. - Chọn tạo được từ 2-4 dòng đậu xanh đột biến ngắn ngày, có kiểu trái chín đồng loạt với năng suất cao hơn hoặc tương đương so với giống gốc, ít nhiễm giòi đục thân và bệnh đốm lá. 1.2.2 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 1.2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu - Hai giống đậu xanh dùng làm vật liệu gây đột biến bởi EMS (Ethyl Methane Sulphonate), trong đó (i) giống Taichung (tên gốc là Tainan 5) có 2