Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút cúm gia cầm tại khu vực lân cận thành phố Hồ Chí Minh và khả năng bảo hộ của vắc-xin navet-fluvac 2 đối với vi-rút cúm gia cầm clade 2.3.2.1

Chia sẻ: Dopamine Grabbi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:185

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận; xác định phả hệ các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành và các chủng vi-rút sử dụng trong thành phần vắc-xin Navet-Fluvac 2; đánh giá khả năng bảo hộ trên đàn gia cầm sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm thuộc clade 2.3.2.1 . Mời các bạn tham khảo nội dung đề tài!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút cúm gia cầm tại khu vực lân cận thành phố Hồ Chí Minh và khả năng bảo hộ của vắc-xin navet-fluvac 2 đối với vi-rút cúm gia cầm clade 2.3.2.1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH LƯU HÀNH VI-RÚT CÚM GIA CẦM TẠI KHU VỰC LÂN CẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC-XIN NAVET-FLUVAC 2 ĐỐI VỚI VI-RÚT CÚM GIA CẦM CLADE 2.3.2.1 Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP TP. HCM - Năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH LƯU HÀNH VI-RÚT CÚM GIA CẦM TẠI KHU VỰC LÂN CẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC-XIN NAVET-FLUVAC 2 ĐỐI VỚI VI-RÚT CÚM GIA CẦM CLADE 2.3.2.1 Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 DANH MỤC CÔNG TRÌNH TÁC GIẢ TP. HCM - Năm 2021
iii TÓM TẮT Đề tài “Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm tại khu vực lân cận Thành phố Hồ Chí Minh và khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1” được thực hiện nhằm đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận; xác định phả hệ các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành và các chủng vi-rút sử dụng trong thành phần vắc-xin Navet-Fluvac 2; đánh giá khả năng bảo hộ trên đàn gia cầm sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm thuộc clade 2.3.2.1. Kết quả đạt được như sau: Kết quả khảo sát 2.880 mẫu xét nghiệm tại cơ sở giết mổ trên đàn gia cầm có nguồn gốc từ 8 tỉnh gồm Đồng Nai, Bình Dương, Bà Rịa - Vũng Tàu, Tây Ninh, Long An, Tiền Giang, Bến Tre và Thành phố Hồ Chí Minh và 1.800 mẫu xét nghiệm thu thập trên đàn gia cầm khỏe mạnh tại 5 huyện: Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh, Nhà Bè và Cần Giờ không phát hiện trường hợp dương tính vi-rút cúm A/H5N1. Nghiên cứu đã phát hiện 51/63 mẫu xét nghiệm dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1, từ các trường hợp nghi ngờ mắc bệnh Cúm gia cầm tại các hộ chăn nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận. Dấu hiệu lâm sàng phổ biến trên đàn gà, vịt mắc bệnh Cúm A/H5N1 gồm có ủ rũ, bỏ ăn, phù đầu, thở khò khè, liệt chân, sả cánh, phân trắng xanh, xoay vòng vòng, co giật. Dấu hiệu thần kinh trên vịt là điển hình. Bệnh tích điển hình gồm có: não, phổi xuất huyết, xuất huyết lớp mỡ vành tim, gan và lách sưng xuất huyết, khí quản xuất huyết có thể sử dụng để chẩn đoán lâm sàng. Da chân xuất huyết trên gà là bệnh tích điển hình của bệnh Cúm gia cầm ở gà. Kết quả phân tích di truyền 26/51 chủng vi-rút Cúm A/H5N1 được chọn ngẫu nhiên trong giai đoạn 2013 - 2015 ghi nhận, có 22 chủng thuộc clade 2.3.2.1c, 3 chủng thuộc clade 1.1.2 và 1 chủng thuộc clade 2.3.2.1a. Các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1c trong nghiên cứu có sự tương đồng trình tự nucleotide rất cao với 2 chủng vi-rút sử dụng công cường độc A/chicken/DL/NAVET 0292(14)/2013 và A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-
iv 17A261/2017 thuộc clade 2.3.2.1c, trong khoảng 96,1 - 99,1%; và với 2 chủng vi- rút sử dụng trong vắc-xin, 95,0 - 96% với chủng A/reassortant/USCDC_RG30 và 91,3 - 92,2% với chủng A/reassortant/NIBRG-14. Các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 thực địa thuộc clade 1.1.2 chỉ tương đồng di truyền ở mức 89,7 - 89,8% với chủng vi-rút sử dụng trong vắc-xin A/reassortant/USCDC_RG30, nhưng tương đồng cao hơn với chủng vi-rút trong vắc-xin A/reassortant/NIBRG-14 ở mức 93,3 - 93,4%. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy vắc-xin Navet-Fluvac 2 đạt độ an toàn theo tiêu chuẩn sau khi tiêm phòng cho đàn gà, vịt và vịt trời, ngay cả khi tiêm với liều gấp đôi liều chỉ định. Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có hiệu quả bảo hộ rất cao đối với vi-rút Cúm gia cầm thuộc clade 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b và 2.3.2.1c trên gà, vịt và vịt trời. Đối với gà chỉ cần tiêm 1 lần ở thời điểm 2 tuần tuổi; đối với vịt và vịt trời phải tiêm phòng lặp lại 2 lần ở thời điểm 14 ngày tuổi và tiêm lặp lại mũi tiêm thứ 2 sau 14 ngày kể từ ngày tiêm mũi 1. Vắc-xin Navet-Fluvac 2 có khả năng giảm mạnh sự bài thải chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 độc lực cao sau khi công độc. Tỷ lệ bài thải vi-rút sau khi công cường độc 3 ngày, giữa gà, vịt được tiêm phòng và không được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2, có ý nghĩa thống kê với P4log2, mà cả ở những vịt có hiệu giá kháng thể HI thấp hơn 4log2.
v SUMMARY Thesis “Prevalence of Avian Influenza Virus in Ho Chi Minh region and evaluation of Navet-Fluvac 2 vaccine efficacy against Avian Influenza Virus clade 2.3.2.1 in poultry” was conducted in order to (i) determine the prevalence of Avian Influenza Virus (AIV) in poultry in Ho Chi Minh region, (ii) analyze genetic relation of field and vaccine virus strains, and (iii) evaluate the protective efficacy of Navet-Fluvac 2 for poultry against AIV clade 2.3.2.1. The results showed that: All of these 2,880 samples at slaughterhouses on poultry flocks originating from 8 provinces: Dong Nai, Binh Duong, Ba Ria Vung Tau, Tay Ninh, Long An, Tien Giang, Ben Tre, Ho Chi Minh City and 1,800 samples collected from healthy poultry flocks in 5 districts: Cu Chi, Hoc Mon, Binh Chanh, Nha Be and Can Gio were negative for influenza A/H5N1 virus by RT-PCR test. However, from suspected cases of avian Influenza in livestock households in Ho Chi Minh City and neighboring provinces, the study detected 51/63 samples that were positive for Influenza A/H5N1 virus. The common clinical signs in chickens and ducks infected with influenza A/H5N1 were lethargy, anorexia, swollen head, wheezing, leg paralysis, drooping wings, greenish white feces, torticollis, incoordination. Neurological signs in ducks are typical for AI. Haemorrhage lesions were observed on brain and many visceral organs including lungs, coronary pericardium, liver, spleen, and trachea. Haemorrhage on foot skin of chickens is a typical lesion of Avian Influenza in chickens. The results of genetic analysis of 26/51 strains of Influenza A/H5N1 virus randomly selected in the period 2013-2015 recorded 22 strains belonging to clade 2.3.2.1c, 3 strains of clade 1.1.2, and 1 strain of clade 1.1.2 belonging to clade 2.3.2.1a. Influenza A/H5N1 virus strains belonging to clade 2.3.2.1c in the study have very high nucleotide sequence similarity with 2 virus strains A/chicken/DL/NAVET 0292(14)/ 2013 and A/duck/Vietnam/BacNinh/NCVD-17A261/2017 belong to clade 2.3.2.1c using in challenge, in the range of 96.1 - 99.1%; and with 2 vaccine
vi virus strains in the range of 95.0 - 96% with strain A/reassortant/USCDC_RG30 and 91.3 - 92.2% with strain A/reassortant/NIBRG-14. AIV clade 1.1.2 in this study were low homologous to those of vaccine virus strains A/reassortant/NIBRG-14 and A/reassortant/USCDC_RG30 with 93.3 – 93.4% and 89.7 – 89.8%, respectively. The results of study showed that Navet-Fluvac 2 vaccine was safety in vaccinated poultry (chicken, duck and mallard), even when injected with double dose. Evaluation of Navet-Fluvac 2 vaccine efficacy in vaccinated poultry by virus challenge method was shown as follow: The Navet-Fluvac 2 vaccine is highly effective against clade 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b and 2.3.2.1c Avian Influenza viruses in chickens, ducks and mallards. For chickens, only 1 injection is needed at 2 weeks of age; ducks and mallards must be vaccinated twice, at 14 days of age and repeat the second injection 14 days after the first injection. Navet-Fluvac 2 vaccine has the ability to strongly reduce the shedding of highly virulent Avian Influenza A/H5N1 virus after challenge. The rate of viral shedding after 3 days of challenge, between vaccinated and unvaccinated chickens and ducks with Navet-Fluvac 2 vaccine, was statistically significant with P4log2, but also in those ducks with HI antibody titers lower than 4log2.
