Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu họ gen mã hóa nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu Cicer arietinum

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:159

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp "Nghiên cứu họ gen mã hóa nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu Cicer arietinum" trình bày các nội dung chính sau: Xác định các thành viên của họ gen mã hoá nhân tố phiên mã TCP ở cây đậu gà, đồng thời phân tích cấu trúc gen mã hoá của các thành viên nhóm TCP đã tìm được; Phân tích, đánh giá mức độ biểu hiện của các gen mã hoá nhân tố phiên mã TCP dưới điều kiện xử lý mất nước và ABA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu họ gen mã hóa nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu Cicer arietinum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU HỌ GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TCP TRONG ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN PHI SINH HỌC Ở CÂY ĐẬU CICER ARIETINUM LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU HỌ GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TCP TRONG ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN PHI SINH HỌC Ở CÂY ĐẬU CICER ARIETINUM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Đăng Khánh 2. TS. Trần Phan Lam Sơn HÀ NỘI - 2023
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trần Đăng Khánh và TS. Trần Phan Lam Sơn. Trong luận án này, các kết quả được thực hiện trung thực, một phần nội dung đã được công bố trong các Tạp chí khoa học quốc tế uy tín và cũng đã nhận được sự đồng ý của tất cả các tác giả trong các bài báo. Các nội dung trong luận văn cũng chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị nào khác. Toàn bộ các trích dẫn đều được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Trần Duy Cường
ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chương trình đào tạo hợp tác quốc tế IPA (International Program Associate) liên kết giữa Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam) và viện nghiên cứu RIKEN Nhật Bản. Trong suốt quá trình học tập và làm việc, mọi người đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án này. Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trần Đăng Khánh – Trưởng bộ môn Kỹ Thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp và TS. Trần Phan Lam Sơn, nguyên trưởng Nhóm nghiên cứu về đáp ứng với yếu tố bất lợi – Trung tâm Khoa học về nguồn tài nguyên bền vững, Viện RIKEN, Nhật Bản. Các thầy đã hướng dẫn tận tình chỉ bảo, giúp đỡ với những điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu luận án. Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thành viên thuộc Nhóm nghiên cứu về đáp ứng với yếu tố bất lợi của TS Trần Phan Lam Sơn. Mọi người đã hướng dẫn chi tiết và tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành được công trình nghiên cứu này. Hơn nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Đào tạo Sau đại học – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và lãnh đạo viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi để có thể hoàn thành tốt khoá học và hoàn thiện luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình tôi, mọi người luôn luôn động viên tôi ngay từ những ngày đầu bắt đầu khoá học cho tới lúc tôi có thể hoàn thành được công trình nghiên cứu và luận án này. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè, anh chị em và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập tại Nhật Bản cũng như thời gian hoàn thiện luận án tại Việt Nam. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Trần Duy Cường
