Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Chia sẻ: Elysale Elysale | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:139

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của đề tài: Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam. Nghiên cứu ĐƯMD không đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus và ảnh hưởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến đáp ứng này. Nghiên cứu ĐƯMD đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản Mã ngành : 62 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. NGUYỄN HỮU DŨNG 2. GS.TS. HEIDRUN I. WERGELAND KHÁNH HÒA - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP KHÁNH HÒA - 2014
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus” là kết quả nghiên cứu nghiêm túc của bản thân tôi trong suốt thời gian từ năm 2007-2012 dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của Thầy Cô hƣớng dẫn. Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Khánh Hòa, năm 2014 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Thùy
ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, Dự án “Mô hình hóa ven biển và quản lý sức khỏe cá- NUFUPRO 2007/10086” đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và hỗ trợ toàn bộ kinh phí cho tôi thực hiện luận án. Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tôi muốn dành riêng cho hai Thầy Cô giáo hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Dũng và Giáo sƣ Heidrun I. Wergeland đã định hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Nam đã cung cấp chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Đỗ Thị Hòa, TS. Lê Văn Bé, TS. Phạm Quốc Hùng, TS. Đặng Thúy Bình, ThS. Nguyễn Thị Thoa đã sẵn lòng giúp đỡ, đóng góp ý kiến quý báu, chia sẻ kinh nghiệm và động viên tinh thần trong quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các chuyên gia Phòng nghiên cứu miễn dịch - Khoa sinh học - Trƣờng đại học Bergen: TS. Ragnhild A. Jakobsen, TS. Gyri T. Haugland, TS. Eirin F. Pettersen, NCS Anita Ronneseth và KS. Paul H. Lovik đã tận tình hƣớng dẫn các kỹ thuật phân tích các thông số miễn dịch trong thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại Trƣờng Đại học Bergen, Nauy. Cuối cùng, tự đáy lòng cho phép tôi đƣợc bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn sâu sắc nhất đến những ngƣời thân yêu của tôi: Má, anh chị, chồng tôi Nguyễn Văn Hùng và con gái Nguyễn Anh Thi đã luôn bên cạnh động viên khích lệ tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn và tri ân tất cả tình cảm và sự giúp đỡ quý báu đó. Khánh Hòa, năm 2014 Nguyễn Thị Thanh Thùy
iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN..........................................................................................................................................i LỜI CẢM ƠN................................................................................................................................................ii MỤC LỤC.....................................................................................................................................................iii DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................................vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH....................................................................................................................................ix MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................4 1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides ..........................4 1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu .............................................................4 1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam..........................................6 1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi .......................................................8 1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ...................10 1.2.1. Vi khuẩn Vibrio ........................................................................................10 1.2.2. Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển ............................................15 1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng ................................................................17 1.3.1. Miễn dịch tự nhiên ...................................................................................18 1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ...................................................................................23 1.3.3. Các nhân tố ảnh hƣởng đáp ứng miễn dịch ở cá ......................................27 1.4. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá .............29 1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi .................29 1.4.2. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi ................................................30 1.5. Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam ....................36 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................... 40 2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................40 2.1.1. Đối tƣợng ..................................................................................................40 2.1.2. Vật liệu .....................................................................................................40 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................41 2.1.4. Thời gian nghiên cứu................................................................................41
