Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội

Chia sẻ: Trần Đức Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:145

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn tại điểm giết mổ; xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản phẩm thịt tươi.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UYỄ Ị A ỦY Ê ỨU M SỐ Ặ Í ỦA V K UẨ ESCHERICHIA COLI ( ÓM V E ) Â LẬ Ừ BÒ, LỢ Ợ Ế MỔ LUẬ Á Ế SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học hú y Mã số : 62 62 50 10 ih n n h học: 1. S. uyễn Bá iên 2. S. ỗ ọc húy - 2012
i L AM OA Tôi xin cam đoan: Luận án “Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong luận án này là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận án này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc. ác iả luận án uyễn hị h nh hủy
ii L ẢM Ơ Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Đào tạo Sau Đại học, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, Cơ quan Thú y vùng I đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo Nghiên cứu sinh tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Thú y Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi điều tra, lấy mẫu thực hiện đề tài. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học là TS. Nguyễn Bá Hiên - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và TS. Đỗ Ngọc Thúy - Viện Thú y đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Cù Hữu Phú, ThS. Lưu Thị Hải Yến và tập thể cán bộ Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Cơ quan Thú y vùng I, nơi tôi công tác đã ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án này. Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bố mẹ, chồng và hai con trai cùng các bạn đồng nghiệp, bạn bè đã đồng hành, đóng góp công sức, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2012 ác iả luận án uyễn hị h nh hủy
iii MỤ LỤ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vii Danh mục các bảng ix Danh mục hình xi MỞ ẦU 1 1 Tính cấp thiết của đề tài 1 2 Mục tiêu của đề tài 3 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 4 Những đóng góp mới của luận án 4 h ơn 1 Ổ QUA L U 5 1.1 Vi khuẩn E. coli 5 1.1.1 Phân loại E. coli 8 1.1.2 Đặc tính của vi khuẩn E. coli 9 1.2 Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) 14 1.2.1 Danh pháp 14 1.2.2 Một số yếu tố độc lực của vi khuẩn nhóm VTEC 15 1.2.3 Vai trò của VTEC không thuộc nhóm O157 22 1.2.4 VTEC ở động vật 24 1.2.5 VTEC trong thực phẩm 28 1.2.6 Nhiễm VTEC ở người 29 1.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli và bệnh do chúng gây ra tại Việt Nam 31 1.4 Phương pháp phát hiện VTEC trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm 32
iv 1.4.1 Phương pháp vi sinh vật 33 1.4.2 Phương pháp miễn dịch học 33 1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử 34 1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng để phân loại vi sinh vật 40 1.5.1 Nguyên tắc 41 1.5.2. Kỹ thuật 42 1.5.3 Ứng dụng của kỹ thuật phân tích PFGE 44 h ơn 2 DU , UYÊ L U V Ơ Á Ê ỨU 45 2.1 Nội dung nghiên cứu 45 2.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa bàn Hà Nội 45 2.1.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi khuẩn VTEC 45 2.1.3 Tỷ lệ nhiễm và một số đặc tính cơ bản của những chủng VTEC phân lập được 45 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 46 2.3 Đối tượng nghiên cứu 46 2.4 Nguyên liệu nghiên cứu 46 2.4.1 Môi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 46 2.4.2 Các chủng vi khuẩn đối chứng dương và âm 47 2.5 Phương pháp nghiên cứu 47 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 47 2.5.2 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn trong canh khuẩn nuôi cấy 48 2.5.3 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR 48 2.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR 51
