Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn Streptococcus iniae

Chia sẻ: Elysale Elysale | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:144

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của đề tài: Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae. Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng vi khuẩn bất hoạt trong phòng bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm. Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn Streptococcus iniae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ----------------------- TRẦN VĨ HÍCH NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NHA TRANG – 2014 1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ----------------------- TRẦN VĨ HÍCH NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 62 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Dũng NHA TRANG – 2014 2
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. các kết quả thu được trong luận án này là kết quả nghiên cứu của dự án Bệnh ở cá chẽm, thuộc hợp phần II dự án SRV-2701 do Na Uy tài trợ mà tôi là một thành viên tham gia thực hiện dự án với tư cách là một nghiên cứu sinh theo kế hoạch hoạt động đào tạo của dự án. Tôi đã được Chủ nhiệm dự án cho phép sử dụng tất cả số liệu nghiên cứu được cho luận án tiến sĩ của mình. Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào. NGHIÊN CỨU SINH Trần Vĩ Hích i
LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Phòng Đào tạo Đại học và Sau Đại học, dự án SRV 2701 đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu sinh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng, người đã định hướng nghiên cứu và trực tiếp khuyên bảo và giúp đỡ, giải quyết những khó khăn cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hiểu rõ hơn về giá trị của nghiên cứu khoa học. Xin cám ơn Phó Giáo sư Tiến sĩ Đỗ Thị Hòa, người đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu chập chững trên con đường nghiên cứu khoa học và không ngừng dõi theo từng bước chân của tôi. Chính Cô và Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Đình Mão là những người đã tạo cơ hội cho tôi trở lại con đường nghiên cứu khoa học. Cho phép tôi kính gửi lòng biết ơn chân thành đến Giáo sư Heidrun Inger Wergeland, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian học tập phương pháp phân tích mẫu tại Na Uy và giúp đỡ tôi trong việc công bố công trình nghiên cứu trên tạp chí quốc tế. Xin cám ơn Tiến sĩ Lại Văn Hùng và Tiến sĩ Lục Minh Diệp, những người luôn tin tưởng và động viên tôi trong nghiên cứu khoa học cũng như giúp đỡ về vật chất trong thời gian đầu của quá trình nghiên cứu. Cám ơn Tiến sĩ Lê Minh Hoàng, Nghiên cứu sinh Đinh Văn Khương và Thạc sĩ Vũ Đặng Hạ Quyên luôn kịp thời cung cấp các bài báo khoa học trong quá trình nghiên cứu. Xin chân thành cám ơn sự động viên, khích lệ và giúp đỡ của các Thầy, Cô giáo trong Khoa Nuôi trồng Thủy sản, cảm ơn các em sinh viên ngành Bệnh học thủy sản các khóa từ 46BH đến 50BH đã cùng tôi thực hiện nghiên cứu này. Lời cảm ơn cuối cùng tôi xin được giành cho gia đình của tôi: Ba, má, các anh chị, vợ và con tôi, những người đã luôn yêu thương, nâng đỡ tôi về vật chất lẫn tinh thần mà từ bao lâu nay tôi vẫn chưa nói ra một lời cám ơn. ii
MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG LUẬN 4 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌNH HÌNH NUÔI CÁ CHẼM 4 1.1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm. 4 1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 5 1.1.2.1 Sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới 5 1.1.2.2 Các hình thức nuôi cá chẽm thương phẩm 6 1.1.3 Tình hình nuôi cá chẽm tại Việt Nam 7 1.1.4 Các bệnh thường gặp ở cá chẽm nuôi 7 1.1.4.1 Bệnh do virus 7 1.1.4.2 Bệnh do vi khuẩn 8 1.1.4.3 Bệnh do kí sinh trùng 10 1.2 BỆNH DO Streptococcus iniae TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 11 1.2.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae trong nuôi trồng thủy sản 11 1.2.2 Dấu hiệu bên ngoài của bệnh do Streptococcus inae 13 1.2.3 Giải phẫu bệnh lý cá nhiễm Streptococcus iniae 13 1.2.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn S. iniae 14 1.2.5 Biện pháp phòng và trị bệnh do Streptococcus iniae 16 1.3 HỆ THỐNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG 20 1.3.1 Miễn dịch tự nhiên 20 1.3.1.1 Hàng rào vật lý và hóa học 20 iii
1.3.1.2 Hàng rào tế bào 21 1.3.1.3 Hàng rào thể dịch 22 1.3.2 Đáp ứng miễn dịch thích ứng 24 1.3.2.1 Hàng rào tế bào trong đáp ứng miễn dịch thích ứng 24 1.3.2.2 Hàng rào thể dịch trong đáp ứng miễn dịch thích ứng 25 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của cá 27 1.3.3.1 Các yếu tố ngoại cảnh 27 1.3.3.2 Các yếu tố nội tại 28 1.3.3.3 Các yếu tố phái sinh 28 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 34 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. 34 2.3 SƠ ĐỒ KHỐI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (Hình 2.1) 34 2.4 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH MẪU 34 2.4.1 Phân lập và xác định đặc điểm vi khuẩn Streptococcus iniae. 34 2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 34 2.4.1.2 Xác định độc lực của vi khuẩn phân lập 37 2.4.1.3 Kiểm tra độ nhạy kháng sinh của các chủng S. iniae phân lập 38 2.4.1.4 Nghiên cứu phương thức xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm 38 2.4.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng phân lập 39 2.4.2 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của các chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 41 2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae và ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch này. 41 2.4.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với tế bào vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin (Formalin Killed Cell - FKC) 43 2.4.3 Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm 49 2.4.4 Phương pháp phân tích số liệu 49 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 iv
3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM 50 3.1.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50 3.1.1.1 Tình hình dịch bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50 3.1.1.2 Đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn phân lập 52 3.1.2 Độc lực của vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá bệnh 54 3.1.3 Độ nhạy của S. iniae với các loại kháng sinh 57 3.1.4 Con đường cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm 59 3.1.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn gây bệnh đã phân lập 62 3.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM ĐỐI VỚI VI KHUẨN S. iniae 64 3.