Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus link. hại lạc tại Nghệ An

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:158

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là tuyển chọn được các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus hại cây lạc trồng tại Nghệ An và xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus link. hại lạc tại Nghệ An

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒ THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma PH NG TRỪ BỆNH MỐC VÀNG DO NẤM Aspergillus flavus in HẠI ẠC TẠI NGHỆ AN UẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2017
i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒ THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma PH NG TRỪ BỆNH MỐC VÀNG DO NẤM Aspergillus flavus in HẠI ẠC TẠI NGHỆ AN Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật M số: 6 6 12 UẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn hoa học: GS.TS. Vũ Triệu Mân PGS.TS. Nguyễn Văn Viết Hà Nội, 2017
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực và khách quan. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Hồ Thị Nhung
ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Vũ Triệu Mân, PGS.TS. Nguyễn Văn Viết và PGS.TS. Trần Ngọc Lân đã định hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Quá trình thực hiện đề tài, hoàn thiện bài báo và luận án, tôi đã đƣợc nhận sự giúp đỡ, góp ý quý báu của cô TS. Đặng Vũ Thị Thanh và thầy PGS.TS. Hà Viết Cƣờng. Nhân dịp này, tôi xin đƣợc bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ nhiệt tình mà Thầy Cô đã dành cho. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Đào tạo Sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và đơn vị sinh hoạt chuyên môn Viện Bảo vệ thực vật, đặc biệt là TS. Phạm Bích Hiên và TS. Lê Mai Nhất đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án. Tôi xin cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trƣờng Đại học Vinh, TS. Nguyễn Thị Thanh - chủ nhiệm đề tài KH&CN Độc lập cấp Nhà nƣớc (Mã Số: ĐTĐL.2011G/28/HĐ) các thành viên đề tài đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình công tác và thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và các em sinh viên đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh Hồ Thị Nhung
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục đích và yêu cầu 2 2.1. Mục đích 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 3.1. Ý nghĩa khoa học 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 3 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu 3 4.2. Phạm vi nghiên cứu 3 5. Những đóng góp mới của luận án 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 4 1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 4 1.1.2. Nghiên cứu bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc 5 1.1.3. Tình trạng ô nhiễm aflatoxin do nấm A. flavus tiết ra trên lạc 6 1.1.4. Biện pháp chẩn đoán nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin bằng sử dụng môi trƣờng CAM (Coconut Agar Medium) 8 1.1.5. Nghiên cứu các phƣơng pháp phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin 10 1.1.6. Nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin 12 1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 21 1.2.1. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam và tỉnh Nghệ An 21 1.2.2. Nghiên cứu bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc 23 1.2.3. Tình trạng ô nhiễm aflatoxin do nấm A. flavus tiết ra trên lạc 26 1.2.4. Nghiên cứu các phƣơng pháp phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin 28
iii 1.2.5. Nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin 30 1.2.6. Ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin 35 1.3. Những tồn tại và vấn đề đề tài tập trung nghiên cứu 36 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1. Vật liệu nghiên cứu 37 2.2. Thiết bị và dụng cụ 37 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 2.4. Nội dung nghiên cứu 38 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 38 2.5.1. Nghiên cứu thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc và đất trồng lạc tại Nghệ An 38 2.5.2. Phƣơng pháp thu thập, phân lập, tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An 2.5.3. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc tại Nghệ An 45 2.5.4. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc tại Nghệ An 2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu 55 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 3.1. Thực trạng nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc và đất trồng lạc tại Nghệ An 56 3.1.1. Thành phần nấm hại hạt lạc tại Nghệ An năm 2012 56 3.1.2. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ các chợ Nghệ An năm 2012 56 3.1.3. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ nông hộ Nghệ An năm 2012 57 3.1.4. Thành phần nấm hại trong đất trồng lạc tại Nghệ An năm 2012 58 3.1.5. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên đất trồng lạc của các điểm điều tra tại Nghệ An năm 2012 3.1.6. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập đƣợc trên hạt lạc giống thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành phố Vinh 3.1.7. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A. flavus phân lập đƣợc trên hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An 62
iii 3.1.8. Khả năng sinh độc tố aflatoxin của các mẫu nấm A.flavus phân lập đƣợc từ đất trồng lạc ở Nghệ An 63 3.2. Thu thập, phân lập và tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc A. flavus hại lạc tại Nghệ An 64 3.2.1. Thu thập và phân lập nấm đối kháng Trichoderma trên đất trồng lạc 64 3.2.2. Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma đối kháng cao với nấm mốc A. flavus hại lạc 65 3.2.3. Định danh 15 nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng rất cao với nấm mốc A. flavus hại lạc dựa trên vùng gen ITS-rDNA 3.2.4. Mô tả đặc điểm hình thái của T. asperellum (Tri.020(2).NC) 74 3.3. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sản xuất chế phẩm T. asperellum (Tri.020(2).NC) phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An 77 3.3.1. Ảnh hƣởng của loại môi trƣờng nuôi cấy giống cấp 1 đến sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) 77 3.3.2. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống cấp 2 thích hợp nhất cho nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) 78 3.3.3. Lựa chọn môi trƣờng rắn nuôi nhân sinh khối thích hợp nhất cho nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) 82 3.4. Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật sử dụng chế phẩm T. asperellum phòng trừ A. flavus hại lạc tại Nghệ An 3.4.1. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc trong điều kiện nhà lƣới 3.4.2. Nghiên cứu chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc trong điều kiện đồng ruộng 95 3.4.3. Kết quả xây dựng và đánh giá hiệu quả mô hình sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm A. flavus hại lạc ngoài đồng ruộng trong vụ xuân tại Nghi Lộc 107 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 112 KẾT LUẬN 112 KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 PHỤ LỤC 124
iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Từ viết tắt 1. A. flavus Aspergillus flavus 2. A. nomius Aspergillus nomius 3. A. parasiticus Aspergillus parasiticus 4. bt/g Bào tử/gam 5. bt/ml Bào tử/ml 6. BVTV Bảo vệ thực vật 7. CAM Coconut agar medium 8. CMA Corn Meal Aga 9. CFU Colony forming units 10. CT Công thức 11. CV Coefficient of Variation 12. ICRISAT International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics 13. LSD Least Significant Difference 14. MEA Malt Extract Agar 15. PCR Polymerase Chain Reaction 16. PDA Potato Dextro Agar 17. PIRG Percentage inhibition of radial growth 18. RCB Randommized Complete Block 19. T. atroviride Trichoderma atroviride 20. T. asperellum Trichoderma asperellum 21. T. aureoviride Trichoderma aureoviride 22. T. hamatum Trichoderma hamatum 23. T. harzianum Trichoderma harzianum 24. T. koningii Trichoderma koningii 25. T. pseudokonigii Trichoderma pseudokonigii 26. T. reesci Trichoderma reesci 27. T. virens Trichoderma virens 28. TSM Trichoderma specific medium 29. UV Ultraviolet 30. WA 0,01% Water agar 0,01%