vii MỤC LỤC TRANG Trang phụ bìa TÓM TẮT ................................................................................................................ iii SUMMARY ............................................................................................................... v MỤC LỤC ................................................................................................................vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT....................................................................... x DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................xii DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ ............................................... xiv MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1 TỔNG QUAN ......................................................................................... 5 1.1. Giới thiệu về vi-rút Cúm gia cầm ..................................................................................... 5 1.2 Các phương thức biến đổi kháng nguyên vi-rút Cúm ..................................................... 8 1.2.1 Hiện tượng lệch kháng nguyên (antigienic drift) .......................................................... 8 1.2.2. Hiện tượng trộn kháng nguyên ...................................................................................... 9 1.2.3. Hiện tượng glycosyl hóa .............................................................................................. 10 1.3. Độc lực vi-rút Cúm gia cầm............................................................................................ 11 1.3.1. Protein HA ..................................................................................................................... 11 1.3.2. Protein NA ..................................................................................................................... 13 1.3.3. Protein NS1 ................................................................................................................... 14 1.3.4. Nhóm RNA-polymerase .............................................................................................. 14 1.3.5. Protein M2 và PB1-F2.................................................................................................. 14 1.4. Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm (H5) trên thế giới và tại Việt Nam.............. 15 1.4.1. Tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm phân type H5 trên thế giới........................ 15 1.4.2. Tình hình lưu hành các nhánh vi-rút Cúm gia cầm tại Việt Nam ............................ 16 1.5 Đặc điểm bệnh lý bệnh Cúm gia cầm ............................................................................. 18 1.5.1 Dấu hiệu lâm sàng của gia cầm mắc bệnh................................................................... 18
viii 1.5.2 Bệnh tích trên gia cầm mắc bệnh ................................................................................. 18 1.6. Miễn dịch đối với vi-rút Cúm gia cầm........................................................................... 19 1.6.1. Miễn dịch thụ động ....................................................................................................... 19 1.6.2. Miễn dịch chủ động ...................................................................................................... 20 1.6.3. Miễn dịch chéo đối với vi-rút Cúm gia cầm .............................................................. 25 1.6.4. Cơ chế né tránh miễn dịch của vi-rút Cúm gia cầm .................................................. 26 1.7. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm trên thế giới và Việt Nam .................... 28 1.7.1. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm trên thế giới ........................................ 28 1.7.2. Một số nghiên cứu về vắc-xin Cúm gia cầm tại Việt Nam ...................................... 33 1.7.3. Hiệu lực của vắc-xin Cúm gia cầm và phương pháp đánh giá................................. 37 1.8. Tình hình bệnh và sử dụng vắc-xin Cúm gia cầm tại khu vực khảo sát ..................... 38 1.8.1. Tình hình chăn nuôi và bệnh Cúm gia cầm................................................................ 38 1.8.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm .............................................. 40 Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................ 42 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu....................................................................................... 42 2.1.1. Địa điểm......................................................................................................................... 42 2.1.2. Thời gian: Từ tháng 01/2014 đến 12/2019. ................................................................ 42 2.2. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 42 2.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 43 2.4. Vật liệu, hóa chất.............................................................................................................. 43 2.5. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................. 43 2.5.1. Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ...................................... 43 2.5.2. Nghiên cứu phả hệ, so sánh sự biến đổi vi-rút Cúm gia cầm ................................... 46 2.5.3. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm clade 2.3.2.1 ..................................................................................................................... 50 2.6. Xử lý thống kê .................................................................................................................. 60 Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................... 61 3.1. Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 ......................................... 61 3.1.1 Khảo sát vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm tại cơ sở giết mổ..................... 61