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae bất hoạt và ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng này 64 3.2.1.1 Hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào 64 3.2.1.2 Nồng độ lysozyme trong huyết thanh của cá chẽm 66 3.2.1.3 Khả năng ức chế vi khuẩn S. iniae của huyết thanh cá chẽm 67 3.2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với tế bào vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin (FKC) 70 3.2.2.1 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong máu cá thí nghiệm sau khi tiêm FKC 70 3.2.2.2 Đặc điểm protein kháng nguyên của vi khuẩn S. iniae 74 3.2.2.3 Hiệu quả bảo vệ của tế bào vi khuẩn bất hoạt (FKC) đối với bệnh do Streptococcus iniae gây ra ở cá chẽm 76 3.3 SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN ỨC 80 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt BA Blood Agar Môi trường thạch máu CFU Colony Forming Unit Đơn vị khuẩn lạc FKC Formalin-Killed Cells Tế bào vi khuẩn bất hoạt bằng formalin IP Intraperitoneal Injection Tiêm vào xoang bụng kDa Kilo Dalton Đơn vị tính khối lượng phân tử protein KF KF-Streptococcus Agar Môi trường nuôi cấy vi khuẩn L-15 Leibovitz Môi trường nuôi cấy tế bào LD50 Lethal Dose 50% Liều gây chết 50% OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối sinh lý đệm Phosphate RPP Relative Percent Protection Hệ số bảo vệ tương đối SDS- Sodium Dodecyl Sulfate - Điện di trên gel polyacrylamide có PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS TSA Tryptic Soy Agar Môi trường nuôi cấy vi khuẩn TSB Tryptic Soy Broth Môi trường nuôi cấy vi khuẩn xg Gravity Đơn vị tính lực ly tâm vi
DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae. 15 Bảng 1.2. Hiệu quả bảo vệ của các loại vaccine phòng bệnh do vi khuẩn S. 18 iniae sau bốn tuần tiêm chủng. Bảng 1.3 Nguồn gốc và tác dụng của cytokin ở cá 29 Bảng 1.4 Sự hình thành các cơ quan và mô lympho ở một số loài cá 32 Bảng 3.1 Nguồn phân lập các chủng S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50 Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá 53 chẽm nuôi tại Khánh Hòa Bảng 3.3 Độ nhạy cảm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm 58 nuôi tại Khánh Hòa đối với 12 loại kháng sinh phổ biến trong nuôi trồng thủy sản. Bảng 3.4 Thời điểm phát hiện vi khuẩn S. iniae ở các cơ quan của cá chẽm 59 vii
DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Sản lượng và giá trị cá chẽm nuôi của thế giới từ năm 1959 – 2009 5 Hình 1.2 Tỉ lệ sản lượng cá chẽm nuôi của các nước với tổng sản lượng cá 6 chẽm nuôi trên thế giới từ năm 1959-2009 Hình 1.3 Một số bệnh thường gặp ở cá chẽm nuôi 10 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 35 Hình 2.2 Phương pháp xác định kháng thể kháng S. iniae trong huyết thanh 45 cá chẽm Hình 3.1 Cá chẽm mắc nhiễm Streptococcus iniae nuôi tại Khánh Hòa 51 Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn S. iniae phân 52 lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa. Hình 3.3 Tỉ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá chẽm thí nghiệm sau khi tiêm S. 55 iniae vào xoang bụng với các nồng độ khác nhau. Hình 3.4 Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn S. iniae tiêm vào xoang bụng 56 và tỉ lệ chết tích lũy của các nhóm cá chẽm thí nghiệm. Hình 3.5 Mang cá chẽm nhuộm mô hóa miễn dịch với vi khuẩn ở mang sơ 59 cấp, mang thứ cấp và xoang tĩnh mạch mang Hình 3.6 Thận cá chẽm nhiễm S. iniae nhuộm mô hóa miễn dịch 60 Hình 3.7 Một số cơ quan cá chẽm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae sau 61 khi nhuộm mô hóa miễn dịch Hình 3.8 Hiệu giá kháng thể của huyết thanh cá chẽm đối với các chủng S. 63 iniae khác nhau Hình 3.9 Hoạt tính thực bào của đại thực bào cá chẽm trước và sau khi tiêm 64 vi khuẩn S. iniae. Hình 3.10 Các tế bào nấm men bị thực bào bởi các đại thực bào phân lập từ 65 tiền thận cá chẽm Hình 3.11 Chỉ số thực bào của đại thực bào cá chẽm trước và sau khi tiêm 65 viii