v 2.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR 52 2.5.6 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn VTEC 52 2.5.7 Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn phân lập được 54 2.5.8 Xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc khác nhau bằng phản ứng PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis) 55 2.5.9 Xử lý số liệu 56 h ơn 3 KẾ QUẢ V ẢO LUẬ 57 3.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y trên địa bàn Hà Nội 57 3.1.1 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ tại các điểm giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội 57 3.1.2 Kết quả điều tra điều kiện giết mổ và phương tiện vận chuyển của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 60 3.1.3 Thực trạng vệ sinh tại khu giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội 64 3.1.4 Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại cơ sở kinh doanh, chợ, tiêu thụ sản phẩm thịt gia súc, gia cầm 69 3.2 Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi khuẩn VTEC 70 3.2.1 Lựa chọn giữa PCR đơn mồi và Multiplex - PCR 70 3.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu 73 3.2.3 Kết quả thực hiện phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn E. coli tham chiếu 75 3.2.4 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR dùng để xác định VTEC trong môi trường nhân tạo 77
vi 3.2.5 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR dùng để xác định VTEC trong mẫu thịt sạch 83 3.2.6 Quy trình xác định sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt 85 3.3 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm VTEC trên bò, lợn tại các điểm giết mổ và chợ thuộc địa bàn Hà Nội 87 3.3.1 Thu thập mẫu 87 3.3.2 Phân lập và giám định đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E. coli 89 3.3.3 Kết quả phân lập VTEC trong thịt 93 3.3.4 Kết quả phân lập VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân tại lò mổ 96 3.3.5 Kết quả xác định các loại độc tố của các chủng VTEC phân lập được 98 3.3.6 Kết quả xác định serotyp O của các chủng VTEC phân lập được 100 3.3.7 Kết quả phân tích quan hệ di truyền của một số chủng vi khuẩn VTEC phân lập được có nguồn gốc khác nhau 103 KẾ LUẬ V Ề Ị 107 Kết luận 107 Đề nghị 108 Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 109 Tài liệu tham khảo 110 Phụ lục 125
vii DA MỤ Á ỮV Ế Ắ A/E Attaching and Effacing BHI Brain Heart Infusion bp base pair BPW Buffer Peptone Water Cs. Cộng sự CT-SMAC Cefixime Tellurite Selective Supplement DNA Deoxyribonucleic Acid EaggEC Enteroaggregative E. coli E. coli Escherichia coli EHEC Enterohaemorrhagic E. coli EIEC Entero invasive E. coli EPEC Enteropathogenic E. coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent asay ETEC Enterotoxigenic E. coli FDA Food and Drug Administration HC Hemorrhagic colitis HUS Hemolytic uremic syndrome kDa Kilodalton LB Luria Bertani MR Methyl Red mDa Megadalton m-TSB modified Trypticase Soy Broth NB Nutrient Broth OMP Outer membrane protein PCR Polymerase chain reaction PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis
viii SLT Shiga - like toxin TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TE Tris-EDTA buffer TTP Thrombotic thrombocytopenic purpure TSB Tryptic Soy Broth VK Vi khuẩn VP Voges-Proskauer VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm VT Verotoxin VTEC Verotoxigenic Escherichia coli WHO Tổ chức Y tế thế giới
ix DAN MỤ Á BẢ STT Tên bảng Trang 1.1 Hoạt tính sinh học của các loại VT 19 1.2 Một số enzym cắt hạn chế được dùng cho kỹ thuật PFGE 43 2.1 Trình tự mồi dùng để xác định các gen VT1, VT2 và eae 49 2.2 Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng để xác định các gen VT1, VT2 và eae 50 2.3 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định gen VT1, VT2 và eae 50 2.4 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương 51 2.5 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn đối chứng âm 51 3.1 Số lượng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm trên địa bàn Hà Nội 59 3.2 Kết quả điều tra điều kiện điểm giết mổ và phương tiện vận chuyển của các điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 62 3.3 Thực trạng vệ sinh của các điểm giết mổ gia súc, gia cầm thuộc địa bàn Hà Nội 68 3.4 Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR đơn và Multiplex - PCR để phát hiện một số gen độc lực của VTEC 72 3.5 Kết quả xác định môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn E. coli để chiết tách DNA cho phản ứng PCR 73 3.6a Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex – PCR để phát hiện các chủng vi khuẩn E. coli đối chứng dương 75 3.6b Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex – PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng âm 75