iv 2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chính của luận án ........................................42 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................42 2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .................42 2.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá mú chấm cam .............................................................................................45 2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam ...............50 2.3.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ................................................................................52 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..............................................................................56 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................................. 57 3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam ..57 3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa .............57 3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ....................................59 3.1.3. Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với cá mú chấm cam ........................................................................................................67 3.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam................70 3.2.1. Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế bào máu của cá mú chấm cam ............................................................................................................71 3.2.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến thành phần bạch cầu trong máu của cá mú chấm cam...................................................................................................................74 3.2.3. Ảnh hƣởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam ................................................................................................77 3.2.4. Ảnh hƣởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam ..................................................................................80 3.2.5. Ảnh hƣởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam ............................................................83 3.3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .......................................................................................................86 3.3.1. Đặc điểm phân tử kháng thể IgM ở cá mú chấm cam ..............................86 3.3.2. Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA .......................................88
v 3.3.3. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA ..........................................................................................89 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .................................................................. 102 Kết luận ................................................................................................................102 Đề xuất ý kiến ......................................................................................................103 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................................... 104 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN PHỤ LỤC
vi DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ tiếng Việt (Nếu có) BA Blood agar base Môi trƣờng thạch máu BHI Brain Heart Infusion Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn CFU Colony Forming Unit Đơn vị tính khuẩn lạc vi khuẩn CMI Cell-Mediated Immunity Miễn dịch qua trung gian tế bào CRP C-reaction protein Protein phản ứng C DI Direct Immersion Ngâm trực tiếp ĐƢMD Đáp ứng miễn dịch FCA Freund’s complete Adjuvant Chất bổ trợ toàn phần Freund FIA Freund’s Incomplete Adjuvant Chất bổ trợ bán phần Freund HGNNV Humpback grouper nervous necrosis Loại virus gây hoại tử thần kinh ở cá mú virus lƣng gù HI Hyperosmotic Immersion Ngâm trong dung dịch ƣu trƣơng HRP Horseradish peroxidase i-ELISA indirect Enzyne Linked Kiểm định hấp phụ miễn dịch liên kết Immunosorbent Assay enzyme gián tiếp Ig Immunoglobulin globulin miễn dịch IgM Immunoglobulin M globulin miễn dịch lớp M IL-1 Interleukin 1 kDa Kilo Dalton Đơn vị tính khối lƣợng phân tử protein LD50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50% LPS Lipopolysacharides MAC Membrane attacking complex Phức hợp tấn công màng MAM Multivalent Adhesion Molecule Phân tử gắn kết đa trị MHC II Major histocompatibility complex Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu lớp II NB Nutrient Broth Môi trƣờng dinh dƣỡng dạng lỏng NCC Non-specific cytotoxic cell Tế bào độc không đặc hiệu NK Natural killer cell Tế bào diệt tự nhiên NTTS Nuôi trồng thủy sản
