Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:200

Thêm vào BST

Báo xấu

130
lượt xem 27
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là xác định đƣợc đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam và dòng, giống lạc kháng bệnh bằng đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử làm cơ sở phòng chống bệnh có hiệu quả.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------  ---------- NGỌ VĂN NGÔN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, NĂM 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------  ---------- NGỌ VĂN NGÔN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62.62.01.12 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Nguyễn Văn Viết 2. TS. Hà Viết Cƣờng HÀ NỘI, NĂM 2015
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện. Công trình đƣợc thực hiện trong thời gian từ năm 2012-2014. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, chƣa từng bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Luận án có sử dụng kết quả của đề tài khoa học “Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng kỹ thuật chỉ thị ADN” do PGS.TS. Nguyễn Văn Viết - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam làm chủ nhiệm đề tài phối hợp với Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm. Phần kết quả nghiên cứu này đã đƣợc những ngƣời cùng tham gia thực hiện cho phép công bố trong luận án. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận án Ngọ Văn Ngôn
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc, Ban Đào tạo sau đại học, các quý thầy, cô giáo của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Văn Viết và TS. Hà Viết Cƣờng, những ngƣời thầy tâm huyết đã tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hƣớng khoa học cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm; Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các địa phƣơng tác giả thu thập số liệu, quý thầy cô, cán bộ nghiên cứu, các phòng, bộ môn của đơn vị đã có nhiều ý kiến đóng góp và tạo điều kiện giúp đỡ quý báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, tác giả các công trình công bố đã trích dẫn trong luận án vì đã cung cấp nguồn tƣ liệu quý báu, những kiến thức liên quan trong quá trình tác giả nghiên cứu hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo UBND Thành phố Hà Nội, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Hà Nội; Chi cục Phát triển nông thôn Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ về thời gian và tài chính để tác giả hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án. Cuối cùng, với tình yêu từ đáy lòng, tác giả xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ, vợ, con cùng các anh, chị, em của tác giả, những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên về vật chất và tinh thần để tác giả vững tâm hoàn thành luận án của mình. Xin chân thành cảm ơn. Tác giả luận án Ngọ Văn Ngôn
iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các bảng viii Danh mục các hình xi MỞ ĐẦU 1 1 Tính cấp thiết của đề tài 1 2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4 5 Những đóng góp mới của luận án 5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 6 1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 6 1.1.2 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam 7 1.2 Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc 8 1.3 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 10 1.4 Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 11 1.5 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R. solanacearum 12 1.5.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo 12 1.5.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum 13 1.5.3 Phƣơng thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum 14 1.5.4 Ảnh hƣởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 15 1.5.5 Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh 16 1.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc 17 1.6.1 Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum 17 1.6.2 Chủng 18
iv 1.6.3 Loài phức 19 1.6.4 Kiểu gây bệnh 19 1.6.5 Kiểu quan hệ phả hệ 19 1.7 Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 20 1.7.1 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh 20 1.7.2 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 22 1.8 Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 25 1.8.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống kháng bệnh 25 1.8.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 28 CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Nội dung nghiên cứu 36 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 2.3 Vật liệu nghiên cứu 37 2.4 Môi trƣờng, hóa chất dùng trong nghiên cứu 39 2.4.1 Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong phân lập vi khuẩn, phản ứng sinh hóa 39 2.4.2 Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong PCR 40 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.5.1 Phƣơng pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng 40 2.5.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 41 2.5.3 Phƣơng pháp thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc 41 2.5.4 Phƣơng pháp xác định biovar của vi khuẩn R.solanacearum 42 2.5.5 Phƣơng pháp thí nghiệm một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn R. solanacearum thuộc các biovar khác nhau gây bệnh héo xanh hại lạc 43 2.5.6 Phƣơng pháp phân tích ADN 44