v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc của thế giới (năm 2000 - 2014) 4 1.2. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc của Việt Nam (năm 2004 - 2014) 21 1.3. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc của Nghệ An (năm 2004 - 2014) 22 1.4. Kết quả điều tra tình hình nhiễm aflatoxin trên lạc tại Việt Nam 27 1.5. Mối tƣơng quan tỷ lệ hạt lạc bị nhiễm nấm A. flavus với mức độ nhiễm độc tố aflatoxin 27 3.1. Thành phần nấm hại hạt lạc tại Nghệ An năm 2012 56 3.2. Tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus trên hạt lạc thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành phố Vinh năm 2012 57 3.3. Tỷ lệ nhiễm A. flavus trên hạt lạc thu từ nông hộ ở Nghệ An năm 2012 58 3.4. Thành phần nấm bệnh trong đất trồng lạc tại Nghệ An năm 2012 59 3.5. Tỷ lệ nhiễm nấm A.flavus trên đất trồng lạc của các điểm điều tra tại Nghệ An năm 2012 61 3.6. Số lƣợng các mẫu nấm A. flavus phân lập đƣợc trên hạt lạc giống thu từ các chợ của huyện Nghi Lộc và thành phố Vinh sinh độc tố aflatoxin 62 3.7. Số lƣợng các mẫu nấm A. flavus phân lập đƣợc trên hạt lạc giống thu từ nông hộ Nghệ An sinh độc tố aflatoxin 63 3.8. Số lƣợng các mẫu nấm A. flavus phân lập đƣợc từ đất trồng lạc ở Nghệ An sinh độc tố aflatoxin 64 3.9. Tần suất xuất hiện nấm Trichoderma trên đất trồng lạc tại các điểm thu mẫu từ 2011-2013 64 3.10. Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập đƣợc từ đất trồng lạc Nghệ An đối với nấm A. flavus (Asp1.011NA) sau 7 ngày nuôi cấy 65 3.11. Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập từ đất trồng lạc Thanh Hóa đối với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) sau 7 ngày nuôi cấy 66 3.12. Khả năng đối kháng của các nguồn nấm Trichoderma phân lập đƣợc từ đất trồng lạc Hà Tĩnh đối với nấm mốc A. flavus (Asp1.011NA) sau 7 ngày nuôi cấy 67
v 3.13. Hiệu lực phòng trừ của các nguồn nấm Trichoderma đối với nấm mốc A. flavus bằng chất kháng sinh bay hơi sau 5 ngày nuôi cấy 70 3.14. Kết quả định danh của các nguồn nấm Trichoderma dùng phần mềm TrichOKEY v. 2.0 71 3.15. Đặc điểm hình thái nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) 75 3.16. Ảnh hƣởng của loại môi trƣờng nuôi cấy tới sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) 77 3.17. Khối lƣợng đƣờng glucose thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trong môi trƣờng lỏng sau 72 giờ ở 300C 78 3.18. Khối lƣợng giá đỗ thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trong môi trƣờng lỏng sau 72 giờ ở 300C 79 3.19. Thời gian thu hồi sinh khối nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) thích hợp nhất trên môi trƣờng nhân giống cấp 2 81 3.20. Sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên các loại cơ chất rắn sau 10 ngày nuôi cấy 82 3.21. Sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên các tỷ lệ thóc/lƣợng nƣớc sau 10 ngày nuôi cấy 83 3.22. Sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên các túi môi trƣờng thóc đƣợc bọc kín và đảo trộn khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy 85 3.23. Sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trên các túi môi trƣờng thóc đƣợc để hở và đảo trộn khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy 86 3.24. Sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) với các mức thời gian chiếu sáng khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy 87 3.25. Ảnh hƣởng của chế phẩm T. asperellum đến khối lƣợng của chuột thí nghiệm sau 7 ngày 90 3.26. Khả năng ức chế của nấm T. asperellum với nấm A. flavus ở các mức mật độ khác nhau trong điều kiện nhà lƣới sau 4 tuần gieo hạt 92 3.27. Ảnh hƣởng của thời điểm sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum khác nhau đến số lƣợng mầm bệnh nấm A. flavus trong điều kiện nhà lƣới sau 4 tuần gieo hạt 93
v 3.28. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum đến số lƣợng mầm bệnh nấm A. flavus trong điều kiện nhà lƣới sau 4 tuần gieo hạt 94 3.29. Ảnh hƣởng của liều lƣợng và phƣơng pháp sử dụng của chế phẩm đến khả năng hình thành quần thể của nấm T. asperellum trong đất vùng rễ cây lạc vào giai đoạn thu hoạch tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ xuân 2014 và 2015 96 3.30. Ảnh hƣởng của các mức liều lƣợng và phƣơng pháp sử dụng khác nhau của chế phẩm nấm T. asperellum đến tần suất xuất hiện của nấm T. asperellum tại vùng rễ cây lạc vào giai đoạn thu hoạch tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ xuân 2014 và 2015 98 3.31. Ảnh hƣởng của liều lƣợng và phƣơng pháp sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum đến số lƣợng mầm bệnh nấm A. flavus tại vùng đất rễ cây lạc vào giai đoạn thu hoạch tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ xuân 2014 và 2015 100 3.32. Ảnh hƣởng của liều lƣợng và phƣơng pháp sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum đến năng suất lạc tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ xuân 2014 và 2015 101 3.33. Ảnh hƣởng của các mức liều lƣợng và phƣơng pháp sử dụng khác nhau của chế phẩm nấm T. asperellum đến tỷ lệ nhiễm nấm A. flavus của quả lạc khi thu hoạch tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ xuân 2014 và 2015 102 3.34. Ảnh hƣởng của các mức liều lƣợng và phƣơng pháp sử dụng khác nhau của chế phẩm nấm T. asperellum đến tỷ lệ hạt lạc nhiễm nấm A. flavus giai đoạn thu hoạch tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ xuân 2014 và 2015 104 3.35. Ảnh hƣởng của các mức liều lƣợng và phƣơng pháp sử dụng khác nhau của chế phẩm nấm T. asperellum đến tỷ lệ hạt lạc nhiễm A. flavus sau thời gian bảo quản 12 tháng tại Nghi Lộc, Nghệ An vụ xuân 2014 và 2015 106 3.36. Hiệu quả phòng trừ nấm A. flavus hại lạc của chế phẩm T. asperellum trên ruộng mô hình vụ xuân 2015 tại Nghi Lộc, Nghệ An 108 3.37. Hiệu quả kinh tế của mô hình sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum trên lạc xuân tại Nghi Lộc, Nghệ An năm 2015 (tính cho 1 ha) 110
vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1. Kết hợp các phƣơng pháp để đánh giá nguồn nấm sinh độc tố aflatoxin của các loài Aspergillus spp. 9 2.1. Phƣơng pháp cấy nấm Trichoderma (T) và nấm A. flavus (C) trên đĩa đối chứng và đĩa nuôi kép 42 2.2. Phƣơng pháp cấy nấm Trichoderma và A. flavus trên đĩa petri trong thí nghiệm đánh giá khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma đối với nấm mốc A. flavus bằng chất kháng sinh bay hơi 43 3.1. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm A. flavus (Asp1.011NA) 68 3.2. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của các nguồn nấm Trichoderma 73 3.3. So sánh trình tự gen ITS của nguồn nấm Tri.004(2).NX với loài T. asperellum 74 3.4. Đặc điểm hình thái nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) 76 3.5. Khối lƣợng giá đỗ thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) trong môi trƣờng lỏng 80 3.6. Thời gian thu hồi sinh khối nấm T. asperellum (Tri.020(2).NC) thích hợp nhất trên môi trƣờng nhân giống cấp 2 81 3.7. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm nấm T. asperellum phòng trừ nấm mốc A. flavus hại lạc 88 3.8. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum đến số lƣợng mầm bệnh nấm A. flavus trong điều kiện nhà lƣới sau 4 tuần gieo hạt 95 3.9. Ảnh hƣởng của liều lƣợng và phƣơng pháp sử dụng chế phẩm nấm T. asperellum đến tần suất xuất hiện của nấm T. asperellum trên bộ rễ cây lạc vào giai đoạn thu hoạch 99
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao đƣợc dùng làm thực phẩm và xuất khẩu. Ở nƣớc ta vùng Bắc Trung Bộ có diện tích trồng lạc lớn nhất so với 24 tỉnh thành trồng lạc trong cả nƣớc, chiếm 22,5% tổng diện tích trồng và 21,6% tổng sản lƣợng lạc trên cả nƣớc. Diện tích trồng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa tƣơng ứng là 16200 ha chiếm 8,1%; 16000 ha chiếm 8,0%; 12800 ha chiếm 6,4% tƣơng ứng so với cả nƣớc. Sản lƣợng lạc ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Thanh Hóa là 37300 tấn chiếm 8,3%; 36900 tấn chiếm 8,2%; 23600 tấn tƣơng ứng, chiếm 5,2% cả nƣớc (Tổng cục thống kê, 2015). Bệnh mốc vàng hại lạc do nấm Aspergillus flavus Link. gây ra là đối tƣợng hại có ý nghĩa kinh tế quan trọng với cây lạc. Nấm A. flavus có khả năng sinh độc tố aflatoxin, có thể gây ung thƣ và một số bệnh nguy hiểm trên ngƣời và động vật. Các nghiên cứu về nấm A.flavus và sự hình thành aflatoxin trên lạc và các sản phẩm từ lạc trên thế giới đƣợc tiến hành toàn diện và hệ thống, với gần 2000 công trình đƣợc xuất bản (Mehan et al. 1991). Lê Văn Giang cs. (2011), khảo sát trên 60 mẫu lạc ở Nghệ An, có 59 mẫu (98,30%) bị nhiễm nấm A. flavus, trong đó 30 mẫu (50,0%) sinh độc tố aflatoxin từ 2 – 100 ppb và 10 mẫu (16,67%) vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế. Đây