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ x DANH MỤC HÌNH......................................................................................... xi MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. Tổng quan về cây đậu gà ....................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc, và phân bố của cây đậu gà .......................................... 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái cây đậu gà ......................................................... 4 1.1.3. Phân loại đậu gà ............................................................................... 5 1.1.4. Đa dạng di truyền đậu gà ................................................................. 7 1.1.5. Giá trị dinh dưỡng của cây đậu gà ................................................... 8 1.2. Các nghiên cứu về cây đậu gà.............................................................. 10 1.2.1. Chọn tạo các giống đậu gà mang đặc điểm mong muốn............... 10 1.2.2. Tình hình sản xuất cây đậu gà ...................................................... 22 1.3. Họ nhân tố phiên mã TCP .................................................................... 24 1.3.1. Nghiên cứu về các nhân tố phiên mã ở thực vật .......................... 24 1.3.2. Họ nhân tố phiên mã TCP ............................................................. 26 1.3.3. Vai trò và chức năng của nhóm phiên mã TCP ............................. 28 1.3.4. Chọn tạo các giống đậu gà chống chịu stress bất thuận dựa trên các nhân tố phiên mã ..................................................................................... 32
iv Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 40 2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 40 2.1.1. Hạt giống đậu gà và Arabidopsis................................................... 40 2.1.2. Hóa chất và các thiết bị nghiên cứu .............................................. 40 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu nghiên cứu .................................... 41 2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 41 2.3.1. Nhận dạng, xác định vị trí nhiễm sắc thể và phân tích các trường hợp sao chép gen của các gen CaTCP trong bộ gen cây đậu gà.............. 42 2.3.2. Xác định đặc tính của các Protein của CaTCPs ............................. 44 2.3.3. Phân tích cấu trúc của gen CaTCP ................................................ 45 2.3.4. Dự đoán các yếu tố điều hoà Cis .................................................. 46 2.3.5. Phân tích hiện tượng lặp gen ở họ gen mã hoá TCP trên đậu gà .. 47 2.3.6. Mức độ biểu hiện của gen mã hoá CaTCP bằng RT-qPCR và phân tích thống kê ............................................................................................ 49 2.3.7. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA, thiết kế mồi sử dụng cho phân tích sự biểu hiện gen TCP ở cây đậu gà ......................................... 50 2.3.8. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen CaTCP07 trong cây mô hình Arabidopsis ...................................................................................... 52 2.3.9. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen Arabidopsis chứa gen 35S:CaTCP07 ................................................................................... 53 2.3.10. Thu mẫu tách RNA đánh giá mức độ biểu hiện của gen CaTCP07 trong cây chuyển gen ............................................................................... 55 2.3.11. Đo mức độ rò rỉ ion ..................................................................... 56 2.3.12. Đo nhiệt độ bề mặt lá................................................................... 56
