Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sử dụng hợp lý đất phèn đồng bằng sông Cửu Long thích ứng với biến đổi khí hậu

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:120

Thêm vào BST

Báo xấu

68
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm phân lập các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân hiện diện trong đất và nội sinh trong cây lúa, khoai lang trên đất phèn. Xác định và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân có ảnh hưởng đến sinh trưởng, năng suất của lúa và khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sử dụng hợp lý đất phèn đồng bằng sông Cửu Long thích ứng với biến đổi khí hậu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP LÝ NGỌC THANH XUÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN LIÊN KẾT VỚI THỰC VẬT (PLANT ASSOCIATED BACTERIA) Ở LÚA, KHOAI TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÈN VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT Mã số: 9620103 2019
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP LÝ NGỌC THANH XUÂN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN LIÊN KẾT VỚI THỰC VẬT (PLANT ASSOCIATED BACTERIA) Ở LÚA, KHOAI TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÈN VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT Mã số: 9620103 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. TRẦN VĂN DŨNG GS.TS. NGÔ NGỌC HƯNG 2019
LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn đến Em Lâm Tiên Nga, em Nguyễn Như Thanh, em Trần Lê Kim Trí, em Lê Thị Thúy Loan, em Nguyễn Thị Xuân Mỵ và anh Trần Văn Bé Năm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Quí Thầy, Cô và các Anh, Chị, Em trong Bộ môn Khoa học đất - Khoa Nông nghiệp đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm thực tiễn hết sức quý báu và luôn quan tâm, hỗ trợ tôi trong việc hoàn thành luận án. Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Khoa Sau Đại học và các Phòng ban của Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường. Ban Giám hiệu Trường Đại học An Giang, Lãnh đạo Phòng Quản Trị - Thiết bị, các bạn đồng nghiệp thuộc Khu Thí nghiệm - Thực hành đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứ sinh. Đặc biệt xin gởi lời chân thành cảm ơn sâu sắc đến GS. TS Ngô Ngọc Hưng, PGS.TS. Trần Văn Dũng, GS. TS Cao Ngọc Điệp và PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, cung cấp nhiều kiến thức quý báu trong suốt quá trình tôi học tập. Từ đó, giúp tôi lĩnh hội thêm nhiều kiến thức mới trong lĩnh vực nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận án tốt nghiệp. Em Nguyễn Quốc Khương, em Lương Thị Hoàng Dung, em Lê Văn Dang, em Lê Phước Toàn, em Trần Ngọc Hữu và em Nguyễn Thị Xuân Đào đã tận tình giúp đỡ, chia sẽ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Cha mẹ hai bên và gia đình nhỏ của tôi luôn là nguồn động viên, là chỗ dựa tinh thần, niềm an ủi, ủng hộ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi bày tỏ sự biết ơn sâu sắc với tấm lòng tôn trọng và mãi luôn khắc ghi những công ơn quý báo này. Xin chân thành cảm ơn! Lý Ngọc Thanh Xuân i
TÓM TẮT Đất phèn có pH thấp, đã dẫn đến hàm lượng dưỡng chất thấp. Đề tài “Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (plant associated bacteria) ở lúa, khoai trồng trên đất phèn vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện nhằm mục tiêu (i) Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân hiện diện trong đất và nội sinh trong cây lúa, khoai lang trên đất phèn (ii) Xác định ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân đến sinh trưởng và năng suất lúa và khoai lang. Mẫu đất phèn, khoai lang và lúa được thu thập tại bốn vùng đất phèn Tứ giác Long Xuyên (TGLX), Đồng Tháp Mười (ĐTM), Trũng sông Hậu (TSH) và Bán đảo cà Mau (BĐCM). Bốn trăm ba mươi mốt chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa, trong đó có 272 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 159 chủng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong, vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, hầu hết các chủng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Bốn trăm hai mươi bốn chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai lang, trong đó có 271 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 153 chủng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, một số lượng nhỏ các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình cầu. Các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và có khả năng hòa tan lân khó tan. Hai mươi chín chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA. Các chủng vi khuẩn này đa dạng về loài thuộc 3 nhóm vi khuẩn: Bacilli, Gammaproteobacteria và Betaproteobacteria. Mười hai chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai lang mà có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA. Các dòng vi khuẩn này