vii OD Optical Density Mật độ quang OMP Outer Membrane Protein Protein ngoại mạc PA Phagocytosis activity Hoạt tính thực bào PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm muối photphat RBA Respiratory burst activity Hoạt tính bùng nổ hô hấp RPS Relative Percent Survival Hệ số sinh tồn tƣơng đối RPP Relative Percent Protection Hệ số bảo vệ tƣơng đối SAP Serum Amyloid Protein Protein huyết thanh dạng sợi SDS- Sodium Dodecyl Sulfate - Điện di trên gel polyacrylamide có SDS PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis sIg Surface immunoglobuline Phân tử globulin miễn dịch bề mặt TCBS Thiosulphate citrate bile salt agar Môi trƣờng phân lập vi khuẩn Vibrio TDH Thermostable direct haemolysin Độc tố gây dung huyết bền nhiệt TLH Thermolabile haemolysin Độc tố gây dung huyết không bền nhiệt αTNF alpha Tumor Necrosis Factor Yếu tố anpha gây hoại tử khối u TNGB Tác nhân gây bệnh TSA Trypticase Soya Agar Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tổng hợp TSB Trypticase Soya Broth Môi trƣờng lỏng dinh dƣỡng tổng hợp TRH tdh-related hemolysin Độc tố gây dung huyết liên quan tdh Vibriosis Bệnh do vi khuẩn Vibrio VNN Viral Nervous Necrosis Bệnh hoại tử thần kinh do vi rút VSV Vi sinh vật
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi...................................................9 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus...60 Bảng 3.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides.......72 Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú chấm cam sau 2 tuần đƣợc cho ăn β-glucan ....................................................................................74 Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam khi đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ khác nhau..................................77 Bảng 3.5: Tỷ lệ chết tích lũy và hệ số bảo hộ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin đối với cá mú Epinephelus coioides ..........................................99
ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides......................................................4 Hình 1.2: Xu hƣớng sản lƣợng và giá trị cá mú trên thế giới ....................................6 Hình 1.3: Sản lƣợng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu ...............7 Hình 1.4: Đặc điểm cấu tạo màng tế bào vi khuẩn Vibrio .......................................11 Hình 1.5: Vị trí và cấu tạo tuyến ức cá mú Epinephelus malabaricus ....................26 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu ........................................................................42 Hình 2.2: Hệ thống bể (a) và cá mú chấm cam thí nghiệm (b) .................................46 Hình 2.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng phân lập bạch cầu .....................................48 Hình 2.4: Các bƣớc khảo sát hoạt tính thực bào ......................................................49 Hình 3.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides bị bệnh lở loét thu tại Khánh Hòa ..........57 Hình 3.2: Vibrio parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch máu ...............................62 Hình 3.3: Kết quả điện di trên gel agarose gen 16s rDNA của các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ..........................................................................................63 Hình 3.4: Cây phát sinh loài các chủng vi khuẩn Vibrio .........................................63 Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng Vibrio parahaemolyticus...................66 Hình 3.6: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .... 68 Hình 3.7: Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá mú chấm cam Epinephelus coioides khi bị cảm nhiễm bởi Vibrio parahaemolyticus với các chủng và mật độ vi khuẩn khác nhau ..........................................................................................................................68 Hình 3.8: Hình ảnh các loại tế bào máu cá mú chấm cam Epinephelus coioides ....72 Hình 3.9: Chỉ số thực bào của bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides......................................................................................................................78 Hình 3.10: Hình ảnh thực bào của các tế bào bạch cầu mô thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides ................................................................................................79 Hình 3.11: Hoạt tính RB của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus coioides .................................................................................................81 Hình 3.12: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở ngày thứ nhất (a) và ngày thứ 15 (b) sau khi ngừng cho ăn β-glucan ..........................................................................................83