v 2.3.13. Mức độ biểu hiện của một số gen liên quan đến mã hoá các enzyme chống oxy hoá ............................................................................ 56 2.3.14. Phương pháp phân tích thống kê ................................................. 57 Chương III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 58 3.1. Xác định sự phân bố trên nhiễm sắc thể và sao chép gen của CaTCP 58 3.2. Phân tích cấu trúc của họ gen CaTCP ở cây đậu gà ............................ 61 3.3. Dự đoán các yếu tố điều hoà Cis ......................................................... 65 3.4. Biểu hiện của các gen CaTCP trong các cơ quan khác nhau trong các giai đoạn phát triển ...................................................................................... 66 3.5. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP trong lá và rễ của cây đậu gà trong điều kiện khử nước và xử lý ABA .................................................... 69 3.6. Mức độ biểu hiện của các gen mã hoá TCP giữa hai giống đậu gà ILC482 và Hashem ..................................................................................... 73 3.6.1. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá và rễ của giống ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý hạn ...................................................... 73 3.6.2. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá và rễ của giống ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA ................................................... 79 3.7. Kết quả thiết kế vector biểu hiện gen CaTCP07 trong cây mô hình Arabidopsis ................................................................................................. 85 3.8. Sàng lọc sơ bộ và lựa chọn các dòng cây Arabidopsis chuyển gen CaTCP07 ..................................................................................................... 87 3.9. Mức độ biểu hiện của gen CaTCP07 của cây Arabidopsis chuyển gen ..................................................................................................................... 91
vi 3.10. Khả năng chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển gen 35S:CaTCP07 so với cây đối chứng WT ................................................................................ 92 3.11. Khả năng bảo toàn tế bào và tốc độ thoát hơi nước bề mặt lá của cây chuyển gen .................................................................................................. 95 3.12. Sự biểu hiện của gen CaTCP07 giúp cây Arabidopsis chuyển gen phản ứng lại quá trình oxy hoá trong điều kiện hạn hán ............................. 96 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 99 Kết luận ....................................................................................................... 99 Kiến nghị ..................................................................................................... 99 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................. 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 102 PHỤ LỤC ..................................................................................................... 129
vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh Thuật ngữ tiếng việt ABA Abscisic acid Axit abscisic AFLP Amplified fragment length Đa hình chiều dài đoạn polymorphism khuếch đại AP2/ERF APETALA2/Ethylene response Các yếu tố liên kết đáp ứng element binding factors với ethylene APX Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase bHLH basic Helix – Loop – Helix Vùng cơ bản Helix-Loop- Helix bZIP bZIP transcription factor Yếu tố phiên mã bZIP CAT Catalase Catalaza cDNA complementary DNA ADN bổ sung CDS Coding sequence Trình tự mã hóa CSD1 Copper/Zinc superoxide Copper/Zinc superoxide dismutase 1 dismutase 1 CTDB Chickpea transcriptome Cơ sở dữ liệu hệ phiên mã database cây đậu gà CYC Cycloidea Yếu tố điều hòa trong sự phát triển tính đối xứng của hoa. DNA Deoxinucleic acid Axit deoxinucleic DREB Dehydration responsive Protein liên kết với yếu tố element-binding protein đáp ứng mất nước ERF Ethylene Responsive Factor Yếu tố phản ứng với Ethylene FB Flower bud stages Giai đoạn nụ hoa FL Flower stages Giai đoạn hoa
