Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:129

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là phân tích được đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu tương Việt Nam có khả năng chịu hạn khác nhau. Biểu hiện được protein tái tổ hợp và chức năng sinh học của gen chuyển GmDREB2 trên cây thuốc lá chuyển gen. Tạo cây đậu tương chuyển gen và biểu hiện được protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây đậu tương chuyển gen.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng quan trọng hàng đầu ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Việc tiêu thụ đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương đang gia tăng trên toàn thế giới do những tác dụng có lợi tới sức khỏe của con người, như phòng chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tiểu đường và béo phì, hạ cholesterol và bảo vệ rối loạn thận. Hạt đậu tương là nguồn cung cấp dồi dào protein (32%-52%), lipid (12%-25%), vitamin (B1, B2, C, D, E...), nhiều amino acid thiết yếu (lysine, tryptophan, methionine, cysteine và leucine), chất xơ, năng lượng và các chất chuyển hóa thứ cấp. Vì vậy, hạt đậu tương được sử dụng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến, mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh tế cao. Không chỉ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh tác. Gần đây, một trong những ứng dụng được quan tâm nhiều nhất của cây đậu tương là sản xuất dầu diesel sinh học. Đậu tương được xem là cây trồng nhạy cảm với hạn. Hạn là yếu tố phi sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất và có thể làm giảm năng suất cây đậu tương khoảng 40%. Hạn ảnh hưởng đến tất cả các thời kì sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương, trong đó thời kì ra hoa và thời kì sau ra hoa đã được chứng minh là những thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. Hiện nay, do những biến đổi về khí hậu, đặc biệt là hạn kéo dài, lượng mưa không đều ở các thời điểm trong năm và giữa các vùng miền gây khó khăn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều quốc gia, tại Việt Nam cũng không tránh khỏi những tác động tiêu cực đó. Hơn nữa, Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc, khả năng giữ nước kém nên việc canh tác các cây trồng nói chung và cây đậu tương
2 nói riêng gặp rất nhiều khó khăn. Do đó, việc chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết, mang tính thời sự ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Tính chịu hạn của cây đậu tương do nhiều gen quy định, sản phẩm của các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chịu hạn hoặc có chức năng điều hoà nhóm gen chịu hạn. Một số gen của đậu tương đã được mô tả là có phản ứng với tác động của hạn ở mức phiên mã. Trình tự cis và nhân tố trans giữ vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng tác động của hạn. Các protein DREB - Những nhân tố có tác động trans liên kết với các trình tự cis để kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu khi có tín hiệu stress ở thực vật. Việc cải thiện đặc tính di truyền của cây đậu tương để thích nghi với hạn được các nhà khoa học tiếp cận theo nhiều hướng: Lai hữu tính, gây đột biến thực nghiệm, chọn lọc quần thể, công nghệ tế bào, công nghệ gen. Trong đó, công nghệ gen được xem là biện pháp đem lại hiệu quả cao. Gần đây, đã có những tiến bộ trong việc cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương thông qua các kỹ thuật tác động vào nhân tố phiên mã hoặc yếu tố tín hiệu ở cây trồng chuyển gen. Tuy nhiên ở nước ta, một số nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chuyển các gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn vào cây đậu tương, ít thấy công bố kết quả hoàn chỉnh về chuyển gen mã hóa protein là nhân tố kích hoạt quá trình phiên mã, trong đó có gen GmDREB2. Do đó, việc nghiên cứu đặc tính phân tử, xác định chức năng gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới tính chịu hạn, cũng như việc chuyển các gen này từ các giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt sang giống có khả năng chịu hạn kém đang trở thành hướng nghiên cứu triển vọng, nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học ở trong và ngoài nước. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án: "Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)".