ix 3.1.2 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm tại hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ Chí Minh.......................................................................................................................................... 64 3.1.3 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 đối với các trường hợp gia cầm nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm .......................................................................................... 66 3.1.4 Dấu hiệu lâm sàng ở gà, vịt bệnh dương tính với vi-rút Cúm A/H5N1 ................... 68 3.2. Nghiên cứu phả hệ của vi-rút Cúm A/H5N1 ................................................................ 77 3.2.1. Kết quả giải trình tự và phân tích gien HA................................................................. 77 3.2.1.1 Xác định phân nhánh vi-rút Cúm gia cầm theo trình tự gien HA .......................... 77 3.2.1.2 Phân tích trình tự axít amin tại điểm cắt protein HA thành HA1 và HA2 ............ 79 3.3. Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1. .......................................................................................... 90 3.3.1 Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 .............................................. 90 3.3.2. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac trên gà .................................. 96 3.3.3. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac trên vịt................................ 106 3.3.4. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời ..................... 114 3.3.5. Đánh giá khả năng bài thải vi-rút sau công độc ....................................................... 117 3.3.6. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 ......................................... 120 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 125 4.1 Kết luận ............................................................................................................................ 125 4.2 Đề nghị ............................................................................................................................. 126 DANH MỤC .......................................................................................................... 127 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ....................................... 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 128 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 141
x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AI : Avian Influenza AIV : Avian Influenza Virus APC : Antigen Presenting Cell BALT : Bronchus associated lymphoid tissues BCR : B Cell Receptor BNNPTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn CDC : Centers for Disease Control and Prevention CD : Cluster of Differenciation CTL : Cytotoxic T lymphocyte DC : Dendritic cell ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ECF : Eosinophil chemoratic factor FAO : Food and Agriculture Organization GP : Glycoprotein GrA : Granzyme GALT : Gut associated lymphoid tissues GMT : Geometric Mean Titer HA : Hemagglutination HI : Hemagglutination Inhibition HPAI : Highly Pathogienic Avian Influenza IL : Interleukin LPAI : Low Pathogienic Avian Influenza MPAI : Medium Pathogienic Avian Influenza MHC : Major Histocompatibility Complex NA : Neuraminidase OIE : World organisation for animal health (Office Internationale dé Epizooties)
xi PCR : Polymerase Chain Reaction PBS : Photphate Buffered Salin RIG-1: : Retinoic acid inducible gene 1 RT-PCR : Reverse transcription- Polymerase Chain Reaction SPF : Specific Pathogens Free TCR : T cell receptor WHO : World Health Organization
xii DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 1.1. Hiệu quả của một số loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm............................ 30 Bảng 1.2. Một số loại vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm được lưu hành tại Việt Nam........................................................................................................................................... 36 Bảng 2.1. Phân bổ số mẫu xét nghiệm vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 trên gia cầm thu tại cơ sở giết mổ gia cầm An Nhơn................................................................................. 44 Bảng 2.2. Phân bổ mẫu khảo sát vi-rút Cúm gia cầm tại hộ chăn nuôi ............................. 45 Bảng 2.3. Danh sách các chủng vi-rút Cúm A/H5N1 tham khảo trong phân tích so sánh trình tự gien và mối quan hệ phả hệ.............................................................................. 48 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà.......... 50 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt ......... 51 Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm đánh giá an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời ............................................................................................................................................. 51 Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên gà được tiêm vắc-xin Navet- Fluvac 2 .................................................................................................................................... 56 Bảng 2.8. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt được tiêm vắc-xin Navet- Fluvac 2 .................................................................................................................................... 