viii gDNA genomic DNA DNA nhiễm sắc thể GM Germination medium Môi trường nảy mầm GS germinating seedlings Hạt nảy mầm HSP90 heat shock protein 90 Protein sốc nhiệt 90 ITS Internal transcribed spacer Vùng mã hóa đoạn RNA không đóng vai trò chức năng trong vùng mã hóa các RNA ribosome nhân. kDa Kilodalton Đơn vị khối lượng nguyên tử L1/L2 Line1/Line2 Dòng1/dòng2 MAS Marker-assisted selection Chọn giống nhờ chỉ thị phân từ liên kết với tính trạng mục tiêu. mRNA Messenger RNA RNA thông tin mW Molecule Weight Trọng lượng phân tử MYB MYB transcription factor Yếu tố phiên mã MYB NAC NAM (no apical meristem), Yếu tố phiên mã NAC ATAF1/2, CUC2 (cup-shaped cotyledon) NF-Y Nuclear transcription factor-Y Nhân tố phiên mã Y NGS Next-Generation Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới PCF1/2 Proliferating Cell Nuclear Nhân tố kháng nguyên nhân Antigen Factor1/2 tế bào tăng sinh 1/2 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase qRT-PCR Quantitative real-time PCR PCR định lượng QTL Quantitative trait locus Locus tính trạng số lượng RD29A Responsive to desiccation 29A Đáp ứng với sự mất nước 29A
ix RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNA-seq RNA sequencing Phân tích giải trình tự RNA ROS Reactive oxygen species Các loại phản ứng oxi hóa SAM shoot apical meristem Mô phân sinh đỉnh chồi SNP single nucleotide Đa hình nucleotide đơn polymorphism SSR Simple Sequence Repeat Trình tự đơn lặp lại STMS Sequence-tagged trình tự vùng vi vệ tinh đích microsatellite sites TB1 Teosinte Branched1 Gen mục tiêu đặc hiệu chồi bên. TF Transcription factor Yếu tố phiên mã TF TCP Transcription Factor Teosinte Transcription Factor Teosinte Branched1/ Cycloidea/ Branched1/ Cycloidea/ Proliferating Cell Nuclear Proliferating Cell Nuclear Antigen Factor1/2 Antigen Factor1/2 WDS Water Deficit Stress stress thiếu hụt nước WRKY WRKY transcription factor Yếu tố phiên mã WRKY WT Wild-type Loài (cây) gốc, loài nguyên thủy, cây đối chứng không chuyển gen WW Well-watered Tưới nước đầy đủ YL Young leaf Lá non
x DANH MỤC BẢNG TT Bảng Nội dung Trang 2.1 Đột biến điểm gây ra sự thay thế đồng nghĩa và không 48 đồng nghĩa 2.2 Các cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm được thiết kế 51 bằng phần mềm Primer3 3.1 Thông tin chi tiết của các gen CaTCP đã được xác 60 định 3.2 Đặc điểm nhận dạng CaTCP 63 3.3 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai giống 76 đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước 3.4 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai 78 giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước 3.5 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai 81 giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA 3.6 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai 83 giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA
xi DANH MỤC HÌNH TT Hình Nội dung Trang 1.1 Hoa của hai loại đậu gà Desi và Kabuli 6 1.2 Chiến lược nghiên cứu về khả năng chống chịu hạn, 15 nắng nóng trên cây đậu gà 1.3 Thách thức và trọng tâm được đưa ra trong nghiên cứu 21 liên quan đến chuyển gen và chỉnh sửa bộ gen của đậu gà trên toàn thế giới 1.4 Tỷ trọng sản lượng đậu gà trung bình hàng năm theo 24 khu vực từ năm 2008 đến năm 2017 1.5 Vị trí và cơ chế điều khiển của Transcription factor 26 2.1 Cách tiếp cận để xác định nhóm TF TCP trên đối tượng 42 đậu gà 2.2 Cách tiếp cận để xác định nhóm TF TCP trên đối tượng 43 đậu gà (TT) 2.3 Mô tả cách tiếp cận công cụ ExPASy-Protparam 44 2.4 Mô tả cách tiếp cận công cụ ExPASy-Protparam (TT) 45 2.5 Mô tả cách tiếp cận công cụ phân tích cấu trúc gen 46 2.6 Mô tả cách tiếp cận công cụ PlantCARE nhằm xác định 47 các yếu tố điều hoà Cis 3.1 Xác định vị trí của các gen CaTCP trên nhiễm sắc thể 59 3.2 Phân tích cấu trúc và phát sinh gen của 23 thành viên 62 CaTCP được xác định 3.3 Biểu hiện của các gen CaTCP đã được xác định trong 68 các cơ quan khác nhau trong quá trình sinh trưởng và phát triển của đậu gà trong các điều kiện sinh trưởng bình thường thu được từ Cơ sở dữ liệu phiên mã cây