3 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Phân tích được đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu tương Việt Nam có khả năng chịu hạn khác nhau. 2.2. Biểu hiện được protein tái tổ hợp và chức năng sinh học của gen chuyển GmDREB2 trên cây thuốc lá chuyển gen. 2.3. Tạo cây đậu tương chuyển gen và biểu hiện được protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây đậu tương chuyển gen. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương. Phân tích tính đa dạng trong trình tự nucleotide và protein của gen GmDREB2 ở cây đậu tương. 3.2. Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc mang gen GmDREB2. 3.3. Nghiên cứu chuyển gen và phân tích biểu hiện gen GmDREB2 trên cây thuốc lá: (i) Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2. (ii) Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trong cây thuốc lá. (iii) Đánh giá khả năng chịu hạn của các cây thuốc lá chuyển gen. 3.4. Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào cây đậu tương và phân tích cây đậu tương chuyển gen. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống, từ việc phân lập, tách dòng phân tử gen GmDREB2 đến thiết kế vector chuyển gen, tạo cây chuyển gen và phân tích sự biểu hiện gen chuyển GmDREB2, cụ thể là: (1) Gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương có kích thước 480 nucleotide, mã hóa cho 159 amino acid. Các trình tự gen GmDREB2 đã được đăng ký trên
4 Ngân hàng Gen mang các mã số: LK936507, LK936508, LK936509, HG965097, HG965098, HG965099. (2) Protein tái tổ hợp GmDREB2 biểu hiện mạnh trên cây thuốc lá chuyển gen. Khi bị hạn, ở các dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng prolin tăng từ 211,17% - 332,44% sau 5 ngày bị stress hạn và tăng từ 262,79% - 466,04% sau 9 ngày bị stress hạn. (3) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang gen GmDREB2 và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp GmDREB2 trên giống đậu tương DT84. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 5.1. Về mặt khoa học Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen GmDREB2 phân lập từ 6 giống đậu tương Việt Nam (DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐT51, ĐVN5). Những cơ sở khoa học của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc tăng cường protein tái tổ hợp GmDREB2 và biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmDREB2 trên cây thuốc lá và cây đậu tương. Những kết quả bước đầu về tạo cây chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong mục đích nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở Việt Nam. Các bài báo công bố trên các tạp chí Khoa học - Công nghệ quốc tế và ở trong nước, cùng với 6 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tư liệu tham khảo có giá trị trong việc nghiên cứu, giảng dạy sinh học và công nghệ sinh học. 5.2. Về mặt thực tiễn Các trình tự gen GmDREB2 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen GmDREB2, các cây thuốc lá chuyển gen tạo được có khả năng
5 chịu hạn tốt hơn so với cây đối chứng, các cây đậu tương chuyển gen đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương nói riêng và các cây trồng khác nói chung, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam.
6 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 1.1.1. Cơ chế chịu hạn của thực vật Stress phi sinh học là nguyên nhân chính dẫn đến mất mùa trên toàn thế giới, gây thiệt hại đến năng suất bình quân hơn 50% ở các loại cây trồng chính [18]. Trong số các stress phi sinh học, hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất cây trồng. Stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội môi và phân bố ion trong tế bào [197]. Cây trồng phản ứng với các stress hạn thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào như sản xuất protein stress, tăng cường các chất chống oxi hóa, tích lũy các chất tan [36]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, hạn gây ra những tác động tiêu cực tới tất cả các cấp độ và các giai đoạn phát triển của thực vật. Để chống chịu với các stress hạn, thực vật phải thực hiện thông qua chuỗi các quá trình, với sự tham gia của rất nhiều yếu tố. Khi có hạn, các phản ứng sinh hóa khác nhau được kích hoạt trong cây trồng để tích lũy nhiều loại chất dễ hòa tan, như đường, amino acid, glycine betaine và polyamine để giúp các cây trồng đối phó với hạn [71], tăng lượng chất chống oxy hóa khác nhau, chẳng hạn như glutathione S-transferase (GST), superoxide dismutase (SOD), guaiacol peroxidase (POD) và catalase (CAT) chống lại điều kiện oxy hóa để phục hồi sau một thời gian nhất định bị hạn [12]. Gần đây, những tiến bộ trong việc hiểu biết về biểu hiện gen, cơ chế phiên mã và việc truyền tín hiệu phản ứng với stress hạn của cây trồng đã được công bố [198]. Mặt khác, phân tích sinh học phân tử và di truyền học đã tạo điều kiện thuận lợi cho những khám phá về chức năng gen [155], [170] và được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền với việc sử dụng một số gen chức năng hoặc một số gen điều hòa để kích hoạt các cơ chế liên quan đến tính chịu hạn, chịu mặn của cây trồng [176]. Vì vậy, cơ sở phân tử đặc tính chịu hạn của thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng cũng dần được sáng tỏ. Các gen phản ứng với