đa dạng về loài chỉ thuộc 2 nhóm vi khuẩn: Bacilli và Gammaproteobacteria. Kết quả thí nghiệm đồng ruộng cho thấy nghiệm thức không bón đạm đã làm giảm năng suất lúa trên đất phèn, Long Mỹ - Hậu Giang, Hòn Đất - Kiên Giang và Hồng Dân, Bạc Liêu, nhưng nghiệm thức bón 60 kg N ha-1 kết hợp với vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis X1 đã đạt năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O5- 30K2O trên đất phèn Hòn Đất - Kiên Giang. Tương tự, nghiệm thức bổ sung vi khuẩn B. vietnamiensis X3 đã làm tăng năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Long Mỹ - Hậu Giang và Hồng Dân - Bạc Liêu. Tuy nhiên, nghiệm thức không bón lân chưa thể hiện sự thiếu lân trên ba vùng phèn trên nên chưa đưa đến sự khác biệt về năng suất của sử dụng vi ii
khuẩn B. vietnamiensis X1 và B. vietnamiensis X3. Hoạt tính cố định đạm của vi khuẩn B. acidipaludis X5 mạnh nhất so với 2 vi khuẩn còn lại thông qua việc gia tăng số củ và năng suất củ khoai lang. Bón 60 kg N ha-1 kết hợp với chủng vi khuẩn B. acidipaludis X5 cho số củ, chiều dài củ, đường kính củ và năng suất củ khoai lang tương đương với bón 90 kg N ha-1. Sử dụng chủng vi khuẩn B. acidipaludis X5 đã tiết kiệm được khoảng 30% lượng phân đạm bón cho khoai lang. Cần áp dụng các dòng này trong cánh tác lúa và khoai lang ở ĐBSCL. Từ khóa: cố định đạm, đất phèn, hòa tan lân, vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn nội sinh. iii
ABSTRACT Acid sulfate soils possess low pH resulting low nuutrients for plants. The study titled “Isolation, selection, characterization and identification of endophytic and rhizospheric bacteria associated with rice and sweet potato from acid sulfate soil in the Mekong delta, Vietnam” was conducted for the following objectives (i) isolation of endophytic and rhizospheric bacterial strains associated with sweet potato and rice for abilities of nitrogen fixing, phosphate-solubilizing; (ii) selection of promising nitrogen fixing, phosphate- solubilizing bacterial strains for improvement of sweet potato and rice growth and yield. The sweet potato and rice plant, and soil samples were collected from four acid sulfate soil areas including Ca Mau Peninsula, Long Xuyen Quadrangle, Depressed area of Hau River and Plain of Reed in the Mekong Delta, Vietnam. A total of 431 rice endophytic bacterial strains including 272 strains isolated from rhizobacterial strains and 159 endophytic bacterial strains were obtained. Morphological properties of colonies had colorless, opaque, yellow and very yellow. Besides, colony morphology was mainly circular shapes and entire margin, rod shape and Gram-negative. A total of 424 rice endophytic bacterial strains consisting of 271 strains isolated from rhizobacterial strains and 153 endophytic bacterial strains were obtained. Morphological characteristics of colonies also were transparency, milk-color, yellow and very yellow. Moreover, colony morphology was mostly circular shapes and entire margin, rod shape and Gram-positive, but several strains had sphere shape. The 25 selected rice endophytic bacterial strains had promised high abilities for nitrogen fixing, phosphate-solubilizing that were identified by 16S rDNA sequence analysis. The phylogenetic analysis is belonged to Bacilli, Gammaproteobacteria and Betaproteobacteria groups. Similarly, The 2 selected sweet potato, yam, and cassava endophytic bacterial strains had high promised capacities for nitrogen fixing, phosphate-solubilizing, which were identified by 16S rDNA sequence analysis. The phylogenetic analysis is closely classified to Bacilli and Gammaproteobacteria groups. The without nitrogen fertilizer application decreased rice yield on acid sulfate soil in Long My - Hau Giang, Hon Dat - Kien Giang and Hong Dan - Bac Lieu, but the application of both 60 kg N ha-1 and Burkholderia vietnamiensis X1 resulted in higher rice yield compared to control treatment (90N-60P2O5-30K2O) on acid sulfate soil in Hon Dat - Kien Giang. Similarly, the applied B. vietnamiensis X3 increased productivity in Long My - Hau Giang, and Hong Dan - Bac Lieu. However, without phosphorus fertilizer application have not been improved yield by application of B. vietnamiensis X1 và B. vietnamiensis iv
X3 because there were not significant differences between phosphorus and without phosphorus fertilization. The bacteria Burkholderia acidipaludis X5 have high nitrogen fixation capability compared to those in the 2 other bacteria through increased number of tubers and yield of sweet potato. Applying kg N ha-1 in combination with incubation of bacteria Burkholderia acidipaludis X5 showed that the tuber number, tuber length, tuber diameter and sweet potato yield were equivalent with applying kg N ha-1. Incubation with bacteria Burkholderia acidipaludis X5 could save 30% of nitrogen fertilizers for sweet potato. The potential bacterial strains should be used in cultivating rice and sweet potato in the Mekong delta. Key words: acid sulfate soil, endophytic bacteria, nitrogen fixing, phosphate- solubilizing, rhizobacterial. v