vi khuẩn S. iniae Hình 3.12 Nồng độ lyzozyme của huyết thanh cá chẽm trước và sau khi 66 tiêm vi khuẩn S. iniae Hình 3.13 Tỉ lệ (%) vi khuẩn S. iniae bị ức chế bởi huyết thanh cá chẽm. 67 Hình 3.14 Tỉ lệ cá chẽm có kháng thể đặc hiệu kháng lại S. iniae trong 71 huyết thanh cá chẽm đã được gây miễn dịch Hình 3.15 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu kháng vi khuẩn S. 72 iniae trong huyết thanh của cá chẽm được tiêm vaccine thử nghiệm so với cá đối chứng (OD492 nm) Hình 3.16 Tương quan giữa mật độ quang và độ pha loãng của huyết thanh 73 cá chẽm Hình 3.17 SDS-PAGE protein profile của tế bào vi khuẩn S. iniae xử lý 74 bằng mutanolysin Hình 3.18 Phân tích western blot của các chủng vi khuẩn S. iniae. 75 Hình 3.19 Tỷ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá thí nghiệm trong thời gian theo 78 dõi sau khi công cường độc bằng vi khuẩn S. iniae chủng VN091211R Hình 3.20 Mầm tuyến ức cá chẽm 10 ngày sau khi nở. 80 Hình 3.21 Tuyến ức cá chẽm 12 và 14 ngày sau khi nở. 81 Hình 3.22 Tuyến ức cá chẽm 30 ngày sau khi nở 82 ix
MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, thành công của những mô hình thử nghiệm nuôi cá chẽm ở các ao nuôi tôm hoang hóa đã khẳng định cá chẽm là đối tượng có hiệu quả kinh tế cao. Đặc biệt từ năm 2005, khi đã tìm được thị trường xuất khẩu sản phẩm cá chẽm phi lê đông lạnh, nghề nuôi cá chẽm thương phẩm phát triển nhanh chóng ở một số tỉnh như Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Khánh Hòa… Cùng với sự phát triển về diện tích và mức độ thâm canh của nghề nuôi cá chẽm, dịch bệnh trên đối tượng nuôi mới này bắt đầu xuất hiện, gây thiệt hại ở một số cơ sở nuôi cá thương phẩm. Trong đó, bệnh truyền nhiễm đóng một vai trò hết sức quan trọng. Nghiên cứu của Wendover (2010) về các bệnh quan trọng ở cá chẽm nuôi tại Châu Á cho biết trong tất cả các bệnh thường gặp ở cá chẽm, bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra là bệnh phổ biến nhất [190]. Streptococcus iniae lần đầu tiên được biết đến vào năm 1976, khi Pier và Madin công bố kết quả định danh chủng vi khuẩn đã được phân lập từ ổ viêm dưới da cá heo nước ngọt sông Amazon nuôi tại San Francisco từ năm 1972 [137], từ đó đến nay, dịch bệnh cứ liên tục xảy ra trên khắp các vùng nuôi trên thế giới và ở hầu hết cá loài cá nuôi như cá bơn Paralichthys olivaceus, cá thơm Plecoglossus altivelis, cá hồi Oncorhynchus rhodurus, cá dìa xám Siganus fuscescens, cá chẽm Lates calcarifer, cá điêu hồng Oreochromis sp., cá chẽm châu Âu Dicentrarchus labrax [121, 122, 127, 173]... gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi. Sử dụng kháng sinh là một trong những biện pháp có hiệu quả trong việc trị bệnh do S. iniae gây ra. Tuy nhiên, việc sử dụng thường xuyên kháng sinh sẽ làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc. Nghiên cứu của Aoki và các cộng sự đã chứng minh sự gia tăng các dòng liên cầu khuẩn kháng thuốc [13]. Probiotic hay một số chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu như inositol, levalmisole hay β- glucan cũng đã được sử dụng trong việc phòng trị bệnh do S. iniae gây ra ở cá. Tuy nhiên, hiệu quả của việc phòng trị bệnh bằng các phương pháp này không cao và rất khác nhau ở các nghiên cứu khác nhau [101, 136, 145, 149, 191]. 1