x Hình 3.13: Kết quả phân tích phân tử globulin miễn dịch (IgM) của cá mú chấm cam bằng các kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot ...............................................86 Hình 3.14: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch bằng 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bị bất hoạt bằng formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490 nm ...................................................88 Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam Epinephelus coioides với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật Western Blot ...........................................................................................................................90 Hình 3.16: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides sau khi gây miễn dịch bằng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 đã bất hoạt bằng formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490 nm .........93 Hình 3.17: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công cƣờng độc ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch .......................................................97 Hình 3.18: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công cƣờng độc ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch .......................................................98
1 MỞ ĐẦU Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng phục vụ nhu cầu dinh dƣỡng cho con ngƣời, đồng thời đem lại kim ngạch xuất khẩu cho nhiều nƣớc có tiềm năng phát triển NTTS, trong đó có Việt Nam. Hiện nay, xu hƣớng phát triển NTTS thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng là nâng cao năng suất trên đơn vị diện tích ven bờ nhƣng đảm bảo sự phát triển bền vững, thân thiện với môi trƣờng tự nhiên. Tuy nhiên, cùng với mức độ thâm canh hóa, dịch bệnh là trở ngại chính cho sự phát triển bền vững sản lƣợng NTTS. Trong những năm qua, việc chữa trị các bệnh do vi khuẩn và do một số tác nhân khác bằng thuốc kháng sinh và hóa chất đã gây ra nhiều hậu quả tiêu cực, đã không mang lại hiệu quả chữa trị nhƣ mong muốn mà còn làm tăng chi phí sản xuất. Ngoài ra, việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị dẫn đến phát sinh các chủng vi khuẩn kháng thuốc, không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm [19] và ảnh hƣởng tới thị trƣờng xuất khẩu thủy sản của Việt Nam. Trƣớc bối cảnh đó, nghiên cứu và phát triển vaccine phòng bệnh cho các đối tƣợng nuôi thủy sản có giá trị kinh tế thực sự là một cuộc cách mạng trong phát triển NTTS; đây là việc làm cấp thiết và phù hợp với mục tiêu phát triển NTTS ổn định, bền vững và thân thiện với môi trƣờng. Để thực hiện định hƣớng này, các nghiên cứu cơ bản về đặc điểm hệ miễn dịch của đối tƣợng nuôi là một trong những bƣớc khởi đầu quan trọng cần tập trung ƣu tiên. Trên thế giới, nghiên cứu miễn dịch ở cá bắt đầu từ những năm 50 của thế kỷ thứ 18 và ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng miễn dịch học ở cá [204]. Trong vài chục năm gần đây, nghiên cứu sản xuất và sử dụng vaccine phòng bệnh cá đã đƣợc thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới và gần 100 loài cá đã đƣợc nghiên cứu về miễn dịch ở mức độ khác nhau [12]. Ở Việt Nam, nghiên cứu về miễn dịch ở cá vẫn còn khá mới mẻ và chúng ta chỉ mới ở những bƣớc đi đầu tiên. Điều này thể hiện qua số lƣợng công trình nghiên cứu liên quan đến miễn dịch và vaccine ở cá còn rất hạn chế. Chỉ một vài cơ quan nghiên cứu trong cả nƣớc bắt đầu nghiên cứu cũng nhƣ hợp tác với các tổ chức
2 trong và ngoài nƣớc về vaccine thủy sản và đa phần là nghiên cứu vaccine vi khuẩn trên cá nƣớc ngọt. Mặc dù vậy, cho tới nay vẫn chƣa có sản phẩm vaccine nào đƣợc công bố một cách chính thức trong nƣớc. Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) là một trong những loài cá mú có giá trị dinh dƣỡng cao, lớn nhanh nên đƣợc nuôi rất phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới và Việt Nam. Tuy nhiên, nghề nuôi cá mú đang chịu thiệt hại nặng nề do dịch bệnh trong những năm gần đây. Nhiều tác nhân gây bệnh (TNGB) trên cá mú đã đƣợc thông báo nhƣ virus [81], [89], ký sinh trùng [50], [49], [81], vi khuẩn [26], [81], [171]. Trong đó, bệnh do vi khuẩn Vibrio (dƣới đây viết tắt là Vibriosis) đã đƣợc phát hiện trên khoảng 48 loài cá biển và gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản ở nhiều nƣớc [27]. Riêng ở cá mú, Vibriosis có thể gây chết đến 70 % đàn cá mú nuôi [174]. Tại Việt Nam, Vibrio cũng đã đƣợc xác định là TNGB xuất huyết, lở loét, mòn vây ở cá mú nuôi và gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngƣời nuôi [5], [14], [148]. Để giảm thiểu những tổn thất kinh tế do Vibriosis gây ra, nhiều nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh bằng kháng sinh và hóa chất đã đƣợc chú ý. Tuy nhiên, hiệu quả đem lại vẫn chƣa ổn định mà còn kéo theo nhiều hệ lụy. Thiệt hại do bệnh vẫn luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi cá mú tại Việt Nam và các nƣớc trong khu vực; và cũng là nguyên nhân gây trở ngại trong việc phát triển cá mú trở thành đối tƣợng nuôi ở qui mô công nghiệp và xuất khẩu. Vì vậy, các nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học của cá mú đối với TNGB sẽ góp phần cung cấp thêm những thông tin về cơ chế kháng bệnh ở cá, làm tiền đề cho nghiên cứu sản xuất vaccine phòng bệnh cho cá là hƣớng đi đúng đắn và cần thiết. Xuất phát từ thực tiễn trên, đƣợc sự cho phép của Trƣờng Đại học Nha Trang, đề tài “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton,1822) nuôi tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus” đã đƣợc thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là làm rõ đặc điểm đáp ứng miễn dịch (ĐƢMD) ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus.