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Số liệu trong đề tài nghiên cứu sinh này thuộc đề tài “Nghiên cứu sử dụng hợp lý đất phèn đồng bằng sông Cửu Long thích ứng với biến đổi khí hậu”, với mã số BĐKH57. Cần Thơ, ngày 04 tháng 3 năm 2019 Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh Lý Ngọc Thanh Xuân vi
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i TÓM TẮT .......................................................................................................... ii ABSTRACT...................................................................................................... iv LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. vi MỤC LỤC ....................................................................................................... vii DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................ x DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................... xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... xiv CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu ....................................................................................................... 3 1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 3 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 4 1.5 Những đóng góp mới của luận án ................................................................ 4 1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án ..................................... 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 6 2.1 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết với thực vật trong nông nghiệp ......................................................................................................... 6 2.1.1 Khái niệm .................................................................................................. 6 2.1.2 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết thực vật ............................ 6 2.1.3 Những tiến bộ trong nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật liên kết với thực vật ............................................................................................................. 12 2.2 Đặc điểm thổ nhưỡng các vùng sinh thái đất............................................. 16 2.2.1 Phân loại đất phèn ................................................................................... 16 2.2.2 Đặc điểm thổ nhưỡng và các trở ngại trên đất phèn ĐBSCL ................. 20 2.2.3 Đặc tính hóa học của đất phèn ĐBSCL .................................................. 27 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................. 36 3.1 Vật liệu ....................................................................................................... 36 3.1.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................. 36 3.1.2 Vật liệu .................................................................................................... 36 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu .................................................................. 37 vii
3.1.4 Môi trường sử dụng ................................................................................ 37 3.1.5 Đặc tính đất thí nghiệm........................................................................... 38 3.2 Phương pháp .............................................................................................. 38 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát và thu thập mẫu đất, thực vật trên đất phèn ở các vùng sinh thái tại đồng bằng sông Cửu Long ........................................... 40 3.2.2 Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn liên kết với thực vật có khả năng cố định đạm, hòa tan lân .................................................................. 41 3.2.3 Nội dung 3: Tuyển chọn vi khuẩn trước khi tiến hành nhận diện .......... 46 3.2.4 Nội dung 4: Nhận diện, định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn ....... 47 3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên cây lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. 49 3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. ......................................................................................................... 54 3.3 Xử lý số liệu ............................................................................................... 58 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 59 4.1 Phân lập vi khuẩn trên lúa và khoai lang ................................................... 59 4.1.1 Phân lập vi khuẩn vùng rễ cây lúa và nội sinh cây lúa ........................... 