x 3.7 Kết quả nuôi cấy hai chủng vi khuẩn đối chứng dương trên một số môi trường nuôi cấy 78 3.8 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khi xác định VTEC trên môi trường nuôi cấy 80 3.9 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khi xác định VTEC trong mẫu thịt sạch 84 3.10 Tổng hợp số lượng và chủng loại mẫu thu thập được tại một số điểm giết mổ trên địa bàn Hà Nội 88 3.11 Tổng hợp số lượng mẫu thịt thu thập được tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội 89 3.12 Kết quả phân lập chủng E. coli từ mẫu ban đầu 90 3.13 Kết quả kiểm tra các đặc tính của vi khuẩn E. coli phân lập được 91 3.14 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu thịt 93 3.15 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu lau thân thịt và mẫu phân 96 3.16 Khả năng sản sinh độc tố của các chủng VTEC phân lập được 98 3.17 Kết quả xác định serotyp của các chủng VTEC phân lập được 101
xi DA MỤ Ì TT Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc kháng nguyên O 12 1.2 Cơ chế tác động của độc tố VT 18 1.3 Nguyên lý của phản ứng PCR 38 1.4 Chu trình nhiệt độ của phản ứng PCR 38 1.5 Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau khi xử lý với enzym cắt hạn chế Sma I với vi khuẩn Haemophilus influenzae. 42 2.1 Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn 53 3.1 Sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn đối chứng dương và âm sau quá trình điện di 77 3.2 Kết quả nuôi cấy chủng FD636 ở các nồng độ pha loãng khác nhau trên thạch máu 79 3.3 Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha loãng khác nhau từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng FD636 82 3.4 Sản phẩm của phản ứng PCR với nồng độ pha loãng khác nhau từ môi trường LB đã nuôi cấy chủng FD523 82 3.5 Quy trình xác định VTEC trên thịt 86 3.7 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường MacConkey 92 3.8 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường thạch máu 92 3.9 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường EMB 92 3.10 Tính chất mọc của E. coli trên môi trường CT-SMAC 92 3.11 Khả năng lên men sinh hơi một số loại đường của E. coli 92 3.12 Khả năng sinh Indol của E. coli 92 3.13 Sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu thịt sau quá trình điện di 94 3.14 Sản phẩm của phản ứng PCR từ khuẩn lạc riêng biệt của một số mẫu thịt sau quá trình điện di 95
xii 3.15 Sản phẩm của phản ứng PCR từ mẫu phân và mẫu lau thân thịt sau quá trình điện di 97 3.16 Sản phẩm của phản ứng PCR từ những khuẩn lạc riêng biệt của mẫu phân sau quá trình điện di 98 3.17 Kết quả phân tích quan hệ di truyền của vi khuẩn VTEC bằng phương pháp PFGE 105 3.18 Hình ảnh điện di xung trường (PFGE) của một số chủng vi khuẩn VTEC phân lập được 106
1 MỞ ẦU 1 Tính cấp thiết củ đề tài Trên phạm vi thế giới, ước tính hàng năm có khoảng 2 tỷ người bị ngộ độc thực phẩm (Đậu Ngọc Hào, 2011) [2]. Ở Việt Nam, theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) có khoảng 8 triệu người bị ngộ độc thực phẩm mỗi năm, trong đó phần lớn xảy ra tại các bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn của học sinh. Năm 2010, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm, làm hơn 5.000 người mắc và 42 trường hợp tử vong. Thiệt hại kinh tế cho chi phí điều trị bệnh và nghỉ làm việc khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011) [101]. Các con số trên đây cho thấy một thực trạng đáng lo ngại về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP). VSATTP có vai trò rất quan trọng đối với cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng môi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản phẩm, uy tín quốc gia. Trong số rất nhiều nguyên nhân vi sinh vật gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm ở người (Salmonella, E. coli, Vibrio cholera, Listeria, Clostridium botulinum ...), những năm gần đây, các vi khuẩn E. coli thuộc nhóm Verotoxigenic (VTEC) ngày càng được biết đến như là một trong những tác nhân quan trọng. Verotoxigenic E. coli là khái niệm dùng để chỉ nhóm các vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra độc tố Verotoxin hoặc Shiga-like toxin. Các chủng VTEC là nguyên nhân gây ra các ca bệnh lẻ tẻ hoặc các ổ dịch lớn bệnh viêm ruột xuất huyết (HC) và hội chứng urê huyết (HUS), ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP), viêm đường niệu (Urinary tract infections), viêm màng não (meningitis) (XU và cs. 1999) [92]; (Lake và Cressey, 2002) [49]. Mặc dù E. coli O157: H7 vẫn được biết đến như là một serotyp chính