3 Nội dung nghiên cứu: 1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam. 2. Nghiên cứu ĐƢMD không đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus và ảnh hƣởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến đáp ứng này. 3. Nghiên cứu ĐƢMD đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án: 1. Về khoa học: Kết quả của luận án đóng góp những thông tin khoa học về đặc điểm ĐƢMD của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio; Góp phần xây dựng nền tảng để mở ra hƣớng nghiên cứu về miễn dịch học ở cá biển, một hƣớng mới đã góp phần nâng cao hiệu quả trong NTTS ở nhiều nƣớc tiên tiến nhƣng chƣa đƣợc phát triển ở Việt Nam. 2. Về thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất vaccine và dùng chất kích thích miễn dịch để phòng Vibiosis cho cá biển nuôi và đặc biệt là cá mú chấm cam tại Việt Nam. Tính mới của luận án 1. Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu cơ bản về miễn dịch học ở cá biển nói chung và cá mú nói riêng tại Việt Nam. 2. Luận án là một trong số ít công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu về ảnh hƣởng của chất kích thích miễn dịch β-glucan đến ĐƢMD không đặc hiệu của cá mú chấm cam thông qua biến đổi thành phần tế bào máu, hoạt tính thực bào, hoạt tính hô hấp và khả năng kháng bệnh.
4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides 1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu Hệ thống phân loại: Ngành động vật có xƣơng sống Vertebrata Lớp cá xƣơng Osteichthys Bộ cá vƣợc Perciformes Họ cá mú Serranidae Giống cá mú Epinephelus Loài cá mú chấm cam: Epinephelus coioides (Hamilton, 1822) [163] Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides Tên tiếng Anh: Orange-spotted grouper [163], Green grouper [118]. Tên tiếng Việt: Tùy theo từng địa phƣơng mà loài này có các tên gọi là cá mú chấm cam, cá mú chấm nâu, cá mú đen. Cá mú chấm cam có đặc điểm chung của giống cá mú Epinephelus nhƣ có thân thuôn dài, mình hơi hẹp, miệng rộng, có nhiều răng nhỏ, sắc nhọn. Đặc điểm nhận biết riêng nhƣ vây lƣng có XI gai cứng và 13 - 16 tia vây mềm, vây ngực có 18 - 20 tia mềm, vây bụng có I gai cứng và 5 tia mềm, vây hậu môn có III gai cứng
5 và 8 tia mềm; vây đuôi mềm và tròn. Đƣờng bên của cá có 58 - 65 vẩy. Vẩy trên cơ thể có dạng hình lƣợc, trừ ở ngực, bụng và vùng trên vây hậu môn. Cuống đuôi thƣờng hẹp. Mỗi bên mang, lƣợc mang có 8 - 10 phiến mang trên và 14 - 17 phiến mang dƣới. Nắp mang có 3 gai thẳng và thƣờng bị phủ dƣới da. Trên cơ thể có nhiều chấm màu cam hoặc nâu, màu sắc cơ thể thay đổi thích nghi theo môi trƣờng sống, giai đoạn phát triển và trạng thái sinh lý [163]. Cá thể có khối lƣợng lớn nhất ghi nhận đƣợc là 32 kg, chiều dài đạt 120 cm [68]. Giống với nhiều loài trong họ cá mú, cá mú chấm cam phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới, là loài thích sống nơi có rạn san hô và bãi đá ngầm. Đa số các loài phân bố ở độ sâu nhỏ hơn 100 m, chỉ một vài loài phân bố ở độ sâu 100 - 200 m (có trƣờng hợp đến 500 m) [68], [163]. Ở Việt