59 4.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây lúa ................ 59 4.1.3 Phân lập vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang ........................... 60 4.1.4 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang .... 60 4.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn tiềm năng có khả năng cố định đạm và hòa tan lân ....................................................................................................... 61 + 4.2.1 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4 và hòa tan lân của chủng vi khuẩn đã phân lập trên vùng rễ lúa và nội sinh trong cây lúa.................................. 61 4.2.2 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ và hòa tan lân của chủng vi khuẩn đã phân lập trên vùng rễ lúa và nội sinh trong khoai lang ............................ 67 4.3 Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của một số chủng vi khuẩn trên lúa, khoai lang có khả năng tổng hợp NH4+, hòa tan lân cao 71 4.3.1 Đối với vi khuẩn đất vùng rễ lúa ............................................................ 71 4.3.2 Đối với vi khuẩn nội sinh cây lúa........................................................... 74 4.3.3 Đối với vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang ............................ 76 4.3.4 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn cho áp dụng trong điều kiện đồng ruộng .................................................................................................................. 80 viii
4.4 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng B. vietnamiensis X1, X2, X3 cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến sinh trưởng và năng suất lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới ..................................................... 85 4.4.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn kết hợp với mức bón đạm lên thành phần năng suất và năng suất lúa ....................................... 85 4.4.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn kết hợp với mức bón lân lên thành phần năng suất và năng suất lúa ......................................... 87 4.5 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng E. cloacae X4, B. acidipaludis X5, Bacillus sp. X6 cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến sinh trưởng và năng suất khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới ..................................................................................................... 89 4.6 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng B. vietnamiensis X1, X2, X3 cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến sinh trưởng và năng suất lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện ngoài đồng ................................................. 91 4.6.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X2, X3 kết hợp các mức đạm lên năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long vụ hè thu 2015 ................................................................................. 91 4.6.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X2, X3 kết hợp các mức lân lên năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long vụ hè thu 2015 ................................................................................. 93 4.6.3 Đánh giá hiệu quả của chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X3 lên năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long vụ thu đông 2015 .......................................................................................................... 95 4.7 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng E. cloacae X4, B. acidipaludis X5, Bacillus sp. X6 cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến sinh trưởng và năng suất khoai trồng trên đất phèn ở điều kiện ngoài đồng .................................................................................................................. 97 4.7.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn E. cloacae X4, B. acidipaludis X5, Bacillus sp. X6 kết hợp với các liều lượng đạm đến năng suất khoai lang tím nhật vào vụ xuân hè 2016 trên đất phèn ở ĐBSCL ........................... 97 4.7.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn E. cloacae X4, B. acidipaludis X5, Bacillus sp. X6 kết hợp với các liều lượng lân đến năng suất khoai lang tím nhật vào vụ hè thu 2016 trên đất phèn ở ĐBSCL .............................. 99 4.7.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn triển vọng đến năng suất khoai lang tím nhật vụ hè thu 2016 ............................................................................................. 101 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................ 103 5.1 Kết luận .................................................................................................... 103 5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 104 ix