2 phân lập được từ các vụ dịch ở hầu hết các quốc gia, các chủng VTEC thuộc các serotyp khác cũng đã được chứng minh là có mối liên quan chặt chẽ với các vụ dịch tương tự như serotyp O111 ở Canada, Italia, Đức và Australia, O103 ở Pháp, Italia và O104 ở Mỹ. Ở rất nhiều quốc gia, VTEC là tác nhân gây bệnh tiêu chảy rất hay gặp (Wachsmuth, 1994) [95]. Ví dụ, ở Đức, VTEC được phân lập từ trẻ em bị tiêu chảy là nguyên nhân vi khuẩn thường gặp đứng thứ 2, sau Salmonella và ở Áo, VTEC là nguyên nhân thường gặp thứ 3, sau Salmonella và Campylobacter (Allerberger và cs. 1996) [12]. Gần đây nhất, tháng 6 năm 2011, một đợt dịch do E. coli đã bùng phát tại Đức và nhanh chóng lan ra các quốc gia châu Âu khác. WHO cho biết, trên phạm vi toàn thế giới có hơn 1.270 ca nhiễm và 552 ca tiến triển thành HUS; con số tử vong lên tới 18 người bao gồm 17 trường hợp ở Đức và 1 trường hợp ở Thụy Điển. Nguyên nhân của đợt dịch được xác định là do rau quả bị nhiễm E. coli O104. Vụ dịch này gây tổn thất nặng nề tới nền kinh tế thuộc liên minh châu Âu (EU), ước tính mỗi tuần người nông dân tại đây thất thu 200 triệu euro (tương đương 290 triệu USD). Ở động vật, VTEC là nguyên nhân gây ra chứng viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở bò, gây phù đầu ở lợn. Động vật nhai lại, đặc biệt bê và bò là nguồn tàng trữ mầm bệnh tiềm tàng và việc tiêu thụ các loại thực phẩm (thịt bê, bò, các sản phẩm sữa) chưa qua xử lý kỹ là nguyên nhân chính gây ra các trường hợp bị bệnh ở người do VTEC. Các nghiên cứu tại một số quốc gia về sự tạp nhiễm phân ở các trang trại chăn nuôi bò sữa, đã chỉ ra sự dao động rất lớn về tỷ lệ nhiễm của các chủng VTEC thuộc nhóm O157 (từ 0,2 đến 48,8%) và không thuộc nhóm O157 (từ 0,4 đến 74,0%). Trong những thập kỷ gần đây, ô nhiễm vi khuẩn E. coli thuộc nhóm VTEC sản sinh độc tố Verotoxin (VT) trong thực phẩm đã trở thành đề tài nghiên cứu của nhiều tác giả vì tính nghiêm trọng của các bệnh do vi khuẩn
3 này gây ra ở người (Bergamini, 2007) [16]. Việc xác định chính xác loại vi khuẩn thuộc nhóm này là rất cần thiết, do mối nguy hại của vi khuẩn này liên quan đến các nạn dịch tiêu chảy trầm trọng ở người và khả năng truyền lây bệnh của chúng thông qua thức ăn có nguồn gốc động vật. Hiểu biết về các đặc tính của vi khuẩn VTEC ở thịt các loài động vật nuôi (bò, lợn…) làm thực phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp. Nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện và công bố ở hầu khắp các quốc gia trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam vấn đề này vẫn chưa được chú ý. Để có được những hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC trong thực trạng giết mổ và chế biến thực phẩm tại Việt Nam, chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề tài: "Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội ” 2 Mục tiêu củ đề tài - Xác định đặc tính của vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn tại điểm giết mổ. - Xây dựng được quy trình chẩn đoán, xác định vi khuẩn VTEC trong sản phẩm thịt tươi. 3 Ý n hĩ h học và thực tiễn củ đề tài - Đề tài luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về vi khuẩn E. coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội. - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta xác định và hiểu được một số đặc tính cơ bản của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập được từ bò, lợn. - Một số kỹ thuật mới và phương pháp phân tích kết quả có hệ thống của đề tài luận án có thể ứng dụng trong nghiên cứu một số vi khuẩn khác ở mức độ phân tử cũng như tài liệu giảng dạy về vi khuẩn nhóm VTEC. - Hiểu biết về vi khuẩn nhóm VTEC ở các loài động vật nuôi làm thực
4 phẩm cho con người có ý nghĩa quan trọng trong việc đưa ra các hệ thống cảnh báo sớm và tiến hành các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp. 4 hữn đón óp m i củ luận án - Đề tài luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu đặc tính của vi khuẩn nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn tại cơ sở giết mổ và một số sản phẩm thịt bò, lợn bày bán trên một số chợ tại địa bàn Hà Nội. - Thiết lập thành công phương pháp Multiplex PCR để xác định vi khuẩn nhóm VTEC trên thịt trong điều kiện Việt Nam. - Sử dụng phương pháp PCR, PFGE để xác định các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli và xác định sự đa dạng di truyền của các chủng VTEC có nguồn gốc khác nhau.