xii đậu gà (CTDB) 3.4 Phân tích biểu hiện các gen CaTCP trong mẫu lá cây 71 đậu gà trong điều kiện mất nước và xử lý ABA bằng cách sử dụng qRT-PCR 3.5 Phân tích biểu hiện của các gen CaTCP trong mẫu rễ 72 cây đậu gà trong điều kiện mất nước và xử lý ABA bằng cách sử dụng qRT-PCR 3.6 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai 75 giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước 3.7 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai 77 giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước 3.8 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai 82 giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA 3.9 Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai 84 giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA 3.10 Kết quả điện di kiểm tra thiết kế vector pENTR/D- 87 TOPO CaTCP07 3.11 Cây sau khi được chuyển cấu trúc 35S:CaTCP07 ở thế 88 hệ T0 3.12 Chọn lọc các cây mang gen CaTCP07 89 3.13 Sàng lọc dòng L1, L2 mang cấu trúc 35S:CaTCP07 90 3.14 Mức độ biểu hiện của gen CaTCP07 trong 2 dòng 91 chuyển gen L1 và L2
xiii 3.15 Kiểu hình chịu hạn của cây chuyển gen 35S:CaTCP07 93 L1 và L2 bằng phương pháp phân tích tỉ lệ cây sống sót sau xử lý hạn 3.16 Kiểu hình chịu hạn của cây chuyển gen 35S:CaTCP07 94 L1, L2 và WT khi sử dụng phương pháp đánh giá mức độ giảm sinh khối trong điều kiện đầy đủ và thiếu hụt nước 3.17 So sánh mức độ rò rỉ ion của cây chuyển gen 95 35S:CaTCP07 L1, L2 và WT dưới điều kiện gây hạn nhân tạo 3.18 Mức độ biểu hiện của các gen mã hoá các enzyme 97 chống oxy hoá trên cây chuyển gen 35S:CaTCP07 L1, L2 và cây đối chứng WT
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sự gia tăng dân số hiện nay trên thế giới đang dần vượt quá sự đáp ứng về nguồn lương thực cung cấp đủ để bù đắp cho số lượng người gia tăng. Bên cạnh đó, quá trình biến đổi khí hậu toàn cầu cũng tác động không nhỏ đến năng suất chất lượng lương thực. Trong đó các điều kiện bất lợi như lạnh, hạn hán và ngập mặn là ba trong số các yếu tố chính tác động trực tiếp đến sự phát triển và hạn chế năng suất cây trồng. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, cơ thể thực vật luôn luôn diễn ra các quá trình thay đổi phức tạp khi gặp phải những điều kiện bất lợi. Thực vật đáp ứng với các bất lợi phi sinh học được diễn ra ở các giai đoạn khác nhau dưới sự tác động của một hoặc nhiều yếu tố bất lợi trong cùng một thời điểm. Nghiên cứu và tìm hiểu rõ về các cơ chế phản ứng lại của cây trồng sẽ giúp nâng cao được năng suất cây trồng, vì vậy đây là vấn đề được xem như rất quan trọng và là trọng tâm của các đề tài nghiên cứu khoa học hiện nay. Dưới tác động của các yếu tố ngoại cảnh bất lợi, một loạt các thay đổi về sinh lý, sinh hóa diễn ra bên trong cơ thể thực vật như: sự rò rỉ ion (electrolytic leakage), thay đổi hàm lượng nước (relative water content), kích thích phát triển bộ rễ, và đặc biệt dễ nhận thấy trên cơ thể thực vật đó là sự thay đổi về lá như giảm diện tích lá, héo lá hoặc thậm chí rụng lá. Ngoài ra, các điều kiện bất lợi còn làm tăng sự tích lũy các gốc tự do phá vỡ sự cân bằng nội mô tế bào bằng cách phản ứng với protein, lipid và các axit nucleic dẫn đến oxi hóa lipid, gây tổn thương tế bào và làm bất hoạt enzyme, làm ảnh hưởng đến các hoạt động của tế bào. Các phản ứng xảy ra bên trong cơ thể thực vật với các yếu tố tác động bất lợi phi sinh học đó là nhận diện yếu tố bất lợi, ngay sau đó tín hiệu được truyền đến các thành phần tiếp nhận, qua đó