57 Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm công cường độc trên vịt trời được tiêm vắc-xin Navet Fluvac 2 .................................................................................................................................... 58 Bảng 2.10. Bố trí thí nghiệm đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin Navet Fluvac 2..... 59 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên gà tại cơ sở giết mổ .................................. 61 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên gà tại hộ chăn nuôi ở Thành phố Hồ Chí Minh .................................................................................................................................. 64 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát vi-rút Cúm A trên vịt tại hộ chăn nuôi .................................... 65 ở Thành phố Hồ Chí Minh ..................................................................................................... 65 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát vi-rút Cúm gia cầm đối với các trường hợp nghi ngờ .......... 66
xiii Bảng 3.5. Kết quả xét nghiệm vi-rút Cúm A/H5N1 theo loài trên gia cầm nghi ngờ bệnh Cúm gia cầm................................................................................................................... 68 Bảng 3.6. Tần suất xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng trên gà, vịt (+) Cúm A/H5N1 ........ 69 Bảng 3.7. Tần suất xuất hiện các bệnh tích trên gà, vịt (+) với vi-rút Cúm A/H5N1 ...... 73 Bảng 3.8. Trình tự axít amin tại vị trí cắt gien HA (HA1-HA2) của các chủng vi- rút Cúm gia cầm A/H5N1 trong đề tài .................................................................................. 80 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà .................. 90 Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt ................ 91 Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt trời ......... 92 Bảng 3.12. Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể sau tiêm phòng trên gà theo quy trình tiêm 1 mũi và 2 mũi vắc-xin Navet-Fluvac 2 ....................................................................... 96 Bảng 3.13. Kết quả công cường độc trên gà được tiêm vắc-xin và không tiêm vắc- xin Navet-Fluvac 2 ................................................................................................................ 100 Bảng 3.14. Đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt sau tiêm phòng vắc-xin Navet- Fluvac 2 .................................................................................................................................. 106 Bảng 3.15. Kết quả công cường độc trên vịt được tiêm và không được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2....................................................................................................................... 110 Bảng 3.16. Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể trên vịt trời có và không có tiêm vắc- xin Navet-Fluvac 2 ................................................................................................................ 114 Bảng 3.17. Kết quả công cường độc trên vịt trời có và không tiêm vắc-xin Navet- Fluvac 2 .................................................................................................................................. 116 Bảng 3.18. Kết quả kiểm tra bài thải vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 sau khi công cường độc trên gà, vịt được và không được tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2...................... 118 Bảng 3.19. Đánh giá độ dài miễn dịch trên gà sau khi tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 .... 120 Bảng 3.20. Đánh giá độ dài miễn dịch sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt............................................................................................................................................. 122 Bảng 3.21. Kết quả công cường độc trên vịt tại thời điểm 6 tháng sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 ......................................................................................................... 123
xiv DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ TRANG Hình 1.1. Các đoạn RNA của vi-rút Cúm gia cầm tuýp A và các protein tương ứng ....... 6 Hình 1.2. Sơ đồ minh họa sự đột biến điểm của vi-rút Cúm gia cầm ................................. 9 Hình 1.3. Minh họa sự thay đổi di truyền của vi-rút Cúm.................................................... 9 Hình 1.4. Trình diện kháng nguyên của vi-rút Cúm A qua MHC-I và cơ chế né tránh đáp ứng miễn dịch tế bào .............................................................................................. 27 Hình 2.1. Quy trình xét nghiệm vi-rút Cúm A/H5N1 (TCVN 8400-26:2014) ................ 46 Sơ đồ 2.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên gà sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 ........................................................................................................... 53 Sơ đồ 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá đáp ứng kháng thể trên vịt sau tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 ........................................................................................................... 54 Hình 3.1. Gà ủ rũ, bỏ ăn, chết tại hộ chăn nuôi xã Tân Nhựt, huyện Bình Chánh, Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2013 ..................................................................................... 70 Hình 3.2. Vịt ủ rũ, chết tại hộ chăn nuôi xã Xuân Thới Thượng, huyện Hóc Môn, Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2014 ..................................................................................... 71 Hình 3.3. Gà mắc bệnh với dấu hiệu lâm sàng mồng, tích tím tái ..................................... 