chính là mối nguy hại cho sức khỏe đối với ngƣời sử dụng những sản phẩm lạc này. Nghiên cứu của Torres et al. (2014) đã tóm tắt những tiến bộ gần đây ở các quốc gia trồng lạc trên thế giới về các phƣơng pháp ngăn ngừa ô nhiễm aflatoxin trên lạc. Trong đó, tập trung chủ yếu vào các chiến lƣợc trƣớc thu hoạch, nhấn mạnh đến các hƣớng nghiên cứu cần tập trung trong tƣơng lai bao gồm: chọn tạo giống lạc kháng nấm, kiểm soát sinh học và sử dụng ozon để giảm ô nhiễm aflatoxin trên lạc. Tại Việt Nam nghiên cứu phòng trừ nấm mốc A. flavus đã có một số thành công. Bên cạnh các biện pháp canh tác và bảo quản đƣợc áp dụng để phòng chống bệnh, các tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu năm 2010-2011 đã phân lập, tuyển chọn đƣợc các dòng nấm A. flavus TH97, DA2 không sinh độc tố dùng trong phòng trừ các dòng nấm A. flavus sinh
2 độc tố aflatoxin. Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ đã tuyển chọn thành công giống lạc L17 có khả năng kháng nấm A.flavus (Nguyễn Văn Thắng, 2010). Chúng ta đã nghiên cứu và ứng dụng thành công các chế phẩm sản xuất từ nấm Trichoderma chống các bệnh thối rễ, chết ẻo… do các nấm Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii gây ra. Mặc dù vậy, hƣớng nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nấm mốc A. flavus nhằm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng nhƣ các cây trồng khác chƣa đƣợc quan tâm. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: ―Nghiên cứu nấm đối háng Trichoderma phòng trừ bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus in hại lạc tại Nghệ An” đã đƣợc tiến hành nhằm tuyển chọn và ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma trong phòng trừ bệnh mốc vàng hại lạc. 2. Mục đích và yêu cầu 2.1. Mục đích Tuyển chọn đƣợc các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm mốc Aspergillus flavus hại cây lạc trồng tại Nghệ An và xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng. Yêu cầu Tuyển chọn đƣợc các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc tại Nghệ An. Xây dựng đƣợc quy trình kỹ thuật sản xuất và biện pháp sử dụng chế phẩm Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus hiệu quả trên đồng ruộng. 3 Ý nghĩa hoa học và thực tiễn của đề tài 3 Ý nghĩa hoa học Luận án bổ sung những thông tin mới về tuyển chọn sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum đƣợc phân lập từ vùng đất trồng lạc để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An. Kết quả luận án là tài liệu phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và phục vụ sản xuất. 3 Ý nghĩa thực tiễn Sử dụng chế phẩm Trichoderma asperellum để phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An, không những làm giảm sự nhiễm nấm mốc A. flavus gây
3 bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và trong quá trình bảo quản, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc mà còn góp phần bảo vệ môi trƣờng và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu Các loài nấm Trichoderma đƣợc phân lập từ các mẫu đất trồng lạc, sử dụng trong phòng trừ nấm A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc tại Nghệ An. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tuyển chọn các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao và sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma có khả năng phòng trừ hiệu quả nấm mốc Aspergillus flavus trên cây lạc và ứng dụng rộng rãi cho vùng chuyên canh lạc tỉnh Nghệ An. 5. Những đóng góp mới của luận án - Là công trình nghiên cứu có hệ thống về sử dụng nấm đối kháng T. asperellum đƣợc phân lập từ vùng đất trồng lạc để chuyên phòng trừ nấm A. flavus hại trên lạc tại Nghệ An. - Ứng dụng thành công các kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào trình tự vùng gen ITS để định danh các nguồn nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm mốc hại lạc A. flavus. - Đề xuất đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm nấm T. asperellum đạt 5,3 × 9 10 bào tử/gam. Chế phẩm T. asperellum có tác dụng giảm sự nhiễm nấm mốc A. flavus gây bệnh mốc vàng hại lạc giai đoạn trên đồng ruộng và giảm độc tố aflatoxin trong quá trình bảo quản đạt 92,08%, tăng hiệu quả kinh tế trong trồng lạc.