7 stress hạn có thể chia thành 2 nhóm chính: Nhóm gen chức năng mà sản phẩm của chúng tham gia trực tiếp vào các phản ứng stress hạn như gen điều hòa áp suất thẩm thấu [167], gen mã hóa các protein chống oxi hóa [100], gen mã hóa protein LEA (Late embryogenesis abundant) [181], gen mã hóa protein vận chuyển LTP (Lipid trasfer protein) [111], aquaporin [48]; nhóm gen điều khiển cho ra các sản phẩm bao gồm các nhân tố phiên mã và các protein kinase truyền tin. Các nhân tố phiên mã liên quan đến khả năng chịu hạn đang được quan tâm nghiên cứu bao gồm DREB [24], WRKY [193], [195], bZIP (Basic leucine zipper) [54], MYB (Myeloblastosis oncogene) [90], [103], NCED (Nine-cis- epoxycarotenoid dioxygenase) [137] và AP2/ERF [193]. Các protein kinase truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc Ca2+ [80], MAPK (Mitogen activated protein kinase) [112], RPK (Receptor-like protein kinase) [29], PIK (Phophatidyl inositol kinase) [185] và protein kinase serine/threonine [102] (Hình 1.1). Hình 1.1. Cơ chế chịu hạn của thực vật
8 Sự biểu hiện của các gen cảm ứng với hạn liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Vì vậy, sự biểu hiện của các gen này chịu ảnh hưởng rất nhiều của môi trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa. Các nhân tố phiên mã (Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều khiển quan trọng của những thay đổi trong biểu hiện gen và phản ứng với các stress môi trường. Có thể thấy rõ ở cây trồng, các gen mã hóa nhân tố phiên mã chiếm một phần lớn trong hệ gen. Ví dụ, ở cây Arabidopsis có đến 1500 TF trong hệ gen [140]. Cả hai loại: Nhân tố kích hoạt và ức chế quá trình phiên mã đã được sử dụng để nâng cao khả năng chịu hạn cho cây trồng, hầu hết các gen này đã được xác định và phân tích ở cây Arabidopsis [19]. Hiện nay, các protein DREB (một trong bốn phân họ lớn của họ AP2/ERF) là nhóm TF được nghiên cứu thành công nhất trong điều kiện phi sinh học, bởi vì nó kích hoạt sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan [71]. Wang và cs (2009) đã xác định được trong cây Arabidopsis có 474 gen mục tiêu mà các nhân tố phiên mã DREB tác động [183]. Trong số những gen này, có 160 gen có đáp ứng với stress phi sinh học và 27 gen cảm ứng với tình trạng thiếu nước [106]. 1.1.2. Họ nhân tố phiên mã AP2 Các nhân tố phiên mã có thể được phân chia thành nhiều loại khác nhau dựa trên cấu trúc vùng liên kết của chúng với sợi DNA. Các nhân tố phiên mã như nhân tố có tác động trans và trình tự cis giữ vai trò trung tâm hoạt hóa promoter trong biểu hiện của các gen mục tiêu. Kết quả những phân tích về hoạt hóa promoter phản ứng với điều kiện bất lợi, trình tự cis và nhân tố có tác động trans liên quan đến phản ứng của các gen với điều kiện bất lợi đã được xác định [178]. Họ AP2/ERF là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm bốn phân họ lớn: AP2 (APETALA 2), RAV (RelatedtoABI3/VP1), ERF (Ethylene-responsive element binding factor) và DREB (Dehydration responsive element binding ) [148].
9 1.1.2.1. Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF Họ AP2/ERF là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã có chứa miền AP2/ERF. Ở cây Arabidopsis chứa 145 locus gen mã hóa các nhân tố phiên mã của họ AP2/ERF [148] và ở lúa có 167 locus [152]. Miền AP2/ERF lần đầu tiên được tìm thấy ở Arabidopsis homeotic APETALA 2 [74]. Tương tự, miền này cũng tìm thấy ở cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), đó là yếu tố phản ứng với ethylene (EREBPs) [124]. Miền AP2/ERF có khoảng 60 amino acid có liên quan chặt chẽ với nhau [184]. Protein thuộc họ AP2/ERF là những nhân tố phiên mã có ở thực vật và người ta cũng tìm thấy ở cả những thực vật bậc thấp như tảo xanh (Chlamydomonas reinhardtii) [157], tương đồng với các miền AP2/ERF ở vi khuẩn. Do đó, có giả thuyết cho rằng các miền AP2/ERF được chuyển từ một loài vi khuẩn Cyanobacterium cộng sinh hoặc từ một loại vi khuẩn hay virus bởi hiện tượng biến nạp gen [98]. Ở đầu N và ở đầu C của miền AP2/ERF có chứa một đoạn xoắn β tương tự như kiểu xoắn α có chức năng nhận biết điểm bám trên promoter [158]. Phân tích mối quan hệ và thiết lập cây phát sinh họ AP2/ERF từ bốn phân họ: Arabidopsis, Selaginella moellendorffii, Physcomitrella patens và Chlamydomonas reinhardtii, mà đại diện tương ứng là thực vật hạt kín, thông đất, rêu và tảo xanh (Hình 1.2). Mỗi nhánh trong cây phát sinh đại diện cho một nhóm và các thành viên của họ AP2/ERF có thể được chia thành ba nhóm dựa trên cấu trúc tổng thể [141]. Phân họ AP2/ERF trong nhóm Arabidopsis gồm 14 thành viên chứa hai miền AP2/ERF, phân họ RAV gồm 6 thành viên có chứa một miền AP2/ERF và thêm một miền B3, trong khi các phân họ khác gồm 125 thành viên chỉ có một miền AP2/ERF [152]. Phân họ AP2/ERF ở thực vật có hạt có thể được chia thành các phân nhóm AP2 và nhóm ANT [13]. Sakuma và cs (2002) đã phân tích mối quan hệ của 125 thành viên chứa duy nhất miền AP2/ERF dựa trên cơ sở miền AP2/ERF của nhóm Arabidopsis.