71 Hình 3.4. Vịt mắc bệnh có dấu hiệu rối loạn thần kinh ...................................................... 72 Hình 3.5. Xuất huyết da chân ................................................................................................ 74 Hình 3.6. Khí quản xuất huyết............................................................................................... 74 Hình 3.8. Phổi sung huyết, xuất huyết .................................................................................. 75 Hình 3.9. Xuất huyết mỡ vành tim........................................................................................ 76 Hình 3.10. Gan sưng, xuất huyết........................................................................................... 76 Hình 3.11. Lách sưng, xuất huyết ......................................................................................... 77 Hình 3.12. Cây di truyền dựa trên trình tự nucleotide của gien HA của các chủng AIV (Giá trị Bootstrap 1000 lần lặp lại)................................................................................ 86 Hình 3.13. Sự khác biệt trình tự gien của vi-rút Cúm A/H5N1 ......................................... 89 Hình 3.14. Tiêm phòng vắc xin Navet-Fluvac 2 cho đàn vịt thí nghiệm .......................... 93
xv Hình 3.15. Đàn vịt trời lô thí nghiệm và lô đối chứng vận động, ăn uống bình thường sau tiêm phòng............................................................................................................ 93 Hình 3.16. Mổ khám không phát hiện tồn lưu vắc-xin tại vị trí tiêm trên gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2, liều 0,5ml/con sau 3 tuần ......................................... 94 Hình 3.17. Mổ khám ghi nhận còn vài hạt lấm tấm vắc-xin tại vị trí tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên gà, liều 1ml/con sau 3 tuần .................................................................. 94 Hình 3.18. Mổ khám không phát hiện tồn lưu vắc-xin trên vịt tại vị trí tiêm vắc-xin Navet-Fluvac 2 tiêm phòng liều 0,5ml/con sau 3 tuần ........................................................ 95 Hình 3.19. Mổ khám ghi nhận vài chấm nhỏ lấm tấm vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên vịt tiêm phòng liều 1ml/con sau 3 tuần ................................................................................. 95 Hình 3.20. Trung tâm Nghiên cứu Thú y, an toàn sinh học cấp độ 3.............................. 103 Hình 3.21. Công cường độc trên gà bằng cách nhỏ mắt, nhỏ mũi................................... 103 Hình 3.22. Lô gà được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 không có biểu hiện bất thường sau công cường độc.................................................................................................. 104 Hình 3.23. Lô gà đối chứng được không tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 chết 3 ngày sau công cường độc ..................................................................................................... 104 Hình 3.24. Bệnh tích xuất huyết bàn chân trên gà lô đối chứng khi công độc ............... 105 Hình 3.25. Bệnh tích mồng, tích tím tái trên gà lô đối chứng khi công độc ................... 105 Hình 3.26. Công cường độc qua đường nhỏ mắt, nhỏ mũi trên vịt ................................. 112 Hình 3.27. Vịt tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 khỏe mạnh bình thường ................ 113 Hình 3.28. Vịt lô đối chứng chết sau 3 ngày công cường độc ......................................... 113
1 MỞ ĐẦU Bệnh Cúm gia cầm do vi-rút A/H5N1 thể độc lực cao là một bệnh nguy hiểm gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và đe dọa tới sức khỏe của cộng đồng. Vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, là RNA vi-rút, gồm 8 sợi đơn âm. Vi-rút dạng đa hình thái, kích thước 80 - 120 nm. Dựa trên cấu trúc kháng nguyên của hai protein bề mặt Hemaglutinin (HA) và Neuraminidase (NA), vi-rút Cúm A được phân chia thành 18 subtype HA và 11 subtype NA, trong đó tác nhân gây bệnh Cúm ở gia cầm chủ yếu là subtype H5, H7 và H9 (CDC, 2020) Kết quả khảo sát sự biến đổi vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 của Cục Thú y tại Việt Nam cho thấy, giai đoạn đầu tiên từ năm 2003 đến 2005, trong phạm vi cả nước, vi-rút Cúm gia cầm lưu hành thuộc nhánh 1 (Nguyễn Tiến Dũng, 2008); giai đoạn 2007 - 2009, tại miền Bắc xuất hiện nhánh mới 2.3.4 và nhánh 7 trên gà nhập trái phép qua biên giới, trong khi các tỉnh miền Nam chủ yếu là vi-rút nhánh 1 (Nguyễn Tùng, 2013); từ giữa năm 2010, nhánh 2.3.2.1 xuất hiện thay thế nhánh 2.3.4 ở phía Bắc; đến năm 2013 các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long vẫn tồn tại nhánh vi-rút 1.1, trong khi các tỉnh miền Bắc, miền Trung, Tây Nguyên lưu hành chủ yếu nhánh vi-rút 2.3.2.1 gồm 3 nhóm nhỏ gọi là nhóm a, b và c. Nhóm a xuất hiện từ giữa năm 2010 đến đầu năm 2012 ở hầu hết các tỉnh, trừ các tỉnh thuộc Đồng bằng Sông Cửu Long. Nhóm b phát hiện trong năm 2011 và 2012 ở Quảng Ninh, Bắc Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Phú Thọ, Nam Định, Thái Bình, Sơn La, Ninh Bình, Nghệ An, rất độc với gà và vịt mẫn cảm. Nhóm 2.3.2.1c được phát hiện từ giữa năm 2012 ở hầu hết các ổ dịch tại các tỉnh từ Lạng Sơn đến Quảng Ngãi dọc theo quốc lộ 1A. Giai đoạn 2010 - 2013, sự tiến hoá của vi-rút Cúm A/H5N1 dẫn đến làm thay đổi tính kháng nguyên ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vắc-xin. Vi-rút Cúm A/H5N1 phân nhóm 2.3.2.1 với 3 phân nhóm nhỏ 2.3.2.1 a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c tại các tỉnh phía Bắc có xu hướng di chuyển vào phía Nam, trong đó 2.3.2.1c vẫn lưu hành chủ yếu tại các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ (Cục Thú y, 2015).