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Phân loại đất phèn theo hệ thống phân loại (USDA/Soil Taxonomy). .................................................................................................................. 17 Bảng 2.2: Thống kê tính chất hóa học tầng A của đất phèn ở 04 vùng sinh thái ĐBSCL (Ngô Ngọc Hưng, 2009) ............................................................. 27 Đặc tính hóa – lý đất thí nghiệm trồng lúa được trình bày ở Bảng 3.1 ........... 38 Bảng 3.1: Tính chất ban đầu của đất thí nghiệm trồng lúa .............................. 38 Đặc tính hóa – lý đất thí nghiệm trồng khoai lang được trình bày ở Bảng 3.2 38 Bảng 3.2: Tính chất ban đầu của đất thí nghiệm trồng khoai lang .................. 38 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất lúa thí nghiệm nhà lưới ..................................................................... 50 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng lân lên năng suất lúa thí nghiệm nhà lưới............................................................................. 50 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất lúa. ..................................................................................................... 52 Bảng 3.6: Đánh giá sự phối hợp vi khuẩn triển vọng với 3 lượng N lên năng suất lúa ...................................................................................................... 52 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng lân lên năng suất lúa. ............................................................................................................ 53 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất khoai lang thí nghiệm nhà lưới ......................................................... 54 Bảng 3.9: Thời kỳ và lượng phân (%) bón cho thí nghiệm ............................. 55 Bảng 3.10: Mùa vụ và nội dung thí nghiệm .................................................... 56 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất khoai lang .......................................................................................... 56 Bảng 3.12: Đánh giá sự phối hợp vi khuẩn triển vọng với 3 lượng N lên năng suất khoai lang .......................................................................................... 57 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng lân lên năng suất khoai lang. ......................................................................................... 57 Bảng 3.14: Thời kỳ và lượng phân (%) bón cho thí nghiệm ........................... 58 Bảng 4.1: Số lượng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ lúa và nội sinh trên các môi trường khác nhau ........................................................................ 59 Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn nội sinh cây lúa ............................................................................................................. 60 Bảng 4.3: Số lượng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ trồng khoai lang và nội sinh trên các môi trường khác nhau ................................................... 60 x
Bảng 4.4: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang .................................................................................. 61 Bảng 4.5: Khả năng của các chủng vi khuẩn vùng rễ cố định đạm (2-8 NSU) và hòa tan lân (5-20 NSU) được phân lập trên đất phèn trồng lúa .......... 63 Bảng 4.6: Khả năng của các chủng vi khuẩn nội sinh cố định đạm (2-8 NSU) và hòa tan lân (5-20NSU) được phân lập trên đất phèn trồng lúa............ 66 Bảng 4.7: Khả năng của các chủng vi khuẩn vùng rễ cố định đạm (2-8 NSU) và hòa tan lân (5-20NSU) được phân lập trên đất phèn trồng khoai lang 68 Bảng 4.8: Khả năng của các chủng vi khuẩn nội sinh cố định đạm (2-8 NSU) và hòa tan lân (5-20NSU) được phân lập trên đất phèn trồng khoai lang 70 Bảng 4.9: Mối tương quan di truyền giứa một số chủng vi khuẩn được phân lập với các chủng vi khuẩn có trong ngân hang gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA............................................................................................. 72 Bảng 4.10: Mối tương quan di truyền giứa một số chủng vi khuẩn được phân lập với các chủng vi khuẩn có trong ngân hang gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA............................................................................................. 74 Bảng 4.11: Mối tương quan di truyền giứa một số chủng vi khuẩn được phân lập với các chủng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA............................................................................................. 77 Bảng 4.12: Khả năng cố định đạm, hòa tan lân sắt và lân nhôm của các chủng vi khuẩn tiềm năng từ đất trồng lúa. ......................................................... 