Nam, cá mú chấm cam phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan, tập trung chủ yếu ở khu vực miền Trung nơi có nhiều vịnh, biển ven bờ với các rạn san hô, bãi đá ngầm, cỏ biển rất thích hợp cho cá mú sinh sống [10]. Cá mú chấm cam thuộc loài cá dữ, trong tự nhiên, chúng ăn giáp xác, cá có kích thƣớc nhỏ, động vật thân mềm. Tập tính bắt mồi của cá mú rất đặc trƣng là rình trong các khe đá, bụi rong, san hô để chộp mồi. Khả năng bắt mồi của cá mú tốt nhất ở 22 - 30 oC và có xu hƣớng giảm khi nhiệt độ nƣớc thấp hơn 18 oC [163]. Cá mú chấm cam có tuổi thọ trung bình khoảng 22 năm, cá thể cái trƣởng thành đạt chiều dài thân từ 25 - 30 cm ở 2 đến 3 năm tuổi, hiện tƣợng chuyển đổi giới tính xảy ra khi kích thƣớc của cá đạt từ 55 - 75 cm [75]. Cá mú chấm cam trƣởng thành có hiện tƣợng kết cặp trong mùa sinh sản, thƣờng vào tháng 3 đến tháng 6 hàng năm. Sức sinh sản thực tế phụ thuộc kích thƣớc cá cái, dao động khoảng 85 vạn trứng (cá cái dài 35 cm) đến gần 3 triệu trứng (cá cái dài 62 cm). Cá mú chấm cam thƣờng đẻ trứng ở vùng biển khơi, nơi có độ mặn thích hợp từ 30 - 35 ‰ và nhiệt độ khoảng 30 °C. Ấu trùng cá mú chấm cam sống ở vùng cửa sông, nơi có nhiều bùn lẫn cát, sỏi hoặc ở vùng rừng ngập mặn [68], [88].
6 1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam Nuôi trồng thủy sản trên thế giới ngày càng phát triển mạnh mẽ với nhiều đối tƣợng nuôi có giá trị nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng của con ngƣời. Trong đó, cá mú đƣợc xem là loài có giá trị kinh tế ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Thống kê của Pierre et al. (2007) cho thấy khoảng 90 % thực phẩm trên thế giới có nguồn gốc từ biển, trong đó, cá mú chiếm tỷ lệ khá lớn [158]. Với đặc tính dinh dƣỡng cao, thịt thơm ngon nên cá mú rất đƣợc ƣa chuộng ở thị trƣờng Nhật Bản, Hàn Quốc, Hồng Kông, Trung Quốc và một số nƣớc Châu Mỹ. Giá cá mú sống tại thị trƣờng phía Nam Trung Quốc và Hồng Kông lên tới 100 USD/kg [116]. Sản lƣợng cá mú tăng liên tục trong những năm gần đây. Trong đó, sản lƣợng khai thác chiếm phần lớn trong tổng sản lƣợng cá mú trên toàn thế giới và ngày càng có xu hƣớng tăng chậm do nguồn lợi suy giảm trong khi sản lƣợng nuôi đang tăng lên nhanh chóng. Thống kê của FAO (2012) cho thấy sản lƣợng khai thác năm 2010 đạt hơn 300 ngàn tấn, tăng 25 % so với sản lƣợng năm 2000 (244 ngàn tấn) và chiếm 79 % tổng sản lƣợng cá mú trong cùng năm. Trái lại, sản lƣợng cá mú nuôi tăng đột biến từ 9,5 ngàn tấn (năm 2000) đến 81 ngàn tấn (năm 2010), tăng hơn 747 %, chiếm 21 % tổng sản lƣợng cá mú trên toàn thế giới [69] (Hình 1.2). Năm a. b. Hình 1.2: Xu hƣớng sản lƣợng và giá trị cá mú trên thế giới [69] (a. Sản lượng cá mú nuôi và khai thác; b. Sản lượng cá mú nuôi và giá trị)