2 Sự đa dạng lưu hành vi-rút Cúm gia cầm trong giai đoạn này làm cho dịch tễ bệnh Cúm gia cầm trở nên phức tạp, ảnh hưởng đến chiến lược sử dụng vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm ở Việt Nam, trong đó có Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận. Vì vậy bên cạnh các vắc-xin đã sử dụng trước đây (Re1 và Re5), trong năm 2014, Việt Nam đã nhập khẩu vắc-xin Re6 để phòng bệnh Cúm gia cầm. Tuy nhiên các vắc-xin Re-1 và Re-5 chỉ bảo vệ được 1 phần vịt được tiêm vắc-xin chống lại vi-rút chủng H5N1 độc lực cao clade 2.3.2.1a và 2.3.2.1b (Nguyễn Văn Cảm, 2011). Vắc-xin Navet-Vifluvac với chủng NIBRG-14 bảo hộ được gia cầm chống lại clade 1 và 2.3.2.1a và 2.3.2.1c, nhưng không có hiệu quả đối với vi-rút Cúm gia cầm thuộc phân nhóm 2.3.2.1b (Đậu Huy Tùng và ctv, 2012). Tổng đàn gia cầm tại 8 tỉnh, thành thực hiện khảo sát chiếm khoảng 18,25% tổng đàn gia cầm trong cả nước và cần thiết phải xây dựng vùng an toàn dịch bệnh đối với bệnh Cúm gia cầm. Để xây dựng các biện pháp phòng, chống và kiểm soát tốt, hiệu quả đối với bệnh Cúm gia cầm đòi hỏi phải có thông tin cập nhật các chủng vi-rút Cúm gia cầm đang lưu hành và đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc-xin đối với các chủng vi-rút Cúm gia cầm đang lưu hành trên thực địa. Vắc-xin đa giá, phối hợp các chủng vi-rút khác nhau, là một giải pháp có thể gia tăng hiệu quả bảo hộ của vắc-xin Cúm gia cầm đối với các biến chủng khác nhau, đối phó tình hình lưu hành phức tạp các biến chủng vi-rút Cúm gia cầm tại Việt Nam, bao gồm các nhánh 1.1, 2.3.2.1 a, 2.3.2.1 b, 2.3.2.1 c và vi-rút Cúm A/H5N6. Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài được thực hiện với: Giới hạn nghiên cứu: - Đánh giá tình hình lưu hành, kiểu di truyền và mối liên hệ di truyền giữa các chủng vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và 7 tỉnh lân cận (Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Dương, Bà Rịa - Vũng Tàu, Long An, Tiền Giang, Bến Tre). - Hiệu quả miễn dịch của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 trên gà, vịt và vịt trời. Mục tiêu nghiên cứu:
3 - Đánh giá tình hình lưu hành vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và 7 tỉnh lân cận, phục vụ cho công tác quản lý, kiểm soát lây truyền vi- rút Cúm gia cầm A/H5N1 trong khu vực khảo sát; - Xác định một số đặc điểm lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh Cúm gia cầm tuýp A H5N1 góp phần định hướng trong chẩn đoán lâm sàng và phi lâm sàng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1, giúp nâng cao hiệu quả công tác phòng chống bệnh Cúm gia cầm A/H5N1; - Xác định phả hệ các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành và sự tương đồng di truyền với chủng vi-rút sử dụng trong thành phần vắc-xin Navet-Fluvac 2, góp phần làm rõ hơn sự tiến hoá của vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, cung cấp cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu dịch tễ và vắc-xin phòng bệnh do vi-rút Cúm gia cầm A/H5N1, trong khu vực khảo sát, cũng như ở Việt Nam và trên thế giới; - Đánh giá khả năng bảo hộ trên đàn gia cầm sau khi tiêm phòng vắc-xin Navet- Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 phục vụ cho chiến lược tiêm phòng kiểm soát bệnh Cúm gia cầm A/H5N1 trên đàn gia cầm