10 Thông qua phân tích này, 125 thành viên có một miền AP2/ERF được chia thành ba nhóm: Nhóm A gồm 56 thành viên thuộc phân họ DREB, nhóm B gồm 65 thành viên thuộc phân họ ERF và nhóm còn lại gồm 4 thành viên thuộc những phân họ khác. Phân họ DREB được chia thành 6 phân nhóm, từ A-1 đến A-6, phân họ ERF cũng được chia thành 6 phân nhóm, từ B-1 đến B-6. Các DREB1/CBF thuộc phân nhóm A-1 và các DREB2 thuộc phân nhóm A-2 [148]. Nakano và cs (2006) phân tích mối quan hệ của các thành viên chứa duy nhất miền AP2/ERF trong Arabidopsis và lúa, kết quả thu được tương tự như phân loại của Sakuma và cs (2002). Tuy nhiên, ông cho biết thêm phân nhóm A-1 và A-4 cùng nguồn gốc và phân nhóm A-2 và A-3 cùng nguồn gốc [115]. Hình 1.2. Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF ở thực vật có diệp lục [109].
11 Họ nhân tố phiên mã AP2/ERF chỉ có ở thực vật và điều này đặt ra câu hỏi: Chúng đã tiến hóa như thế nào trong lịch sử phát triển của thực vật? Trong sơ đồ cây phát sinh loài ở hình 1.2, P. patens và chi nhánh S. moellendorffii được tìm thấy trong tất cả bốn phân họ lớn và trong một nhánh của AT4G13040 orthologues. Hơn nữa, P. Patens và S. moellendorffii được tìm thấy trong tất cả các phân nhóm, trừ A-1 và B-2. Điều đó chứng tỏ, rêu và thực vật có mạch chung nguồn gốc. Phân nhóm A-1 (DREB1s) có quan hệ gần gũi với phân nhóm A-4 và cùng chung nguồn gốc với phân nhóm A-5. Trong thực tế, người ta không tìm thấy phân nhóm A-1 ở cây hạt trần. Trong cây phát sinh loài ở hình 1.2, C. reinhardtii tìm thấy ở bốn nhánh, hai nhánh trong phân họ ERF và hai nhánh trong phân họ AP2. Điều đó chứng tỏ, trước khi xuất hiện thực vật ở cạn, nhân tố phiên mã AP2/ERF đã chứa một miền AP2/ERF hoặc chứa hai miền AP2/ERF. Ngược lại, người ta chưa tìm thấy phân họ RAV ở C. reinhardtii [109]. 1.1.2.2. Nhân tố phiên mã DREB Từ những năm 80 của thế kỷ XX, các nhà khoa học trên thế giới đã quan tâm nghiên cứu về DREBs, tiến hành giải trình tự gen DREBs trên các loài họ cúc (Asteraceae), hướng dương (Helianthus annuus), lúa mì (Triticum aestivum L.) … và so sánh trình tự gen này của các loài cây trồng và hoang dại cho thấy có sự sai khác giữa chúng [5]. Từ đó, họ đã đề xuất phương án cải thiện khả năng chống chịu thông qua việc cải tiến ở mức phân tử của cơ chế này với điều kiện bất lợi trong môi trường sống, đó là chuyển gen mục tiêu từ loài chống chịu tốt vào loài chống chịu kém. Những gen này bao gồm cả các gen chức năng, như gen mã hóa những chất chuyển hóa khác nhau quan trọng đối với khả năng chịu hạn, hoặc gen mã hóa các nhân tố phiên mã. Đối với cây đậu tương, hướng nghiên cứu này bước đầu đã đạt được những thành công nhất định [6]. Nhiều thành viên phân họ DREB nhạy cảm với điều kiện bất lợi đã được phân lập, mô tả và các nghiên cứu đã khẳng định chúng là những thành tố quan trọng, liên quan đến sự phản ứng với nhân tố phi sinh học ở thực vật bằng cách
12 quy định biểu hiện gen thông qua các trình tự DRE/CRT [188]. Khi phân tích các gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB, các nhà khoa học đã xác định được 36 gen DREB/CBF trong cây nho (Vitis Vinifera) [200], 57 gen trong cây Arabidopsis, 52 gen trong cây lúa (Oryza sativa L.) [115], 77 gen trong cây Populos trichocarpa thuộc họ liễu [199], 36 gen trong cây đậu tương [192]. Một số thành viên của phân họ gen DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [141]. Mỗi gen trong phân họ DREB có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện mạnh khi đậu tương gặp các điều kiện về hạn. Nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn, mặn và lạnh, trong khi nhóm DREB2 có vai trò chủ yếu trong điều khiển tính chịu hạn, chịu nóng. Chen và cs (2004) đã phân lập gen DREB1 từ mRNA của cây đậu tương có kích thước 705 bp [27]. Charlson và cs (2009) đã phân lập được gen DREB1 từ DNA của cây đậu tương cũng có kích thước 705 bp [23]. Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB5 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là 927 bp [25]. Chen và cs (2009) đã phân lập gen GmDREB3 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là 597 bp [26]. Liu và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB6 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là 693 bp [96]... Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu về các gen DREB ở cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng vẫn còn rất mới mẻ, chỉ có một vài công trình công bố về các gen DREB trong những năm gần đây, đó là các nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở cây đậu tương của Chu Hoàng Mậu và cs (2011) [5]. 1.1.2.3. Phân nhóm DREB2 Phân nhóm DREB2 gồm có 8 thành viên ở trong cây Arabidopsis [148] và 5 thành viên trong cây lúa [107]. Phân tích sự phát sinh của các protein DREB2 từ cây Arabidopsis và cây lúa, cũng như các protein liên quan cho thấy, phân nhóm DREB2 liên quan chặt chẽ với phân nhóm A-3, trong đó có ABI4