v 2.5.7 Phƣơng pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK của nguồn vật liệu 48 2.5.8 Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng đánh giá tập đoàn và so sánh giống 49 2.5.9 Chỉ tiêu theo dõi 50 2.5.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 51 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 52 3.1.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 52 3.1.2 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 54 3.1.3 Phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 55 3.1.4 Thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 58 3.2 Nghiên cứu biovar và đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 60 3.2.1 Xác định biovar, nòi một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 60 3.2.2 Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc thuộc các biovar khác nhau 63 3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum bằng phân tích ADN 67 3.2.4 Sự phân bố các biovar và đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 72 3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn mẫu giống lạc, dòng lai và dòng triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng, giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78 3.3.1 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc mẫu giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78
vi 3.3.2 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 92 3.3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 101 3.3.4 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc ƣu tú bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 109 3.3.5 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 115 3.3.6 Kết quả khảo nghiệm Quốc gia giống lạc triển vọng 125 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128 1 Kết luận 128 2 Đề nghị 129 Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 130 Tài liệu tham khảo 131 Phụ lục 144
vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ STT Ký hiệu, chữ viết Diễn giải ký hiệu, chữ viết tắt và thuật ngữ tắt và thuật ngữ o 1 C Nhiệt độ (độ C) 2 l Microliter 3 ADN Deoxy Nucleic Acid 4 Biovar Thứ sinh học 5 Bp base pair (cặp bazơ) 6 BVTV Bảo vệ thực vật 7 Cs Cộng sự 8 CT Công thức 9 ĐC Đối chứng 10 g Gram 11 HXVK Héo xanh vi khuẩn 12 ICRISAT International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics (Viện Nghiên cứu Cây trồng cho vùng nhiệt đới bán khô hạn Quốc tế) 13 Isolate Mẫu thu thập 14 NXB Nhà xuất bản 15 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 16 R. solanacearum Ralstonia solanacearum 17 Race Nòi 18 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình ADN đƣợc nhân bội ngẫu nhiên) 19 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn) 20 SPA Sucrose Peptone Agar 21 SSR Simple Sequence Repeat (Trình tự lặp lại đơn giản) 22 Strain Chủng 23 STT Số thứ tự 24 TLB Tỷ lệ bệnh 25 TZCA Tetrazolium Chloride Agar
viii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Giá trị sản xuất và sản lƣợng lạc của một số nƣớc đứng đầu thế giới (niên vụ 2011/2012) 6 1.2 Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc của Việt Nam (năm 2002 - 2012) 7 1.3 Một số thông tin về mức độ giảm năng suất lạc do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra ở châu Á 8 2.1 Trình tự các chỉ thị phân tử SSR liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn 38 2.2 Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 39 2.3 Phản ứng xác định biovar vi khuẩn R. solanacearum 43 2.4 Mức độ chống chịu bệnh HXVK hại lạc 49 3.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, vụ Xuân năm 2012 53 3.2 Đặc điểm hình dạng, màu sắc khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn R. solanacearum trên môi trƣờng nhân tạo sau nuôi cấy 72 giờ 56 3.3 Kết quả kiểm tra phản ứng siêu nhạy của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 58 3.4 Kết quả xác định biovar của 61 isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012-2013) 60 3.5 Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 64 3.6 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trƣờng SPA (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 65 3.7 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trƣờng SPA (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 66
ix 3.8 Mức độ đa hình của 10 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân tích với các isolate vi khuẩn R. solanacearum (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 68 3.9 Phân bố biovar vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 73 3.10 Phân bố của các nhóm vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 74 3.11 Biovar và nhóm đa dạng di truyền của các mẫu bệnh ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 75 3.12 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK của tập đoàn mẫu giống lạc (Thanh Trì, năm 2012 - 2013) 79 3.13 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2013) 84 3.14 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2012-2013) 87 3.15 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực của thu một số mẫu giống lạc trong tập đoàn (năm 2012-2013) 91 3.16 Đánh khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Thanh Trì, năm 2014) 92 3.17 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 95 3.18 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 98 3.19 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc từ tổ hợp lai đơn (năm 2014) 101 3.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Thanh Trì, năm 2013-2014) 102 3.21 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 104