2 kích hoạt chức năng gene biểu hiện và kích thích các nhân tố phiên mã (TFs), sau cùng dẫn tới những thay đổi về trao đổi chất của thực vật để chống chịu với các điều kiện bất lợi tác động. Hiện nay, một số nhóm nhân tố phiên mã đã được nghiên cứu có liên quan đến khả năng chịu hạn của cây trồng. Trong đó, nhóm nhân tố phiên mã TCP cũng đã được chứng minh có liên quan đến khả năng tăng cường sức chống chịu của cây trồng với các stress bất lợi ngoài tự nhiên như nhiệt độ cao/thấp, mặn và hạn. Chính từ những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán với cây trồng nói chung và cây đậu gà và cụ thể là nhu cầu lương thực trên thế giới và Việt Nam. Chúng tôi đã xây dựng luận án nghiên cứu khoa học với tiêu đề “Nghiên cứu họ gen mã hoá nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu Cicer arietinum”. Kết quả đã xác định và mô tả đặc tính của tất cả các gen CaTCPs giả định ở cây đậu gà. Trong nghiên cứu này, biểu hiện của các gen CaTCPs trong các mô/cơ quan khác nhau được xử lý trong các điều kiện đầy đủ nước, mất nước và axit abscisic (ABA) cũng được nghiên cứu để cung cấp cái nhìn sâu sắc về vai trò tiềm năng của nhóm nhân tố phiên mã CaTCPs. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án 2.1. Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu xác định và phân tích chức năng của họ gen mã hoá nhân tố phiên mã TCP liên quan đến tính chống chịu điều kiện bất lợi ở cây đậu gà. 2.2. Mục tiêu cụ thể Xác định các thành viên của họ gen mã hoá nhân tố phiên mã TCP ở cây đậu gà, đồng thời phân tích cấu trúc gen mã hoá của các thành viên nhóm TCP đã tìm được. Phân tích, đánh giá mức độ biểu hiện của các gen mã hoá nhân tố phiên
3 mã TCP dưới điều kiện xử lý mất nước và ABA. Sử dụng kỹ thuật qRT-PCR để lựa chọn ra các gen tiềm năng có đáp ứng tốt với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, đặc biệt là hạn hán. Kiểm tra chức năng chịu hạn của gen tiềm năng bằng các thí nghiệm đánh giá mức độ chịu hạn của thực vật. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Luận án cho thấy nhóm nhân tố phiên mã CaTCP có liên quan đến khả năng thích ứng với stres hạn của cây đậu gà. Ngoài ra, sự biểu hiện mạnh của gen CaTCP07 ở cây Arabidopsis đã làm tăng khả năng chịu hạn của cây đậu gà. Việc tìm kiếm, phân tích và xác định được các gen mã hoá của nhóm TF TCP trên cây đậu gà đã cung cấp nguồn vật liệu gen có giá trị cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về gen chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Tìm ra được một số gen tiềm năng của nhóm TF TCP sẽ mở ra hướng mới trong việc ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học để tạo ra các cây trồng mang khả năng chống chịu cao hơn khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi. 4. Những đóng góp mới của luận án Kết quả của luận án cho thấy nhóm TF TCP là một trong những nhóm TF có nhiều gen đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi trên cây đậu gà. Trong đó nhận thấy gen CaTCP07 là một gen ứng viên tiềm năng đáp ứng mạnh mẽ trong điều kiện mất nước và ABA. Kết quả cũng đã xác định được xác thành viên cụ thể của nhóm TF TCP trên cây đậu gà. Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về nhóm TF CaTCP tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Điều này mở ra hướng mới trong việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm tạo ra các cây trồng chuyển gen chứa các gen CaTCPs tiềm năng để tăng tính chống chịu của cây trồng, từ đó nâng cao năng suất sản lượng.