Vaccine là sự lựa chọn tốt nhất trong việc kiểm soát bệnh do S. iniae gây ra. Tuy nhiên, đôi khi việc sử dụng vaccine không mang lại hiệu quả như mong muốn do những thay đổi mạnh mẽ của vi khuẩn nhằm thích nghi với điều kiện môi trường cho phép chúng thay đổi cấu trúc protein kháng nguyên. Do đó, mặc dù đã có một số loại vaccine phòng bệnh do S. iniae gây ra nhưng những nghiên cứu để tạo ra những loại vaccine có hiệu lực cao vẫn hết sức cần thiết. Mặt khác, khả năng tiếp nhận vaccine và chất kích thích miễn dịch còn phụ thuộc vào từng loài cá, thời điểm sử dụng và phương pháp dẫn truyền. Nếu cá giống bị phơi nhiễm với một loại kháng nguyên nào đó quá sớm thì thay vì kích thích hệ thống miễn dịch sinh kháng thể, hiện tượng vô cảm miễn dịch xuất hiện và việc sản sinh kháng thể không xảy ra khi cá tiếp xúc lại với kháng nguyên này. Vì vậy việc chủng vaccine quá sớm cho cá giống có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng. Từ thực tiễn nêu trên, đề tài: ”Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con (Lates calcarifer Bloch 1790) đối với vi khuẩn Streptococcus iniae” được thực hiện. Mục tiêu của đề tài: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng bệnh sớm cho cá chẽm bằng phương pháp miễn dịch học Các nội dung chính của đề tài: 1. Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 2. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae 4. Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng vi khuẩn bất hoạt trong phòng bệnh do S. iniae gây ra ở cá chẽm. 5. Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm 2
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này đã bổ sung các hiểu biết về hệ miễn dịch và đáp ứng miễn dịch của cá chẽm (Lates calcarifer) bao gồm sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức, cơ quan lympho trung ương đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu; đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thể hiện qua hoạt tính của đại thực bào và lysozyme; và đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu khi bị hoạt hóa bởi kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus iniae. Ý nghĩa thực tiễn: Các kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng các biện pháp miễn dịch học nhằm phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá chẽm nuôi tại Việt Nam bao gồm việc sử dụng các chế phẩm kích ứng miễn dịch không đặc hiệu (immunostimulants) và liệu pháp vaccine, góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm tại Việt Nam theo hướng bền vững, an toàn, giảm thiểu rủi ro, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường do việc sử dụng kháng sinh và hóa chất để phòng trị bệnh cho cá. Tính mới của công trình: Đây là công bố đầu tiên về hệ miễn dịch của cá chẽm và các đáp ứng miễn dịch của cá chẽm tại Việt Nam. Đồng thời, đây cũng là công bố đầu tiên trên thế giới về sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức của cá chẽm (Lates calcarifer) được thực hiện bằng phương pháp mô học. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG LUẬN 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌNH HÌNH NUÔI CÁ CHẼM 1.1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm. Cá chẽm (Lates calcarifer) hay còn gọi là cá vược là loài cá có giá trị kinh tế, phân bố tự nhiên ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Á Thái Bình Dương, từ đảo Đài Loan ở phía Bắc, đến bờ biển Đông Bắc nước Úc ở phía Nam, từ Papua New Guinea ở phía Đông đến vùng Balkan ở phía [75]. Đây là loài cá di cư xuôi dòng, cá trưởng thành sống ở vùng cửa sông. Chúng thích sống ở những vùng sông, lạch, đầm và cửa sông nơi có dòng chảy chậm nhưng vẫn có thể tìm thấy ở vùng gần đảo hoặc bãi đá ngầm [157]. Cá chẽm là loài rộng muối. Chúng sống ở độ mặn từ 0 - 55‰ [132, 142] và chịu được sự thay đổi đột ngột về độ mặn. Cá giống cỡ 2 - 3cm có thể thuần hóa từ độ mặn 30 - 32‰ xuống 5 - 10‰ trong vòng 2 - 3 giờ [95, 182]. Vì vậy, chúng được xem là đối tượng nuôi công nghiệp quan trọng trong các thủy vực nước ngọt, nước lợ và nước mặn ở các nước châu Á và Úc [44, 134, 169]. Cá chẽm sống trong môi trường có