x 3.22 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy 106 3.23 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc từ tổ hợp lai hồi quy (năm 2013-2014) 108 3.24 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc ƣu tú (Thanh Trì, năm 2014) 109 3.25 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc ƣu tú (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 112 3.26 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc ƣu tú (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 113 3.27 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc ƣu tú (năm 2014) 115 3.28 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc triển vọng (Thanh Trì, năm 2013-2014) 116 3.29 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc triển vọng (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 119 3.30 Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc triển vọng 120 3.31 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 121 3.32 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013-2014) 122 3.33 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng (năm 2013-2014) 124 3.34 Tình hình bệnh hại chính và khả năng chịu hạn của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) 125 3.35 Năng suất của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) 126
xi DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên đồng ruộng năm 2012 55 3.2 Hình thái vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh trên (A)- môi trƣờng TZC; (B) - môi trƣờng SPA; (C) và (D)- bảo quản nguồn vi khuẩn 57 3.3 Thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 59 3.4 Xác định biovar các isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 62 3.5 Kết quả tách chiết ADN một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 67 3.6 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum với mồi OPB7 69 3.7 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum với mồi OPC2 69 3.8 Quan hệ di truyền giữa các isolate vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 70 3.9 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhân tạo (năm 2013) (A: sau lây 30 ngày; B: sau lây 45 ngày) 81 3.10 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 25 mẫu giống lạc 82 3.11 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR Chỉ thị GA161 với 25 mẫu giống lạc 82 3.12 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 25 mẫu giống lạc 83 3.13 Thí nghiệm tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013) 89 3.14 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 16 dòng, giống lạc 110 3.15 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16 dòng, giống lạc 111
xii 3.16 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16 dòng, giống lạc 111 3.17 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 16 dòng, giống lạc 117 3.18 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16 dòng, giống lạc 118 3.19 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16 dòng, giống lạc 118 3.20 Giống lạc L28 và L29 124
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày thuộc họ đậu, có nguồn gốc ở Nam Mỹ và đƣợc trồng ở trên 100 quốc gia thuộc cả 6 châu lục. Lạc là cây trồng có giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp đứng thứ 2 trong các cây lấy dầu thực vật. Sản phẩm chế biến từ lạc rất đa dạng, trong đó chủ yếu từ hạt. Hạt lạc là nguồn nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế biến và khô dầu. Bên cạnh giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế, cây lạc còn có thể trồng xen, trồng gối với những cây trồng khác góp phần cải tạo đất, chuyển dịch cơ cấu cây trồng nông nghiệp tăng thêm nguồn thu nhập cho ngƣời sản xuất. Ở Việt Nam, lạc đang là một trong số các mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng. Ngoài ra, lạc còn là cây trồng có khả năng thích ứng rộng, không đòi hỏi đầu tƣ phân bón cao do bộ rễ có khả năng cố định đạm, tạo ra lƣợng đạm sinh học cung cấp cho cây và làm tăng độ phì cho đất. Hiện nay, lạc là cây họ đậu chính tham gia vào các công thức luân canh, xen canh mang tính bền vững và thân thiện với môi trƣờng. Trong hơn 100 quốc gia trồng lạc trên thế giới, Việt Nam đứng thứ 10 về diện tích và trong 25 nƣớc trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích gieo trồng sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma và Indonesia (FAO, 2013). Tại Việt Nam, mặc dù có nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên nhƣng năng suất và sản lƣợng lạc tăng chƣa tƣơng xứng với tiềm năng. Nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các địa phƣơng trồng lạc, đặc biệt là vùng đất trồng lạc nhờ nƣớc trời nhƣ đất đồi gò, đất bãi ven sông thƣờng bị bệnh gây hại, trong đó bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là đối tƣợng gây hại nặng trên cây lạc. Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng trồng lạc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Mỹ, Nhật Bản, Papua New Guinea, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Trung Quốc, Uganda, Việt Nam,… (He, 1986; Hayward, 1990; Mehan et al., 1994; Lam và Hamidah, 1995). Bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên cây lạc với tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5% đến 20% (Mehan et al., 1986), thậm chí có những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể tới 100% (Tan et al., 1994).