13 (ABA-Insensitive 4). Phân nhóm DREB2 trong cây Arabidopsis và lúa có thể đều được chia thành ba phân nhóm phụ [107]. Ngoài ra, phân nhóm DREB2 cũng đã được phân lập từ một số loài thực vật hạt kín khác như hướng dương [41], lúa [42], [107], lúa mì [43], [153], lúa mạch (Hordeum vulgare) [187], ngô (Zea mays L) [134]. Hầu hết các gen DREB2 đã được công bố đều cảm ứng với sự mất nước hoặc nhiệt độ cao, nhưng các gen DREB2 từ thực vật thân cỏ còn cảm ứng với lạnh [43], [107], [153]. Điều đáng chú ý là tất cả các DREB2 được phân lập có cảm ứng stress thuộc phân nhóm phụ 1, trong đó bao gồm DREB2A, DREB2B, DREB2C, DREB2E và DREB2H của cây Arabidopsis, cũng như OsDREB2A và OsDREB2B của cây lúa. Điều đó chứng tỏ, phân nhóm phụ 1 mà đại diện là các DREB2 có cảm ứng với các stress. Phân nhóm phụ 2 bao gồm DREB2D, DREB2G ở cây Arabidopsis và OsDREB2C ở cây lúa, trong khi phân nhóm phụ 3 gồm DREB2F ở cây Arabidopsis và OsDREB2E ở cây lúa. Các gen DREB2 ở hai phân nhóm phụ này không có hoặc cảm ứng không đáng kể trước các stress và cũng chưa được phân lập từ các thực vật khác, mặc dù tất cả các loài thực vật hạt kín đều có các gen thuộc 2 phân nhóm phụ này, song vai trò của chúng còn ít được biết đến [107], [148] . Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 được xếp vào phân nhóm A-5 trong phân họ DREB. Gen GmDREB2 được biểu hiện mạnh trong môi trường có hạn, mặn, nhiệt độ thấp và ABA [24]. Trong cây thuốc lá chuyển gen GmDREB2, sự biểu hiện của gen này đã làm tăng sự tích lũy hàm lượng prolin [88]. Trong Ngân hàng Gen, trình tự gen GmDREB2 phân lập từ DNA của cây đậu tương đã được công bố lần đầu tiên bởi Wang và cs (2006) có kích thước 480 bp, mã hóa 159 amino acid, miền AP2 có 59 amino acid (từ vị trí amino acid 34 đến 92) [180]. Gen GmDREB2 ở cây đậu tương có chức năng kích hoạt sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn. Sản phẩm biểu hiện của gen GmDREB2 được tìm thấy khi cây đậu tương gặp hạn, lạnh và mặn. Như vậy, gen
14 GmDREB2 đã được chứng minh là tích cực tham gia vào việc chống chịu với hạn ở cây đậu tương [24], [88], [109]. 1.1.3. Cơ chế tác động của một số nhân tố phiên mã đối với các phản ứng stress phi sinh học ở thực vật Cho đến nay, nhiều nhân tố phiên mã họ AP2/ERF từ các loài thực vật khác nhau đã được chứng minh có liên quan đến phản ứng của stress phi sinh học. Cụ thể, các DREB1/CBF và phân nhóm DREB2 đóng vai trò quan trọng trong việc chống chịu stress bằng cách điều hòa biểu hiện của gen thông qua trình tự DRE/CRT trong các promoter ở những gen nhạy cảm với stress. 1.1.3.1. Hoạt động của nhân tố phiên mã AP2/ERF và các trình tự cis DRE/CRT Các nhân tố phiên mã như DREB1 và DREB2 liên kết với các trình tự cis CBF đã được xác định ở cây Arabidopsis [94], [164]. Những protein thuộc họ AP2/ERF là nhân tố phiên mã đã kích hoạt các gen phiên mã thông qua liên kết với các trình tự DRE/CRT để hoạt hóa promoter của chúng [148], [164]. Các gen DREB1A/CBF3, DREB1B/CBF1 và DREB1C/CBF2 có trong hệ gen của cây Arabidopsis được cảm ứng bởi điều kiện lạnh nhưng không do mất nước hoặc mặn [52], [94], [154]. Sự biểu hiện mạnh của các DREB1/CBF sẽ kích hoạt sự biểu hiện của các gen phản ứng với các strees và cải thiện khả năng chịu lạnh, chịu hạn và chịu mặn của cây Arabidopsis [94]. Ngược lại, DREB2A và DREB2B cảm ứng với tình trạng mất nước, mặn và nhiệt độ cao, không cảm ứng với lạnh [94], [116], [147]. Sự biểu hiện mạnh của DREB2A đã kích hoạt sự biểu hiện của các gen cảm ứng với nhiệt độ cao hoặc sự mất nước, do đó đã cải thiện khả năng chống chịu hạn, chịu mặn, chịu nhiệt độ cao của cây Arabidopsis [147], [146]. Những phát hiện này đã chỉ ra rằng, các DREB1 và DREB2 tham gia vào quá trình thích nghi với stress trong cây Arabidopsis bằng cách kích hoạt phiên mã thông qua liên kết với các trình tự DRE/CRT trong các promoter điều khiển các gen mục tiêu phản ứng với các stress.