nhiệt độ từ 20 – 39oC, thích hợp nhất từ 26 - 32oC. Theo Kunvankij và các cộng tác viên (1984) điều kiện môi trường nuôi phù hợp cho cá chẽm là pH: 7,5 – 8,5; hàm lượng oxy hòa tan từ 4 - 9 ppm; ammonia (NH3-N) < 1 ppm và H2S < 0,3 ppm [95]. Cá chẽm trưởng thành là cá dữ, săn bắt mồi sống. Ngoài tự nhiên, cá giống cỡ 1 - 10 cm thường ăn tạp. Đối với cá có kích thước lớn hơn 20 cm, thức ăn của chúng hoàn toàn là động vật. Trong điều kiện ương nuôi giống, cá chẽm sau giai đoạn chuyển đổi thức ăn có thể sử dụng hoàn toàn thức ăn viên [71, 95]. Tuy nhiên, đặc tính ăn nhau của cá chẽm là một trong những nguyên nhân chính gây hao hụt số lượng cá chẽm giống cho tới khi cá đạt đến kích cỡ 15 cm [144, 157]. Bên cạnh một số ưu điểm như chịu đựng tốt với những biến động lớn của điều kiện môi trường, cá chẽm còn là loài có tốc độ tăng trưởng nhanh, có thể đạt đến 500 g sau 12 tháng nuôi. Ở những vùng có nhiệt độ cao, cá có thể đạt đến 800 g sau 12 tháng nuôi và 2 - 3 kg sau 18 - 24 tháng nuôi [181]. 4
1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 1.1.2.1 Sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới Sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới bắt đầu được FAO thống kê từ năm 1959. Đến năm 1990, sản lượng cá chẽm của thế giới lần đầu tiên chạm đến mốc 10.000 tấn với giá trị xuất khẩu đạt 48.846 USD. Sang năm 1992, con số này tăng lên 15.151 tấn với giá trị 85.650 USD. Tuy nhiên liên tục gần mười năm sau đó, sản lượng cá chẽm thế giới không tăng mà chỉ giữ ở mức xấp xỉ 20.000 tấn/năm. Những năm gần đây, sản lượng cá chẽm của thế giới tăng liên tục. Theo số liệu thống kê của FAO, năm 2009 sản lượng cá chẽm của thế giới đạt 49.299 tấn với giá trị xuất khẩu đạt 163.729 USD (Hình 1.1). sản lượng cá chẽm giá trị xuất khuẩu 50000 180000 45000 160000 Giá trị xuất khẩu (nghìn 40000 140000 Sản lượng (tấn) 35000 120000 30000 100000 USD) 25000 80000 20000 15000 60000 10000 40000 5000 20000 0 0 1959 1964 1969 1974 1979 1984 1989 1994 1999 2004 2009 Năm Hình 1.1 Sản lượng và giá trị cá chẽm nuôi của thế giới từ năm 1959 – 2009 (nguồn: FishStat plus - FAO) Các nước và vùng lãnh thổ có sản lượng cá chẽm cao là Thái Lan, Đài Loan, Malaysia, Indonesia và Úc. Tổng sản lượng cá chẽm nuôi do 5 nước này sản xuất ra luôn chiếm trên 95% tổng sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới. Trong đó Thái Lan là quốc gia có sản lượng cá chẽm nuôi lớn nhất thế giới. Tổng sản lượng cá chẽm mà Thái Lan đã sản xuất ra đạt tới 36% tổng sản lượng của cá chẽm nuôi trên thế giới (Hình 1.2). 5
1% Đài Loan 7% 23% 11% Thái Lan Malaysia Indones ia 22% Úc 36% các nước khác Hình 1.2 Tỉ lệ sản lượng cá chẽm nuôi của các nước với tổng sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới từ năm 1959 - 2009 (nguồn: FishStat plus - FAO) 1.1.2.2 Các hình thức nuôi cá chẽm thương phẩm Cá chẽm được nuôi với nhiều hình thức khác nhau nhưng hai hình thức nuôi phổ biến nhất là nuôi trong ao và nuôi trong lồng. Nuôi cá chẽm trong ao đất là hình thức nuôi phổ biến ở các nước Đông Nam Á và Úc. Ao nuôi thường có hình chữ nhật và diện tích từ 0,08 – 2 ha [40, 181]. Độ sâu của ao từ 1 – 2 m, đáy bằng phẳng và hơi nghiêng về phía mương thoát nước. Mật độ thả giống cá chẽm nuôi trong ao đất phụ thuộc vào cỡ ao và cỡ giống. Đối với các nước Đông Nam Á, ở những ao có kích thước nhỏ từ 0,8 - 0,16 ha, người nuôi thường thả cá có kích thước từ 10 - 15 cm với mật độ từ 5.000 – 10.000 con/ha, trong khi những ao có kích thước lớn hơn 0,3 ha, cá thường được thả nuôi với mật độ 2500 – 5000 con /ha với cỡ giống khoảng 100 g/con. Hình thức nuôi