2 Ở Việt Nam, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc coi là bệnh hại phổ biến ở nhiều tỉnh trồng lạc trong cả nƣớc nhƣ: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh,... (Mehan và cs., 1991; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lƣơng Tề, 1997a). Bệnh gây hại nghiêm trọng ở một số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động trong khoảng 15% đến 35% và ở vùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là từ 20% đến 30%. Năm 1896 nhà bác học Smith là ngƣời đã phát hiện vi khuẩn R. solanacearum gây ra bệnh héo xanh (Hayward, 1990). Bệnh HXVK gây hại nặng ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và các vùng có nhiệt độ ấm áp. Phạm vi ký chủ của bệnh rộng, gây hại trên 400 loài cây trồng thuộc 80 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong hạt giống, trong đất và cỏ dại, chính vì vậy việc phòng chống bệnh gặp nhiều khó khăn. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở trong nƣớc và trên thế giới nhƣ biện pháp luân canh, sinh học, hóa học, bằng giống kháng bệnh... Tuy nhiên sử dụng giống lạc kháng bệnh là biện pháp chủ động và có hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn (Liao, 2005a). Trong thời gian qua, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật đã chọn tạo thành công một số giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn nhƣ giống MD7 và giống TK10 phát triển ở một số vùng thƣờng bị bệnh gây hại góp phần hạn chế tác hại của bệnh. Tuy nhiên, các giống này sản xuất liên tục trong thời gian dài nên bị thoái hóa, năng suất và khả năng kháng bệnh giảm dần. Công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở nƣớc ta đã đạt đƣợc những kết quả đáng khích lệ, tuy nhiên chủ yếu theo phƣơng pháp truyền thống nên hiệu quả tích lũy các gen kháng bệnh vào con lai còn khó khăn và mất thời gian dài. Đến nay ở nƣớc ta chƣa có nghiên cứu nào về sử dụng chỉ thị phân tử để chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn đƣợc công bố. Các nghiên cứu mới chỉ khảo sát đánh giá mức độ kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của mẫu giống lạc bằng quan sát, đánh giá bệnh trong điều kiện nhân tạo và đánh giá ở các khu vực có nguồn bệnh trong điều kiện sản xuất.
3 Để rút ngắn thời gian trong việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, ứng dụng chỉ thị phân tử là con đƣờng ngắn và hiệu quả, không những góp phần hạn chế tác hại của bệnh mà còn hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong phòng chống bệnh, bảo vệ môi trƣờng và tạo sự đa dạng sinh học đối với cây lạc (Liao et al., 2005b; Peng et al., 2011; Ding et al., 2012). Trong chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử, cần xác định biovar, nòi và đánh giá đa dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc đồng thời phải chọn lọc đƣợc nguồn vật liệu các dòng, giống lạc mang gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử, từ đó làm cơ sở chọn tạo ra các dòng, giống lạc mới mang gen kháng với biovar, nòi vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc phổ biến ở các vùng sản xuất. Nhằm giải quyết đƣợc các yêu cầu quản lý bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trong sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” mang tính thời sự cấp thiết. 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2.1. Mục tiêu Xác định đƣợc đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam và dòng, giống lạc kháng bệnh bằng đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử làm cơ sở phòng chống bệnh có hiệu quả. 2.2. Yêu cầu Điều tra xác định đƣợc mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Xác định đƣợc biovar, nòi và đặc điểm sinh học một số isolate vi khuẩn R. solanacearum thu thập ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Đánh giá đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Đánh giá đƣợc khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn giống, con lai và dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử.