15 Cho đến nay, nhiều DREB cảm ứng stress đã được phân lập từ nhiều loại cây trồng, bao gồm các loài thực vật hai lá mầm, như cây cải dầu (Brassica napus) và cà chua (Solanum lycopersicum) [73], các cây một lá mầm như ngô [134], [135], lúa [42], lúa mạch [187] và thậm chí từ cây rêu [93]. Sự tồn tại của những DREB cảm ứng với stress ở các loài thực vật khác nhau đã chỉ ra tầm quan trọng của trình tự cis DRE/CRT và DREBs trong phản ứng stress của thực vật trên cạn. 1.1.3.2. Hoạt động của các phân họ DREB và ERF Phân tích chi tiết các điểm liên kết của DREB1A và DREB2A đã cho thấy, các protein này có ái lực cao nhất đối với trình tự A/GCCGAC của DRE [148]. Hơn nữa, DREB1A có ái lực mạnh với A/GCCGACNT và DREB2A có ái lực mạnh với ACCGAC [104], [146]. Những liên kết chặt chẽ này đã được xác nhận bằng kết quả phân tích các promoter hoạt hóa biểu hiện các gen DREB trong cây chuyển gen [104], [146]. Ngược lại, năm phân họ protein ERF có ái lực lớn nhất với hộp (GCC) của trình tự AGCCGCC trong ERE [46]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, TINY thuộc phân nhóm A-4 của phân họ DREB có thể liên kết với cả DRE và hộp (GCC) [163]. Một phân nhóm protein A DREB2 (A-2) từ lúa mạch (HvDRF1) cũng cho thấy ái lực mạnh với TT/AACCGCCTT [31]. Protein ABI4 từ cây ngô và cây Arabidopsis thuộc về phân nhóm A-3, có liên kết với yếu tố ghép nối CE1 (Coupling Element 1) là các trình tự CACCG và CCAC [83], [120]. 1.1.3.3. Hoạt động của phân nhóm DREB2 Vai trò của nhân tố phiên mã DREB2 trong điều kiện thiếu nước và nhiệt độ cao Trong cây Arabidopsis, gen DREB2A và gen DREB2B được cảm ứng bởi tình trạng mất nước, mặn và nhiệt độ cao [116], [147] (Hình 1.3), trong khi DREB2C được kích hoạt chậm hơn bởi nhiệt độ cao so với DREB2A hoặc DREB2B [91]. Các gen DREB2C, DREB2D và DREB2F cảm ứng với mặn và
16 DREB2E phản ứng với ABA, mặc dù biểu hiện của chúng là rất yếu [148]. Vì vậy, DREB2A và DREB2B dường như là các DREB2 liên quan chính đến tình trạng biểu hiện gen cảm ứng mất nước thông qua trình tự DRE/CRT và độc lập với ABA [116], [148]. Ngược lại với các gen DREB1/CBF, sự biểu hiện mạnh của DREB2A gây ra những thay đổi không đáng kể trong sinh trưởng của thực vật, trong biểu hiện gen hoặc khả năng chịu đựng stress [94]. Sakuma và cs (2006) cho rằng, DREB2A có một vùng điều hòa âm tính (NRD) tiếp giáp điểm liên kết với DNA và tạo thành một phức hợp hoạt động chủ yếu là DREB2A CA. Cây chuyển gen có DREB2A CA thường biểu hiện còi cọc, tăng khả năng chịu hạn và chịu mặn nhưng không có khả năng chịu lạnh [146]. Nhiều gen cảm ứng với tình trạng mất nước, chẳng hạn như gen mã hóa protein LEA được biểu hiện trong các cây chuyển gen. Ngoài ra, nhiều gen cảm ứng với nhiệt độ cao cũng được điều chỉnh và thực tế cây chuyển gen thể hiện tính kháng với các sốc nhiệt [147]. Những thể đột biến gen DREB2A có biểu hiện làm giảm một phần của sự mất nước hoặc sốc nhiệt, điều đó cho thấy, DREB2A đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện các gen cảm ứng với mất nước và sốc nhiệt [147] (Hình 1.3). Hoạt động điều hòa sau phiên mã của DREB2 Điều hòa sau phiên mã của DREB2A có liên quan đến sự ổn định của protein (Hình 1.3). Vùng NRD trong DREB2A là một trình tự giàu amino acid serine/threonine ưa nước và tạo thành một chuỗi PEST, đây là một loại protein không ổn định được tìm thấy ở sinh vật nhân chuẩn [142], [145]. Trong điều kiện không có stress, protein huỳnh quang xanh GFP (Green fluorescence protein) ở nhân liên kết với DREB2A CA được tích lũy ổn định hơn so với GFP liên kết với DREB2A [146]. Theo Qin và cs (2008), các protein DRIP1 và DRIP2 đã được phân lập, tương tự như enzyme RING E3 ligase, nó tương tác với DREB2A trong nhân cũng tương tự như chất môi giới ubiquitin của DREB2A. Biểu hiện mạnh của