trong lồng là hình thức nuôi phổ biến ở Thái Lan, Hồng Kông, Malaysia, Singapore và Indonesia. Đây là hình thức nuôi cá chẽm đơn giản, đem lại lợi nhuận cao hơn so với hình thức nuôi trong ao [157]. Lồng nuôi được cố định dưới đáy biển hoặc thả nổi trên mặt nước. Khung của lồng nổi được làm bằng tre, gỗ, nứa hay kim loại. Lồng nuôi có dạng hình vuông, kích thước 3 m x 3 m thường được sử dụng ở Singapore và các trang trại nuôi ở Malaysia, trong khi một số lồng nuôi ở Singapore và hầu hết các trang trại nuôi ở Thái Lan lại sử dụng lồng có kích thước 5 m x 5 m và 10 m x 10 m. Lồng nổi thường có độ sâu từ 2 - 3 m, với1,5 - 2,5 m chìm trong nước. Mật độ cá thả nuôi trong lồng giảm dần theo sự tăng dần của kích cỡ cá, đối với cá 20 - 100 g/con mật độ nuôi khoảng 40 – 50 6
con/m3, trong khi cá từ 100 – 700 g/con, mật độ nuôi giảm còn 33 con/m3. Ở Úc, khung lồng được làm bằng thép và nhựa PVC. Lồng nuôi được đặt ở biển hoặc ngay trong ao nuôi. Hiện nay với công nghệ nuôi ngày càng cao, nhiều lồng nuôi biển được thiết kế theo dạng hình tròn có đường kính tới 30 m. Năng suất của dạng lồng này đạt đến 100 tấn/lồng. 1.1.3 Tình hình nuôi cá chẽm tại Việt Nam Cá chẽm là đối tượng được nuôi ở Việt Nam từ lâu, nguồn giống được lấy từ tự nhiên hoặc nhập từ Thái Lan. Tuy nhiên do thiếu chủ động về nguồn giống nên nghề nuôi cá chẽm thương phẩm ít được chú ý. Năm 2003, với sự thành công trong việc nghiên cứu hoàn thiện qui trình sản xuất giống nhân tạo cá chẽm của Trường Đại học Nha Trang, nghề nuôi cá chẽm mới bắt đầu phát triển mạnh mẽ. Một số vùng nuôi cá chẽm lớn ở Việt Nam có thể kể đến là Khánh Hòa, Bến Tre, Đồng Tháp, Kiên Giang, Quảng Ninh... Cũng giống như một số nước trên thế giới, ở Việt Nam, cá chẽm được nuôi dưới 2 hình thức nuôi trong ao và nuôi trong lồng bè, trong đó hình thức nuôi trong ao phổ biến hơn. Hầu hết các ao nuôi cá chẽm là các ao nuôi tôm bị bỏ hoang do dịch bệnh. Ở các ao này, người nuôi thường thả giống 5 – 10 cm với mật độ 0,5 - 1,5 con/m2 hoặc thả giống nhỏ cỡ 2 – 3 cm với mật độ 2 – 3 con/m2. Ở một số công ty chuyên nuôi cá chẽm, mật độ thả nuôi cao hơn, từ 5 - 10 con/m2. Năng suất nuôi ở các cơ sở này đạt 20 - 25 tấn/ha. Phần lớn cơ sở nuôi cá chẽm ở Việt Nam sử dụng cá tạp làm thức ăn cho cá chẽm. Hệ số tiêu tốn thức ăn thường dao động ở khoảng 5,0 – 7,0 tùy thuộc vào chất lượng cá mồi. Nhìn chung, trình độ kỹ thuật của phần lớn người nuôi còn ở mức thấp, việc quản lý chất lượng môi trường nước trong ao nuôi còn khá đơn giản [2]. Tuy nhiên, với sự phát triển mạnh mẽ của nghề nuôi cá chẽm trong những năm gần đây, những mô hình nuôi tiên tiến đã xuất hiện ở Việt Nam, điển hình như những mô hình nuôi cá chẽm đạt năng suất 25 tấn/ha ở Bình Đại, Bến Tre hoặc các lồng nuôi biển đường kính 30 m với năng suất 100 tấn/lồng ở Vạn Ninh, Khánh Hòa. 1.1.4 Các bệnh thường gặp ở cá chẽm nuôi 1.1.4.1 Bệnh do virus 7
Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis disease). Bệnh hoại tử thần kinh do nodavirus hay còn gọi là virus gây hoại tử thần kinh (nervous necrosis virus - NNV) thuộc họ Nodaviridae gây ra. Virus này đã được xác định là tác nhân gây bệnh ở nhiều loài cá biển như cá mú chấm đen (Epinephelus malabaricus), cá mú chấm cam (Epinephelus coioides), cá đù đỏ (Sciaenops oscellatus)…[27, 41, 117, 143]. Cá mắc bệnh hoại tử thần kinh thường có màu đen sẫm hoặc nhợt nhạt, bơi không định hướng. Giải phẫu xoang bụng cho thấy bóng hơi của cá thường căng phồng [48, 177]. Quan sát mô học của não và võng mạc mắt cá thường phát hiện các dạng không bào hình tròn hoặc elip [120, 130]. Bệnh hoại tử thần kinh