5 h ơn 1 Ổ QUA L U 1.1 Vi huẩn E. coli Hơn 100 năm trước, năm 1885, bác sỹ nhi khoa người Đức Theodore Escherich đã lần đầu tiên mô tả một loài vi khuẩn phân lập được từ phân của một bệnh nhân nhi. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacterium coli commune, và sau nhiều lần đổi tên, vào năm 1919, vi khuẩn này được gọi với một tên thống nhất là Escherichia coli, viết tắt là E. coli. Từ đó đến nay, E. coli được xác định là loài vi khuẩn thường gặp nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật (Vu Khac Hung, 2004) [91]. E. coli là loài chủ yếu của giống Escherichia, họ Enterobacteriaceae. Chúng là những vi khuẩn bắt màu Gram âm, hình gậy ngắn. Quan sát dưới kính hiển vi thường thấy vi khuẩn đứng riêng hoặc thành đôi. Phản ứng Catalase dương tính, Oxidase âm tính, hiếu khí tùy tiện, có thể di động nhờ lông (flagella) hoặc không di động. Hầu hết các chủng vi khuẩn đều lên men đường Lactose, một số lên men chậm và một số không sinh hơi. Thông thường, E. coli có phản ứng Citrate âm tính, Methyl Red (MR) dương tính, Voges - Proskauer (VP) âm tính và Indol dương tính. E. coli là vi khuẩn thường thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật; từ đó E. coli được thải vào nước, đất và đồng cỏ, không chỉ nhiễm lan trong đàn mà có thể nhiễm vào một số sản phẩm nông nghiệp như rau, củ,... Từ đầu những năm 1940, một số ý kiến cho rằng vi khuẩn E. coli là tác nhân gây một số bệnh ở trẻ em. Doyle và Padhye (trích dẫn từ Bray và Beavan, 1989) [28] gọi vi khuẩn này là Bacillus coli typ neopolitanum, mà sau này được gọi là nhóm O111, và thuộc lớp EPEC. Từ đó, những nhóm E. coli khác được thừa nhận là nguyên nhân gây tiêu chảy. Các vi khuẩn
6 E. coli gây bệnh có độc lực rất khác nhau và có khả năng gây ra một số bệnh nghiêm trọng. Một số chủng sản sinh độc tố gây phá hủy tế bào Vero và Hela, tương tự như độc tố do Shigella dysenteriae typ 1 sản sinh ra. Những độc tố này được gọi với những tên khác nhau như Verotoxin, Verocytotoxin hoặc Shiga-like toxin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tên gọi thống nhất là Verotoxin (VT) và các vi khuẩn có khả năng sản sinh độc tố này được gọi là Verotoxigenic Escherichia coli, viết tắt là VTEC. Trong những năm gần đây, các chủng E. coli gây tiêu chảy được chia thành ít nhất 5 nhóm. Đó là E. coli gây độc ruột (ETEC - Enterotoxigenic E. coli) - sản sinh độc tố ruột nhưng không xâm nhập, E. coli xâm nhập ruột (EIEC - Entero invasive E. coli) có khả năng xâm nhập tế bào biểu mô ruột, E. coli gây bệnh tích ruột (EPEC - Enteropathogenic E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô và gây bệnh tích bám dính và xâm nhập (Attaching and Effacing - A/E), E. coli gây ngưng kết (EaggEC - Enteroaggregative E. coli) có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô nhờ một cơ quan giống lông nhung và khuếch tán vào