17 DRIP1 đã làm chậm lại biểu hiện phản ứng mất nước của các gen chức năng. Ngược lại, phản ứng mất nước của các gen chức năng được tăng cường đáng kể ở cả hai thể đột biến drip1 và drip2. Ngoài ra, có sự tích lũy ổn định GFP liên kết với DREB2A trong nhân của hai thể đột biến drip1 và drip2 ở cây không chuyển gen trong điều kiện bình thường hoặc có chất ức chế proteasome. Vì vậy, có giả thuyết cho rằng DRIP1 và DRIP2 điều hòa âm tính biểu hiện gen cảm ứng mất nước bằng cách tạo điều kiện cho ubiquitin hoạt động và làm mất chức năng của DREB2A [136] (Hình 1.3). Phosphoryl hóa được xem như là một cơ chế điều hòa sau phiên mã đối với PgDREB2A, đó là một protein thuộc phân nhóm DREB2 được phân lập từ thực vật thân cỏ như cây Pennisetum glaucum (thuộc phân họ kê) [11]. Toàn bộ dịch chiết của tế bào cây P. glaucum có thể phosphoryl hóa một protein tái tổ hợp PgDREB2A ở trong Escherichia coli. Sự phosphoryl hóa thường xảy ra tại threonine dư, làm giảm ái lực liên kết của các protein PgDREB2A với trình tự DRE/CRT. Mặc dù vị trí phosphoryl hóa chưa được xác định, song việc phát hiện này cho thấy sự phosphoryl hóa như là một cơ chế điều hòa sau phiên mã của các DREB2. Trong thực vật thân cỏ, DREB2 điều hòa qua nhiều bước. Các DREB2 cảm ứng với các stress trong thực vật thân cỏ được chia thành hai nhánh: OsDREB2A và OsDREB2B [107]. Cơ chế điều hòa này đã được tìm thấy ở các gen trong nhánh thứ hai của lúa mạch (HvDRF1) [187], lúa mì (WDREB2) [43], ngô (ZmDREB2A) [134] và lúa (OsDREB2B) [107]. Những gen này có hai loại: Sao chép nhưng không hoạt động do có một codon kết thúc trước vùng liên kết với DNA và sao chép hoạt động mà có thể mã hóa một protein có chiều dài đầy đủ. Nói chung, loại sao chép không hoạt động được thể hiện dưới điều kiện không có stress. Sao chép hoạt động để cảm ứng với các tín hiệu stress cao hơn so với sao chép không hoạt động. Hiện tượng điều hòa qua nhiều bước đối với các gen DREB2 trong các loài thực vật thân cỏ có thể cho phép cảm ứng với
18 stress nhanh chóng bằng cách bỏ qua các bước kích hoạt của các chất hoạt hóa DREB2 hoặc cung cấp trước một lượng của mRNA DREB2s. DREB2 với cảm ứng với sốc nhiệt Trong cây Arabidopsis, DREB2A là một nhân tố phiên mã trong cảm ứng với sốc nhiệt. Khi gặp điều kiện nhiệt cao, gen DREB2A nhanh chóng biểu hiện và kích hoạt nhiều gen cảm ứng sốc nhiệt, chẳng hạn như các nhân tố phiên mã và môi giới phân tử. Biểu hiện trực tiếp của các thể đột biến gen DREB2A làm giảm biểu hiện của các gen này và rất nhạy cảm với sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ [147]. Một trong những gen đích quan trọng của DREB2A là HsfA3, một thành viên của nhóm HSF, gồm có 21 thành viên trong cây Arabidopsis [122]. Biểu hiện mạnh của HsfA3 là sẽ kích hoạt cho nhiều gen cảm ứng sốc nhiệt, trong khi sự gián đoạn hoạt động của gen HsfA3 làm giảm phản ứng của các gen cảm ứng sốc nhiệt và giảm khả năng chống sốc nhiệt [150], [189]. Các báo cáo gần đây cho thấy, sự tác động của gen DREB2A chỉ ức chế một nhóm các gen HsfA1 [85] (Hình 1.3). Hiện nay, có ý kiến cho rằng, nhiệt độ cao kích hoạt mạnh các protein HsfA1, còn gen HsfA2 gây nên sự phiên mã của DREB2A và là một nhân tố phiên