4 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây đậu gà 1.1.1. Nguồn gốc, và phân bố của cây đậu gà Đậu gà (Cicer arietinum L.) thuộc họ Fabaceae, có di tích khảo cổ với niên đại 10000 năm trước Công nguyên và được tìm thấy ở phía đông nam Thổ Nhĩ Kỳ hoặc ở các khu vực lân cận (Tây Bắc Syria), tương ứng với sự phân bố hiện tại của Cicer reticulatum, tổ tiên của đậu gà [106], [163], [177]. Tanno và cs., 2006 đã xem xét lại lý thuyết về nguồn gốc và sự phân bố của đậu gà và kết luận rằng hồ sơ sớm nhất về đậu gà ở Ấn Độ có niên đại từ năm 2000 trước Công nguyên tại Uttar Pradesh, đồng thời các hạt còn sót lại từ năm 300 trước Công nguyên đến năm 100 trước Công nguyên đã được tìm thấy gần Aurangabad [164]. Đánh giá báo cáo rằng đậu gà lan rộng theo sự di chuyển của con người về phía tây tới lưu vực Địa Trung Hải và về phía nam tới tiểu lục địa Ấn Độ thông qua Con đường tơ lụa (Afghanistan). Ở Ethiopia, phát hiện sớm nhất về đậu gà được báo cáo vào năm 1520 trước Công nguyên. Người Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha đã giới thiệu đậu gà đến thế giới vào khoảng năm 1500 sau Công nguyên, và đậu gà kabuli (đậu garbanzo) có nguồn gốc gần đây ở Ấn Độ (1500 sau Công nguyên). Tuy nhiên, với việc sử dụng các chỉ thị phân tử để đánh giá mức độ đa dạng di truyền trong và giữa các giống cho thấy các nước như Pakistan, Afghanistan, Đông nam nước Nga và Lebanon được đề xuất là trung tâm xuất xứ do có độ đa dạng cao [147]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái cây đậu gà Duke, 2012 đã mô tả cây đậu gà là “Cây thảo hàng năm, mọc thẳng hoặc mọc lan, phân nhánh nhiều, cao 0,2-1 m, màu ô liu, màu xanh đậm hoặc xanh lục [51]. Lá không có lông với 3-8 cặp lá chét và một lá chét trên cùng; từ hình trứng đến hình elip, dài 0,6-2,0 cm, rộng 0,3-1,4 cm; mép có răng cưa, đỉnh lá nhọn, đáy hình nêm; lá kèm có 2-5 răng. Hoa đơn nhưng đôi khi có 2-
5 3 hoa trên một chùm hoa, cuống dài 0,6-3 cm, lá bắc hình tam giác hoặc ba bên, hướng lên trên dài tới 2 mm; đài hoa dài 7-10 mm; tràng hoa màu trắng, hồng, tía (nhạt dần sang xanh) hoặc xanh lam, 0,8- dài 1,2 cm. Vỏ quả hình thoi, có 1-2 hạt, dài 1,4-3,5 cm, rộng 0,8-2 cm, phồng lên. Hạt màu kem, vàng, nâu, đen hoặc xanh, tròn đến hình trứng dạng góc, 0,4-1,4 x 0,4-1 cm; vỏ hạt nhẵn hoặc nhăn nheo, hoặc có củ, được nén về phía sau với một rãnh ở giữa khoảng 2/3 hạt, có hình mỏ chim phía trước; cryptocotylar nảy mầm. Ra hoa mùa hè (Địa Trung Hải, Trung Đông), mùa đông (Ấn Độ); Quả mùa hè thu (Địa Trung Hải, Trung Đông), tháng 3-tháng 4 (Ấn Độ)”. Nhiều loại cây trồng từ họ Fabaceae, bao gồm cả đậu gà, là nguồn cung cấp nitơ cho đất rất lớn do cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium, vi khuẩn cố định nitơ khí quyển trong đất. 1.1.3. Phân loại đậu gà Có hai loại đậu gà được trồng riêng biệt: Desi và Kabuli: Loại Desi (microsperma) có hoa màu hồng tím, sắc tố anthocyanin trên thân và có màu và vỏ hạt dày. Loại Kabuli (macrosperma) có màu trắng hoa, thiếu sắc tố anthocyanin trên thân và có hạt màu trắng hoặc màu be, có hình đầu cừu đực, vỏ hạt mỏng và bề mặt hạt nhẵn ( Hình 1.1) [106]. Các giống đậu gà có thể khác nhau về màu sắc và kích thước hoa, hạt, thời gian sinh trưởng, năng suất và khả năng chống chịu. Hạt đậu gà Desi được chứng minh là có vỏ hạt dày và nhiều loại màu sắc và sự kết hợp của màu nâu, vàng, xanh lá cây và đen. Những bông hoa được mô tả là có màu hồng, với một số trường hợp ngoại lệ có màu trắng và thực vật có sắc tố anthocyanin thay đổi, mặc dù một số có thể không có sắc tố như vậy trên thân cây [51]. Hạt đậu gà Kabuli có đặc điểm là màu trắng hoặc màu be, hình đầu cừu, mỏng vỏ hạt, bề mặt nhẵn, hoa màu trắng và không có sắc tố anthocyanin trên thân. Những hạt này có hàm lượng sucrose cao hơn, hàm