81 Bảng 4.13: Khả năng cố định đạm, hòa tan lân sắt và lân nhôm của các chủng vi khuẩn tiềm năng từ đất trồng khoai ...................................................... 83 Bảng 4.14: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X2, X3 cố định đạm và hòa tan lân kết hợp với mức bón đạm lên thành phần năng suất và năng suất lúa trong điều kiện nhà lưới ......................................... 86 Bảng 4.15: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp với mức bón lân lên thành phần năng suất và năng suất lúa trong điều kiện nhà lưới ............. 88 Bảng 4.16: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp với mức bón đạm lên sinh trưởng, thành phần năng suất và năng suất khoai lang trong nhà lưới .................................................................................................................. 89 Bảng 4.17: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn kết hợp các mức đạm lên năng suất và thành phần năng suất của lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long vụ hè thu 2015 ......................................................................... 92 Bảng 4.18: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn phối hợp các lượng phân lân lên năng suất và thành phần năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long vụ thu đông 2015 ............................................................ 94 Bảng 4.19: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn triển vọng B. vietnamiensis X1 và B. vietnamiensis X3 lên thành phần năng suất và năng suất lúa trồng trên đất phèn ở Đồng bằng sông Cửu Long vụ thu đông 2015. ...................... 96 xi
Bảng 4.20: Số củ, chiều dài, đường kính và năng suất củ khoai lang tím nhật vụ xuân hè 2016 ....................................................................................... 98 Bảng 4.21: Số củ, chiều dài, đường kính và năng suất củ khoai lang tím nhật vào vụ hè thu 2016 ................................................................................. 100 Bảng 4.22: Số củ, chiều dài, đường kính và năng suất khoai lang tím nhật vào vụ hè thu 2016 ........................................................................................ 102 xii
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học (Kneip et al., 2007) ... 8 Hình 2.2: So sánh tính chất: (a) pH; (b) Al3+ trao đổi; (c) Fe2+ hoạt động và (d) SO4 hòa tan của 4 vùng đất phèn ở ĐBSCL (Ngô Ngọc Hưng, 2009) .... 31 Hình 2.3: Tương quan giữa: (a) pH và Al trao đổi và, (b) pH và SO4 hòa tan của đất phèn ĐBSCL (Ngô Ngọc Hưng, 2009) ....................................... 31 Hình 2.4: Tương quan giữa: (a) pH và C hữu cơ, và (b) C hữu cơ và hàm lượng N trong đất phèn ở ĐBSCL (Ngô Ngọc Hưng, 2009). .................. 32 Hình 2.5: Hàm lượng các cation trao đổi (K+, Ca2+, Mg2+ và Na+) của đất phèn ở bốn vùng sinh thái (Ngô Ngọc Hưng, 2009) ......................................... 33 Hình 3.1: Bản đồ khảo sát và lấy mẫu trên các vùng sinh thái đất phèn. Nguồn: Vo Tong Xuan và Matsui (1998). ............................................................ 36 Hình 3.2: Sơ đồ tiếp cận phương pháp nghiên cứu ......................................... 40 Hình 4.1: Sơ đồ cây phả hệ cho thấy mối quan hệ di truyền về trình tự gen 16S rDNA của 15 chủng vi khuẩn đất vùng rễ trồng cây lúa đã được tuyển chọn. Phân tích Neighbor-Joining với bootrap 100. Thang 0.5 chỉ khoảng 5 thay đổi trong 100 nucleotic của trình tự gen 16S rDNA. .................... 73 Hình 4.2: Sơ đồ cây phả hệ cho thấy mối quan hệ di truyền về trình tự gen 16S rDNA của 15 chủng vi khuẩn nội sinh trong cây khoai đã được tuyển chọn. Phân tích Neighbor-Joining với bootrap 100. Thang 0.5 chỉ khoảng 5 thay đổi trong 100 nucleotic của trình tự gen 16S rDNA. .................... 75 Hình 4.3: Sơ đồ cây phả hệ cho thấy mối quan hệ di truyền về trình tự gen 16S rDNA của 12 chủng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây khoai lang đã được tuyển chọn. Phân tích Neighbor-Joining với bootrap 100. Thang 0.5 chỉ khoảng 5 thay đổi trong 100 nucleotic của trình tự gen 16S rDNA... 78 xiii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BĐCM: Bán đảo Cà Mau. ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long. ĐTM: Đồng Tháp Mười. NSU: Ngày sau ủ. PAB: Vi khuẩn liên kết với thực vật. TGLX: Tứ giác Long Xuyên. TSH: Trũng sông Hậu. VK1: Burkholderia vietnamiensis X1. VK2: Burkholderia vietnamiensis X2. VK3: Burkholderia vietnamiensis X3. VK4: Enterobacter cloacae X4. VK5: Burkholderia acidipaludis X5. VK6: Bacillus sp. X6. VSV: Vi sinh vật. xiv