mã quan trọng [151]. DREB2A sau đó kích hoạt gen HsfA3 và các protein HsfA3 biểu hiện để tiếp tục tác động các gen chức năng (Hình 1.3). Hoạt động sao chép của gen OsDREB2B ở cây lúa sẽ hiển thị một mô hình biểu hiện tương tự như của gen DREB2A dưới điều kiện nhiệt độ cao [107] và một số gen HSF trong cây lúa có DRE/CRT, và có thể gặp ở hầu khắp thực vật hạt kín. Chức năng của DREB2 trong điều kiện sốc nhiệt và hạn Hạn và nhiệt độ cao gắn liền với những điều kiện stress của môi trường tự nhiên và thường xảy ra đồng thời [110]. Sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt độ cao ảnh hưởng đến sinh trưởng của các cây trồng nhiều hơn những stress đơn lẻ [110], [143], [144]. Về mặt sinh trưởng, phân tích sự phiên mã và trao đổi chất
19 ở cây thuốc lá, cây Arabidopsis đã chỉ ra rằng, phản ứng của cây đối với sự kết hợp của nhân tố hạn và nhiệt độ cao một phần có sự chồng chéo lên nhau, nhưng rõ ràng những chồng chéo này nhằm chống lại stress đơn lẻ [143], [144]. Gen DREB2A không chỉ được cảm ứng bởi hạn hay nhiệt độ cao đơn lẻ mà còn bởi sự kết hợp của hạn và nhiệt độ cao [144], do đó các gen DREB2 đóng vai trò trong việc điều hòa biểu hiện gen dưới sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt độ cao lên thực vật. 1.1.3.4. Mối quan hệ về chức năng giữa DREB1/CBF, DREB2 và các nhân tố phiên mã khác Sự khác biệt về đặc tính liên kết của DREB1A/CBF3 và DREB2A với DRE/CRT có thể là chìa khóa để điều hòa các gen trong cây Arabidopsis đối với các stress cụ thể. Trong cây Arabidopsis, sự biểu hiện mạnh của các gen DREB1/CBF đã cải thiện khả năng chịu hạn và lạnh [42], [77], [135]. Ngược lại, sự biểu hiện mạnh của các gen DREB2 tăng cường đáng kể khả năng chịu hạn nhưng không cải thiện khả năng chịu lạnh [134], [146]. Maruyama và cs (2009) chứng minh rằng, các gen chức năng được kích hoạt bởi DREB1A/CBF3 và DREB2A CA chịu tác động một phần sự kết hợp của các stress. Tuy nhiên, các gen chức năng cụ thể lại tương ứng với từng loại protein DREB. Gen mã hóa enzyme để chuyển hóa carbohydrate chịu tác động của DREB1A, trong khi gen mã hóa những chất môi giới phân tử chịu tác động của DREB2A CA [105]. Về mặt chuyển hóa cho thấy, mô hình tích lũy chất chuyển hóa là giống nhau giữa các cây biểu hiện mạnh gen DREB1A ở cây chịu lạnh, cũng như giữa cây biểu hiện mạnh gen DREB2A CA ở cây chịu hạn [105]. Điều này cho thấy, những sự khác biệt trong tích lũy chất chuyển hóa đã gây ra sự khác biệt trong khả năng chịu stress của thực vật. Maruyama và cs (2004), Sakuma và cs (2006) đã chứng minh rằng, DREB1A có ái lực mạnh với A/GCCGACNT và DREB2A có ái lực mạnh ACCGAC cả ở điều kiện in vitro và ở cây trồng. Bởi vì, tác động lạnh đối với thực vật gây ra tình trạng mất nước của tế bào, tác động tới hệ thống
20 bảo vệ chung giữa phản ứng stress lạnh và mất nước. Chẳng hạn như protein LEA, được quy định thông qua một trình tự DRE/CRT chung (ACCGACNT) và được cảm ứng bởi các tín hiệu stress lạnh và mất nước. Ngược lại, các gen hoạt động trong điều kiện stress cụ thể được quy định bởi trình tự DRE/CRT riêng. Như vậy, sự khác biệt nhỏ về các trình tự DRE/CRT cùng với sự điều hòa của một số gen phân họ DREB có thể cải thiện sức sống của cây chống lại điều kiện bất lợi của ngoại cảnh [104], [146]. Hình 1.3. Điều hòa phiên mã và sau phiên mã của DREB2A trong cây Arabidopsis [109] Về sự tương tác của DREB1/CBF và DREB2 với các nhân tố phiên mã khác, DRE/CRT tương tác với các trình tự cis và DREB tương tác với các nhân