tại khu vực khảo sát. Ý nghĩa của Luận án Đây là công trình nghiên cứu khoa học về tình hình lưu hành các chủng vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1 tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận giai đoạn 2013 - 2015; xác định tính tương đồng về di truyền giữa các chủng vi-rút Cúm gia cầm lưu hành với các chủng vi-rút sử dụng để làm vắc-xin Navet-Fluvac 2. Đánh giá được hiệu quả của vắc-xin Navet-Fluvac 2 đối với vi-rút Cúm gia cầm tuýp A/H5N1, clade 2.3.2.1 trên gà, vịt và vịt trời. Kết quả nghiên cứu của Luận án đã góp phần khẳng định hiệu quả của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trong thực tiễn và đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép lưu hành, sử dụng trong cả nước. Những điểm mới của Luận án - Xác định được phân nhánh vi-rút Cúm gia cầm H5N1 lưu hành và gây bệnh tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận trong giai đoạn nghiên cứu chủ yếu thuộc nhánh 2.3.2.1c và 1.1.
4 - Đánh giá được hiệu quả phòng bệnh Cúm gia cầm của vắc-xin Navet-Fluvac 2 trên đàn gia cầm đối với các chủng vi-rút Cúm gia cầm độc lực cao, phân nhóm mới hiện diện ở miền Nam Việt Nam: vi-rút Cúm gia cầm 2.3.2.1 phân nhóm a, b, c, bằng phương pháp công cường độc và phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể. - Công trình đầu tiên nghiên cứu về khả năng bảo hộ của vắc-xin phòng bệnh Cúm gia cầm trên vịt trời. Vịt trời được tiêm phòng vắc-xin Navet-Fluvac 2 có khả năng phòng bệnh tốt với vi-rút Cúm gia cầm phân nhánh 2.3.2.1c, hiện đang lưu hành chủ yếu tại khu vực các tỉnh phía Nam.
5 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về vi-rút Cúm gia cầm Vi-rút Cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, là vi-rút RNA sợi âm, đa hình thái, kích thước 80 - 120 nm. Dựa trên cấu trúc kháng nguyên của protein bề mặt HA và NA, vi-rút Cúm A được phân chia thành 18 subtype HA và 11 subtype NA, trong đó tác nhân gây bệnh Cúm ở gia cầm chủ yếu là các subtype H5, H7 và H9 (CDC, 2020). Kháng nguyên HA (Haemagglunitin) và NA (Neuraminidase) có vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh của vi-rút Cúm A. HA và NA là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi-rút vào tế bào cảm nhiễm, phân bố không đồng đều trên bề mặt vỏ (tỉ lệ khoảng 1NA/ 4HA). HA là protein gây ngưng kết hồng cầu và NA có chức năng là enzyme phá hủy liên kết của vi-rút với thụ thể trên tế bào vật chủ. (Wagner và ctv., 2002). Vật chất di truyền của vi-rút cúm A là RNA có độ dài 13.500 nucleotit với 8 phân đoạn riêng biệt (PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M và NS) mã hóa cho 11 protein của vi-rút, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 (Ito và ctv., 1998; Conenello và ctv., 2007). Phân đoạn 1 (gien PB2 - polymerase basic 2) có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của vi-rút, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA. Protein PB2 có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa. Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí axít amin 627 ở protein PB2 (ở vi-rút Cúm gia cầm, vị trí này là Glu - thích ứng nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn ở vi-rút cúm trên người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 37oC) (Wasilenko và ctv., 2008).