4 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tƣơng trong số các cây trồng ngắn ngày lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lƣợng) và đƣợc trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia trên thế giới (bảng 1.1). Bảng 1 Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của thế giới (năm - 2014) Năm Diện tích Năng suất Sản lượng (1.000 ha) (tấn/ha) (1.000 tấn) 2000 23,260 1,49 34,720 2001 23,080 1,56 35,880 2002 22,970 1,44 33,130 2003 23,100 1,56 36,080 2004 23,950 1,52 36,460 2005 23,960 1,57 37,650 2006 22,470 1,65 36,980 2007 21,620 1,54 33,190 2008 24,050 1,60 38,440 2009 23,740 1,54 36,440 2010 21,440 1,67 35,880 2011 25,106 1,79 40,860 2012 25,194 1,81 41,311 2013 26,881 1,88 45,836 2014 26,542 1,82 43,915 Nguồn: FAO (2016). Theo thống kê của FAO, từ năm 2000 đến năm 2014 diện tích lạc trên thế giới có xu hƣớng tăng lên, năm 2000, diện tích trồng lạc là 23,260 nghìn ha, đến năm 2014 diện tích trồng lạc đạt 26,542 nghìn ha. Năng suất lạc ngày càng tăng nhờ đƣợc áp dụng những tiến bộ kỹ thuật mới vào sản xuất. Năm 2000 năng suất lạc đạt 1,49 tấn/ha, tăng 35,5% so với năng suất năm 1980 (1,10 tấn/ha) và tăng 29,6% so với năng suất năm 1990 (1,15 tấn/ha). Đến năm 2014, năng suất lạc đạt 1,82 tấn/ha. Cùng với sự gia tăng về năng suất, sản lƣợng lạc của thế giới cũng tăng lên, từ 34,720 nghìn tấn trong năm 2000 tăng lên 43,915 nghìn tấn vào năm 2014.
5 1.1.2. Nghiên cứu bệnh mốc vàng do nấm Aspergillus flavus Link. hại lạc 1.1.2.1. Đặc điểm của nấm A. flavus Nấm A. flavus thuộc chi Aspergillus, chi Aspergillus đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi Florentine et al. vào năm 1729 và tên của nấm đƣợc đặt dựa vào cấu trúc của cuống sinh bào tử. Aspergillus là chi phổ biến hiện tại đã phát hiện đƣợc trên 200 loài (Samson et al., 1992). Loài A. flavus đƣợc mô tả bởi Link vào năm 1890 và đƣợc biết đến nhƣ một loài sinh sản vô tính. Gần đây, giai đoạn sinh sản hữu tính của A. flavus đã đƣợc công bố là nấm Petromyces flavus. Nấm A. flavus phân bố ở nhiều dạng địa hình khác nhau nhƣng xuất hiện phổ biến hơn từ vĩ độ 160 đến 350 có khí hậu ấm, không phổ biến ở những vùng có vĩ độ trên 450 (Klich, 2007). Nấm A. flavus có màu vàng xanh lá cây trên môi trƣờng Czapeck hay Sabouraud sau 24h tản nấm có màu vàng nhạt ở trung tâm, rìa mép bờ có màu trắng mịn, sau 48h từ trung tẩm tản nấm, xuất hiện các khối bào tử chín màu vàng nhạt hay vàng. Đƣờng kính tản nấm đạt 4-5 cm sau 6-7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, các bào tử hình thành vòng tròn đồng tâm đều đặn, thƣờng có 5- 6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc (Rapper, 1965). 1.1.2.2. Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh mốc vàng hại lạc do nấm A. flavus Nấm A. flavus là một trong những loài nấm gây bệnh tồn tại phổ biến trong đất trồng lạc có khả năng sinh trƣởng cộng sinh trong quá trình phát triển của cây lạc và từ đó có thể xâm nhập vào các hạt lạc. Trên cây lạc đang phát triển có nhiều con đƣờng nhiễm nấm A. flavus khác nhau: nhƣ qua rễ, hoa, hoặc qua lá bị côn trùng ăn hoặc từ bụi và không khí, nhƣng con đƣờng lây nhiễm chính diễn ra trực tiếp từ sự tiếp xúc của mầm bệnh A. flavus từ đất xung quanh vỏ của quả lạc (Pitt et al., 2013). Sự xâm nhiễm của nấm A. flavus và hình thành aflatoxin trên lạc khác nhau tùy vào giai đoạn trƣớc thu hoạch, sau thu hoạch và thời gian bảo quản. Giai đoạn trƣớc thu hoạch: Các nhân tố có ảnh hƣởng bất lợi đến cây và quả trong quá trình chín nhƣ thu hoạch muộn, khô hạn, vết thƣơng cơ giới, sự gây hại của côn trùng, nhện và tuyến trùng , đều làm gia tăng mức độ nhiễm A.flavus và aflatoxin trên lạc. Sự xâm nhiễm của các nấm đất nhƣ Fusarium ssp., Rhizocctonia solani, Pythium myriotylum có thể không gây hại nghiêm trọng nhƣng là nhân tố làm tăng tỷ lệ nhiễm A.flavus và aflatoxin. Các bệnh hại quả và