4 Trên cơ sở chọn lọc các dòng, giống kháng bệnh và đánh giá một số đặc điểm nông học chính, xác định đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh, có năng suất cao để phát triển trong sản xuất. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thông tin khoa học mới về đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Cung cấp tƣ liệu khoa học mới về áp dụng phƣơng pháp sinh học phân tử kết hợp với đánh giá bệnh nhân tạo nguồn vật liệu và dòng, giống lạc kháng bệnh cho chọn tạo, phát triển giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Từ kết quả xác định đƣợc sự phân bố biovar, đa dạng di truyền các isolate vi khuẩn R. solanacearum ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam làm cơ sở bố trí giống kháng bệnh. Xác định đƣợc vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc ở miền Bắc Việt Nam thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Một số mẫu giống lạc nhƣ L28, L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao có thể sử dụng trong quản lý cây trồng tổng hợp nhằm sản xuất lạc hiệu quả, bền vững. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu Loài vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc. Một số mẫu giống lạc trong tập đoàn, dòng lai, dòng triển vọng và giống lạc đƣợc trồng ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam là ký chủ của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Đề tài thực hiện tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm. Nghiên cứu tập trung vào điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng; xác định đa dạng di truyền, đặc điểm sinh học một số isolate vi
5 khuẩn R. solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam; đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn và chọn lọc các dòng, giống lạc kháng bệnh bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chỉ thị phân tử. 5. Những đóng góp mới của luận án Luận án bổ sung các tƣ liệu khoa học mới về bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đặc biệt là phòng chống bằng giống kháng bệnh; sử dụng thành công phƣơng pháp sinh học phân tử kết hợp phƣơng pháp truyền thống trong xác định đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum và chọn lọc giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. Ứng dụng thành công đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp với chỉ thị phân tử SSR là pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn chọn lọc đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh HXVK và có năng suất cao gồm 26 mẫu giống trong tập đoàn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng cao), 07 dòng từ tổ hợp lai đơn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-41,6 tạ/ha), 14 dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi quy (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,4-40,6 tạ/ha), 13 dòng lạc ƣu tú (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 36,6-40,5 tạ/ha) và 04 dòng lạc triển vọng (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-37,8 tạ/ha) để làm vật liệu chọn tạo và phát triển giống kháng bệnh. Xác định đƣợc 2 giống lạc triển vọng gồm L28 và L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao đã đƣợc khảo nghiệm Quốc gia để phát triển trong sản xuất.
6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tƣơng trong số các cây trồng lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lƣợng) và đƣợc trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia trên thế giới. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng Thế giới (FAO, 2013), các nƣớc có sản lƣợng lạc lớn nhất trong niên vụ 2011/2012 là Trung Quốc, Ấn Độ, Nigeria và Mỹ (bảng 1.1). Bảng 1.1. Giá trị sản xuất và sản lượng lạc của một số nước đứng đầu thế giới (niên vụ 2011/2012) Tên nƣớc Giá trị sản xuất (USD) Sản lƣợng (tấn) Trung Quốc 7.388,368 16.800,000 Ấn Độ 2.452,413 5.779,000 Nigeria 1.308,585 3.070,000 Mỹ 1.334,413 3.057,850 Myanmar 551,522 1.371,500 Tanzania 348,380 810,000 Indonesia 315,292 712,874 Argentina 299,808 685,722 Senegal 285,484 672,803 Cameroon 242,354 570,000 Nguồn: FAO (2013). Năng suất lạc trung bình toàn thế giới tăng, song cũng không đều giữa các vùng lãnh thổ, vùng tăng nhiều, vùng tăng ít, thậm chí nhiều nơi diện tích và năng suất lạc đều giảm. Năng suất lạc thế giới trong niên vụ 2011/2012 trung bình đạt 1,57 tấn/ha (FAO, 2013). Trong niên vụ 2011/2012 về sản lƣợng lạc, Trung Quốc là nƣớc đứng đầu với 16,8 triệu tấn, tiếp theo là Ấn Độ với 5,78 triệu tấn và Việt Nam là nƣớc đứng thứ 12 với sản lƣợng 0,47 triệu tấn. Trung Quốc có giá trị sản xuất lạc lớn nhất thế