trong biểu mô ruột. Nhóm cuối cùng là VTEC gây bệnh viêm ruột xuất huyết, huyết niệu và ban xuất huyết giảm tiểu cầu ở người. Trước đây, VTEC là một phân nhóm của EPEC vì chúng cũng có khả năng gây bệnh tích A/E ở biểu mô ruột của động vật cảm thụ. Nhưng khi phát hiện một số chủng của VTEC có khả năng sản sinh độc tố VT để trợ giúp cho yếu tố bám dính này, chúng đã được tách ra thành một nhóm riêng là VTEC. E. coli O157: H7 hiện nay là chủng VTEC được báo cáo nhiều nhất gây ra các vụ dịch lớn ở nhiều nước gồm cả Mỹ (MacDonald và Osterholm, 1993) [55], Canada (Waters và cs. 1994) [96], Anh (Thomas và cs. 1996) [88] và Nhật Bản (Bettelheim, 1997) [17]. Vi khuẩn này được xác định là một trong các tác nhân gây ngộ độc nguy hiểm nhất trong các bệnh phát sinh do ngộ độc thực phẩm gây nên hội chứng huyết niệu (Phạm Thị Tâm và cs. 2009, trích dẫn theo Griffin, 1995) [6].
7 Vụ dịch đầu tiên được báo cáo vào năm 1982, E. coli O157: H7 được xác định là nguyên nhân gây viêm ruột xuất huyết ở Mỹ. Trong một thập kỷ sau đó, vi khuẩn này đã trở thành một vấn đề lớn liên quan đến sức khỏe cộng đồng, được chính phủ nhiều nước quan tâm. Vụ dịch lớn nhất được báo cáo xảy ra ở Nhật Bản trong tháng 7 - 8/1996, với 9.578 ca bệnh được ghi nhận và 11 người chết, 90 bệnh nhân được xác định là bị HUS. Vụ dịch lớn thứ hai xảy ra ở Mỹ, với 732 ca bệnh trong đó 4 người chết, 55 người bị HUS hoặc TTP. Mặc dù, serotyp O157: H7 là typ vi khuẩn nổi bật nhất của nhóm VTEC, một số serotyp khác của nhóm này cũng liên quan tới một số bệnh ở người. Hơn nữa, sự tồn tại của các serotyp này là khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau. Có hơn 100 serotyp VTEC được xác định dựa trên kháng nguyên O có khả năng gây một số bệnh nghiêm trọng ở người như HC, HUS, TTP. Ở nhiều nước, VTEC là một tác nhân gây tiêu chảy thông thường (Wachsmuth, 1994) [95]. VTEC gây nên các triệu chứng khác nhau, từ gần như không có triệu chứng gì, có hoặc không có triệu chứng đau bụng nhẹ, đến những triệu chứng nặng hơn như HC, HUS hoặc TTP. Đối tượng thường bị nhiễm VTEC là trẻ em dưới 5 tuổi hoặc người già. Ở những người trưởng thành và trung niên, các triệu chứng có thể nhẹ như bị tiêu chảy nhưng không xuất huyết. Điều này xảy ra khi bị nhiễm ở liều thấp, dưới 100 vi khuẩn. Ở động vật, VTEC gây viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy ở trâu bò, chúng cũng có thể gây bệnh phù đầu ở lợn (Đỗ Ngọc Thúy, 2004) [8]. Hầu hết các vụ dịch VTEC, thường do serotyp O157: H7, có liên quan tới sử dụng thịt bò chưa chín kỹ, và một số thực phẩm tương tự hoặc sữa tươi. Truyền qua thực phẩm là phương thức lây truyền chủ yếu của VTEC. Vật nuôi, đặc biệt là trâu bò, là nguồn tàng trữ VTEC chính (Beutin và cs. 1993) [18]. Trong quá trình giết mổ, động vật mang trùng có thể truyền vi khuẩn sang thịt qua phân, nhiễm chéo sang thân thịt của các gia