6 hạt khác có ảnh hƣởng đáng kể đến mức độ nhiễm nấm A. flavus của hạt lạc trên đồng ruộng (Mehan et al., 1986). Giai đoạn sau thu hoạch: Độ ẩm quả lạc từ 8 - 40% thuận lợi cho sự xâm nhiễm của A.flavus. Thời gian làm khô quả dài hay ngắn ảnh hƣởng lớn đến sự xâm nhiễm nấm và sản sinh aflatoxin. Các hình thức làm khô nhƣ phơi, sấy, phƣơng pháp đảo lạc, vật liệu phơi lạc cũng có ảnh hƣởng khác nhau đến quá trình nhiễm aflatoxin (McDonal et al., 1963). Giai đoạn bảo quản: Độ ẩm cao là yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhiễm vào hạt của A.flavus cũng nhƣ các nấm khác. Độ ẩm hạt từ 10,5 -11% sẽ làm hạn chế sự nhiễm nấm (Mehan, 1998). Nguồn bệnh A. flavus trong đất tiếp xúc với vỏ lạc là sự tiếp xúc đầu tiên của cây lạc với mầm bệnh A. flavus. Chu kỳ bệnh và dịch tễ học của nấm A. flavus đã đƣợc Amaike et al. (2011) nghiên cứu. Nấm A. flavus tồn tại trong đất dƣới dạng bào tử hoặc hạch nấm hoặc dạng sợi nấm trên tàn dƣ cây trồng. Hạch nấm A. flavus có thể tồn tại trong đất ở điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt, sau 3 năm vẫn giữ đƣợc sức nảy mầm. Gặp điều kiện thời tiết nóng và hạn hán, hạch nấm nảy mầm sản sinh ra bào tử, dẫn đến sự gia tăng quần thể nấm bệnh trong điều kiện này. Hạch nấm nảy mầm thành sợi nấm, sau đó hình hành cuống sinh bào tử (conidiophores). Sự phân tán trong không khí của bào tử có liên quan đến sự nhiễm bệnh trên cây. Quá trình lƣu chuyển của đất trồng hay dòng nƣớc mƣa đóng vai trò quan trọng trong sự nhiễm bệnh trên hạt lạc (Horn et al. 1997). Điều kiện thời tiết hạn hán, nắng nóng là yếu tố lớn ảnh hƣởng đến năng suất và phẩm chất lạc do sự ô nhiễm aflatoxin. Trong điều kiện có mƣa hoặc tƣới tiêu thích hợp, lạc thƣờng không bị nhiễm độc aflatoxin (Pitt et al., 2013). 1.1.3. Tình trạng ô nhiễm aflatoxin do nấm A. flavus tiết ra trên lạc Aflatoxin là độc tố chính đƣợc tiết ra chủ yếu bởi một số loài nấm Aspergillus spp. Các aflatoxin đƣợc cấu tạo gồm bốn hợp chất của nhóm bis- furanocouramin, là sản phẩm trao đổi chất của nấm A. flavus và A. parasiticus. Hiện có khoảng 18 loại độc tố aflatoxin đã đƣợc tìm thấy, có kí hiệu B1, B2, G1, G2, M1, M2, P1, Q1,... đƣợc phân biệt trên đặc tính lý hóa và độc tính của chúng (Reddy et al., 2000).
7 Theo Yu (2012) hầu hết A. flavus sản sinh aflatoxin B1 và B2 trong khi Aspergillus parasiticus , tạo ra aflatoxins B1 , B2 , G1 , và G2 . Bốn aflatoxin chủ yếu này đƣợc đặt tên dựa trên ánh sáng huỳnh quang màu xanh nƣớc biển (Blue) hoặc xanh lá cây (Green) dƣới ánh sáng cực tím và tính di động tƣơng đối của chúng bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng trên silicagel. Aflatoxin M1 là một dẫn chất hydroxyl hóa chuyển hóa từ aflatoxin B 1 bởi bò và tiết ra trong sữa. Martinez et al. (1994) đã chỉ ra rằng các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy trong điều kiện làm nóng khi thanh trùng, khi đun nấu ở nhiệt độ thông thƣờng. Độc tố này rất bền với các men tiêu hóa nhƣng dễ bị phá hủy