7 Mặc dù số liệu thống kê thể hiện sản lƣợng cá mú nuôi tăng lên nhƣng tổng giá trị ở các năm lại không ổn định, có năm lại giảm mạnh nhƣ năm 2006 và năm 2008 (Hình 1.2.b). Điều này cho thấy hiện tƣợng bão hòa của thị trƣờng đối với cá mú nuôi, đặc biệt do ngƣời nuôi chuyển sang sản xuất các loài cá mú có giá thấp hơn nên dẫn đến tổng giá trị giảm xuống [141]. Nghề nuôi cá mú đã bắt đầu từ năm 1970 ở Singapore, Malaysia, Hồng Kông, Thái Lan và Đài Loan [179]. Ngày nay, cá mú đƣợc nuôi ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới nhƣ Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Đài Loan, Hồng Kông, Hàn Quốc, Australia…[158]. Sản lƣợng cá mú nuôi trong giai đoạn từ năm 2000 đến 2010 tại các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi cá mú chủ yếu đƣợc thể hiện ở Hình 1.3. Hình 1.3: Sản lƣợng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu [69] Hình 1.3 cho thấy Trung Quốc, Đài Loan, Indonesia, Malaysia là những quốc gia và vùng lãnh thổ có sản lƣợng cá mú nuôi cao nhất thế giới và đối tƣợng đƣợc nuôi phổ biến nhất là cá mú chấm cam. Tại Việt Nam, nghề nuôi cá mú bắt đầu hình thành từ năm 1988, đƣợc duy trì và phát triển đến ngày nay. Vùng nuôi cá mú tập trung ở Hải Phòng, Quảng Ninh, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu. Các đối tƣợng nuôi chủ yếu bao gồm cá mú chấm cam E. coioides, cá mú chấm đen E. malabaricus, cá mú chấm đỏ E. akaara, cá mú
8 sỏi E. bleekeri, cá mú mỡ E. tauvina, cá mú cọp E. fuscoguttatus, cá mú sáu vạch E. sexfasciatus, cá mú chấm tổ ong E. merra, cá mú chấm xanh Plectropomus leopardus [13]. Nguồn cá mú giống cung cấp cho nuôi thƣơng phẩm chủ yếu đƣợc đánh bắt từ tự nhiên và hình thức nuôi chủ yếu là nuôi lồng trên biển hoặc nuôi ao đìa vùng triều với qui mô hộ gia đình. Hiện nay, cả nƣớc có khoảng gần 7000 lồng nuôi cá biển, trong đó, lồng nuôi cá mú chiếm 80 % và khoảng 500 ha ao đìa nuôi cá mú với sản lƣợng ƣớc tính khoảng 3.000 tấn/năm [13]. 1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi  Bệnh do vi rút ở cá mú nuôi Bệnh do vi rút nguy hiểm nhất đối với cá mú là bệnh hoại tử thần kinh do vi rút Viral Nervous Necrosis (VNN). Bệnh này xuất hiện trên cá ở các giai đoạn từ con giống cho đến trƣởng thành và gây chết với tỷ lệ cao, có thể lên đến 100 % quần đàn trong thời gian ngắn. Bệnh xảy ra phổ biến nhất ở cá mú chấm đỏ E. akaara, cá mú cọp E. fuscogutatus, cá mú chấm đen E. malabaricus…[81]. Cá giống 2 – 5 cm bị nhiễm VNN thƣờng có những biểu hiện đặc trƣng là thân có màu đen, bơi xoay vòng không định hƣớng và chết rất nhanh, không có biểu hiện tổn thƣơng ở bên ngoài. Tác nhân gây bệnh do virus trên cá mú đã đƣợc nghiên cứu bởi nhiều tác giả trên thế giới và biện pháp khắc phục thiệt hại do bệnh này đến nay chủ yếu là phòng bệnh [81], [89].  Bệnh do ký sinh trùng ở cá mú nuôi Bệnh do ký sinh trùng (KST) gây ra cũng rất phổ biến ở cá mú [50], [49], [81]. Hơn 80 % nông hộ cho biết cá nuôi có những biểu hiện bệnh liên quan đến KST. Các loại KST gặp nhiều nhất trên cá mú nuôi lồng là sán lá đơn chủ Monogenea, giáp xác Copepoda, Isopoda và động vật đơn bào (Trichodina, Cryptocaryon, Apiosoma). Chúng ký sinh trên da, trong miệng, mang, nắp mang, gây tƣa mang, khó thở, làm cá bỏ ăn, chậm lớn và thƣờng gây chết cao ở giai đoạn cá nhỏ [81].