lây lan rất nhanh qua trục ngang hoặc trục dọc. Cá bố mẹ mang mầm bệnh có khả năng truyền mầm bệnh sang đàn con hoặc virus gây hoại tử thần kinh cũng có khả năng đi theo dịch tiết của cá bệnh vào môi trường nước và xâm nhập vào cá khỏe qua da, mang và đường tiêu hóa [1]. Cá khỏe sau khi tiếp xúc với virus 4 ngày sẽ biểu hiện bệnh [50]. Vì vậy có thể ngăn ngừa bệnh hoại tử thần kinh ở cá chẽm đạt hiệu quả cao bằng việc sàng lọc cá bố mẹ mang mầm bệnh và kiểm soát nguồn lây nhiễm trong sản xuất giống nhân tạo. Tỷ lệ chết tích lũy ở những đàn cá nhiễm virus gây hoại tử thần kinh từ 70 - 100% ở cá giống cỡ 2,5 - 4,0 cm, nhưng khi cá lớn (15 cm) tỷ lệ chết giảm còn 20%. Bệnh do iridovirus. Bệnh do iridovirus là một trong những bệnh nghiêm trọng xảy ra ở nhiều loài cá biển thuộc vùng nhiệt đới như cá chẽm và cá mú. Iridovirus có thể gây chết đến 90% lượng cá nuôi. Ở cá chẽm, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn từ 10 - 50 g. Dấu hiệu bệnh lý của cá mắc nhiễm iridovirus là cá giảm ăn, màu sắc thân đen sậm, mang cá tái nhợt và có thể xuất huyết. Một số cá mắc nhiễm iridovirus còn thể hiện dấu hiệu xuất huyết ở mắt. Màu sắc nhợt nhạt của lách cũng là một trong những đặc điểm nhận biết bệnh này. 1.1.4.2 Bệnh do vi khuẩn Bệnh do liên cầu khuẩn (streptococcosis). Bệnh do liên cầu khuẩn đang ngày càng gia tăng ở các đối tượng nuôi thủy sản trên khắp thế giới. Trong nuôi trồng thủy sản, thuật ngữ streptococcosis được 8
dùng để chỉ bệnh do ít nhất là 6 loài cầu khuẩn Gram dương gây ra thuộc 3 giống Streptococcus, Lactococcus, và Vagococcus. Trong đó tác nhân chính gây bệnh ở cá chẽm là Streptococcus iniae. Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài thường gặp ở cá nhiễm bệnh là màu sắc thân cá đen tối, xuất huyết ở mắt, các gốc vây, hậu môn hoặc trên thân, mắt lồi, đục. Cá bơi lội bất thường ở gần mặt nước hoặc bơi xoắn. Dấu hiệu bệnh lý bên trong là sự tích dịch ở khoang bụng. Cá bệnh thường có biểu hiện sưng phù ở gan, thận. Các dấu hiệu như xuất huyết ở gan, não bị hoại tử đôi khi cũng được bắt gặp ở các mẫu bệnh phẩm [37, 172]. Bệnh do vi khuẩn vibrio. Vi khuẩn vibrio luôn là mối nguy hiểm cho các đối tượng nuôi nước mặn, lợ [201]. Vi khuẩn Vibrio harveyi và V. anguilarum thường được xem là tác nhân chính gây bệnh ở cá chẽm trong khi các loài vi khuẩn khác thuộc giống vibrio được xem là tác nhân thứ cấp [93]. Cá chẽm nhiễm vibriosis thường thể hiện một số dấu hiệu như bơi lội bất thường, mắt mờ đục, xuất huyết ngoài da và ở trường hợp nặng có thể nhìn thấy các vết loét ngoài da. Hiện tượng tích dịch ở xoang bụng, hoại tử hoặc xuất huyết ở một số cơ quan như gan, thận, lách đôi khi cũng xuất hiện ở cá nhiễm bệnh [20, 93, 94, 179]. Vibriosis có thể gây chết 2 - 3% cá trong một ngày. Bệnh chướng bụng (Big belly). Bệnh chướng bụng xuất hiện ở cá chẽm nuôi ở một số nước Đông Nam Á như Indonesia, Singapore và Malaysia. Đến nay bệnh chỉ được tìm thấy ở cá chẽm. Dấu hiệu chính của bệnh là cá chuyển màu đen sậm và phân thành nhiều đám bơi lội ở tầng mặt hoặc tụ thành từng đám dưới đáy. Cá biếng ăn, bụng căng tròn, phần cơ teo tóp gây mất cân đối. Tác nhân gây bệnh là trực khuẩn bacillus lưỡng cực, kí sinh nội bào. Việc chẩn đoán bệnh thường dựa trên dấu hiệu bệnh như đã mô tả và khối kết dính của ruột. Mặt khác, cũng có thể dựa vào sự hiện diện của dạng vi khuẩn gây bệnh đặc trưng ở mẫu mỡ nội tạng hoặc các chất khác trong ruột hay kiểm tra bằng phương pháp PCR. Bệnh không gây chết nhanh nhưng tỉ lệ chết tích lũy lên đến 90 - 95% cá thể trong quần đàn [190]. Bệnh do vi khuẩn Tenacibaculum maritimum. 9