bằng amoniac hay hypochlorit. Các aflatoxin có thể tồn tại trong thực phẩm mà không cần sự có mặt của nấm mốc tƣơng ứng. Độc tố aflatoxin đƣợc tạo ra từ một số chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus nhƣ: A. flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. pseudotamarii, A. bombycis… trong đó loài A. flavus có khả năng sinh aflatoxin mạnh nhất và phổ biến trong môi trƣờng tự nhiên và nhân tạo. Độc tố aflatoxin gây ung thƣ, gây đột biến, gây quái thai và các tác dụng phụ ức chế miễn dịch (Bhatnagar-Mathur et al., 2015). Tại Thái Lan, kết quả điều tra trên hơn 100 địa điểm cho thấy 49% các mẫu lạc nhiễm aflatoxin, trung bình là 1530g/kg, cao nhất là 12.300g/kg (Mehan et al., 1991). Tại châu Phi, một số nƣớc có diện tích trồng lạc lớn cũng bị nhiễm aflatoxin cao. Mehan et al. (1991) đã ghi nhận, 44% mẫu lạc nhiễm aflatoxin tại Ai Cập và 94/98 mẫu nhiễm aflatoxin tại Nigeria, trong đó 54% mẫu có hàm lƣợng aflatoxin cao hơn 30g/kg. Kết quả nghiên cứu của Mutegi et al. (2012), sự xuất hiện của nấm A. flavus và hàm lƣợng aflatoxin tổng số đã đƣợc xác định trên 436 mẫu lạc từ các quận Busia và Homa Bay của Kenya. Tổng cộng có 1458 chủng Aspergillus flavus đƣợc phân lập. Mẫu lạc có hàm lƣợng aflatoxin tổng số ≥10 μg kg -1 đƣợc sinh ra bởi các loài A. flavus (tỷ lệ 78%). Mức aflatoxin trong các loại sản phẩm từ lạc ở Đài Loan đƣợc khảo sát trên 1827 mẫu đƣợc thu thập từ các vùng khác nhau của Đài Loan từ năm 1997 đến năm 2011. Bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với huỳnh quang
8 đã phát hiện có 32,7% mẫu với các mức nhiễm từ 0,2 μg/kg đến 513,4 μg/kg. Bơ làm từ lạc bị nhiễm hàm lƣợng aflatoxin cao nhất, tiếp theo là bột lạc, kẹo lạc và hạt lạc. Trong số các mẫu dƣơng tính aflatoxin, aflatoxin B1 có hàm lƣợng phát hiện cao nhất, tiếp theo là aflatoxin B2 , aflatoxin G2 và aflatoxin G1 (Chen et al., 2013). Theo Kana et al. (2013) khi phân tích hàm lƣợng aflatoxin trên tổng số 201 mẫu ngô, bột lạc và thức ăn gia súc hỗn hợp đƣợc thu thập tại các trang trại gia cầm của Cameroon và phân tích hàm lƣợng độ ẩm và aflatoxin. Kết quả cho thấy khoảng 9% mẫu ngô dƣơng tính với aflatoxin, với nồng độ từ ≤ 2 - 42 μg/kg. Hầu hết các mẫu bột lạc (100%) và thức ăn gia súc hỗn hợp (83,0%) đều có kết quả dƣơng tính với nồng độ các mẫu dƣơng tính từ 39-950 μg/kg đối với bột lạc và 2-23 μg/kg đối với thức ăn hỗn hợp. Những kết quả này cho thấy bột lạc là loại thức ăn gia súc có nguy cơ cao về ô nhiễm aflatoxin. Kết quả khảo sát của Filbert et al. (2012) thấy rằng tất cả các mẫu bơ từ lạc thu đƣợc từ cửa hàng tạp hoá Haiti và Kenya trong năm 2009 và 2010 đều bị ô nhiễm aflatoxin. Mức aflatoxin dao động từ 7,9 đến 799,8 ppb. 1.1.4. Biện pháp chẩn đoán nấm A. flavus sinh độc tố aflatoxin bằng sử dụng môi trƣờng CAM (Coconut Agar Medium) Các phƣơng pháp phân tích để xác định các độc tố nấm mốc đã đƣợc phát triển và hoàn thiện từ những năm 1960. Độc tố nấm mốc là những hợp chất có cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa khác nhau nên cần những phƣơng pháp kiểm tra đặc trƣng riêng. Chính vì vậy đã xuất hiện nhiều phƣơng pháp xác định nhƣ: Phƣơng pháp truyền thống, phƣơng pháp vật lý hóa học, phƣơng pháp hóa sinh học, các phƣơng pháp dựa trên cơ sở sắc ký lỏng (LC) hoặc sắc ký khí (GS) với dectector thích hợp nhƣ dectector huỳnh quang (FLD), dectector bắt điện tử UV , dectector ion (FID), dectector bắt điện tử (ECD).