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Với sự đa đạng của cộng đồng vi sinh vật có ích trong đất, nhưng việc khai thác và ứng dụng các nguồn vi sinh vật có ích vào sản xuất còn nhiều hạn chế. Ngày nay, các nhà khoa học trên thế giới cũng như nước ta đã và đang tăng cường nghiên cứu để ứng dụng nhiều hơn vai trò của vi sinh vật trong nông nghiệp. Nhiều chế phẩm sinh học đã đáp ứng được nhu cầu của xã hội trước nguy cơ ô nhiễm môi trường, biến đổi khí hậu, an toàn thực phẩm. Vi sinh vật có cấu tạo đơn giản nhưng lại có khả năng phân chia, sinh sản rất nhanh với hệ enzyme phong phú có khả năng phân hủy hầu như mọi dạng vật chất trong tự nhiên. Việc tìm ra những loài vi sinh vật có ích sống trong đất vùng rễ và nội sinh trong cây mang ý nghĩa thiết thực cho nền nông nghiệp hiện đại. Vì vậy, việc sử dụng những loài vi sinh vật này giúp nâng cao năng suất cây trồng một cách an toàn, bền vững và thân thiện với môi trường. Hàm lượng đạm trong không khí tồn tại dưới hình thức N2 có thể xem như nguồn đạm vô tận cho cây xanh đưa vào chuỗi thức ăn. Ước tính hằng năm có khoảng 160 – 176 triệu tấn N2 khí quyển được cố định và chuyển hóa thành các dạng đạm khác nhau nhờ vi khuẩn cố định đạm (Hardy và Holsten, 1972; Gibson, 1995). Lượng đạm này gấp đôi so với lượng phân đạm sản xuất mỗi năm của toàn thế giới mà lại không tốn chi phí và không gây ô nhiễm môi trường. Nhiều vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh đã được công bố là có khả năng cố định đạm. Sự tồn lại lân khó tiêu trong đất đa phần là do hoạt động sản xuất nông nghiệp của con người. Hằng năm khoảng 180.000 tấn P2O5 được bón vào đất nông nghiệp ở đồng bằng sông Cửu Long nhưng cây trồng chỉ sử dụng khoảng 1/3 (Cao Ngọc Điệp và Bùi Thị Kiều Oanh, 2006). Vì tế bào có thể hút được nhiều loại lân nhưng hấp thụ cao nhất là ở dạng HPO42- hoặc H2PO4-. Tuy nhiên, dạng hòa tan trong đất này thường rất thấp, ở mức 1 ppm hoặc ít hơn (Goldstein, 1994). Dạng phổ biến của lân là không tan, thường gặp trong đá dưới dạng apatite, hydroxyapatite, oxyapatite hay các dạng kết hợp với sắt, nhôm, mangan. Ngoài ra, đất nông nghiệp còn có thể chứa một lượng lớn lân nguồn gốc từ việc bón phân lân vô cơ thường xuyên mà cây trồng không hấp thu hết, sau đó bị cố kết trong đất dưới dạng khó tan. Nhiều loài vi khuẩn cũng đã được mô tả về khả năng chuyển hóa lân khó tan thành dạng mà cây xanh có thể hấp thu được. Nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy nhiều loài vi sinh vật đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh vừa có khả năng cố định đạm, vừa hòa tan được lân khó tan, thậm chí là phân giải các hợp chất hữu cơ, các hợp chất chứa kali 1
như kaolinite, illite, montmorilonite, v.v... (Lin Qi-mei et al., 2002; Zhao et al., 2008). Các loài vi sinh vật này có thể bổ sung nguồn dinh dưỡng cơ bản cho cây mà lại hết sức thân thiện với môi trường. Muốn có chế phẩm phân bón vi sinh tốt, cần phải chọn lọc được các chủng vi sinh vật có sức cạnh tranh lớn, thích ứng rộng, có khả năng cung cấp các dưỡng chất thiết yếu cho cây trồng; đồng thời sinh tổng hợp được các chất tăng trưởng thực vật. Bên cạnh đó, vi sinh vật được phân lập từ cây trồng và vùng đất bản địa sẽ đạt được trạng thái sinh trưởng tốt nhất, thân thiện với môi trường và có hiệu quả cao nhất khi được chủng trở lại loại cây trồng và vùng đất đó. Đất phèn có môi trường axit cao trong đó nhôm phóng thích và các kim loại nặng hòa tan, các cộng đồng vi khuẩn trong loại đất này có một cấu trúc hoàn toàn khác với những vi khuẩn trong các môi trường khác. Tuy nhiên, các hệ sinh thái vi khuẩn trong đất phèn rất ít được biết đến về mặt chức năng hoặc cấu trúc cộng đồng. Phân lập vi sinh vật và nghiên cứu chức năng của vi khuẩn và các động thái của cộng đồng vi khuẩn trong đất phèn sẽ thể hiện một bước quan trọng trong việc đạt được một sự hiểu biết về sự hình thành và cải tạo đất phèn. Bên cạnh những trở ngại trong canh tác do khí hậu bất thường, sự gia tăng phát thải độc chất từ đất phèn có thể đưa đến sự thay đổi hệ sinh thái đất và giảm đa dạng sinh học trong đất. Nghiên cứu về đất phèn ở Việt Nam và trên thế giới đều cho rằng đất phèn có hàm lượng chất hữu cơ cao và hàm lượng đạm tổng số cao, vi sinh vật (VSV) đất có vai trò rất quan trọng trong sự chuyển hóa các dưỡng chất này thành hữu dụng cho cây trồng. Phát triển các mô hình canh tác thích hợp kết hợp ứng dụng công nghệ sinh học trong sử dụng VSV bản địa có lợi sẽ khai thác được tiềm năng sử dụng đất phèn và do đó góp phần ổn định sản xuất và đời sống kinh tế cho người nông dân trên vùng đất phèn Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Các bất lợi môi trường về độc chất gia tăng bất thường của phèn và mặn do biến đổi khí hậu có thể tiêu diệt và VSV có lợi đang hiện hữu trong đất phèn ĐBSCL. Việc phân lập, nhận diện và lưu giữ sẽ giúp bảo tồn nguồn tài nguyên sinh vật, đồng thời các nghiên cứu ứng dụng sẽ giúp nâng cao độ phì nhiêu đất và sản xuất cây trồng một cách có hiệu quả hơn. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (plant associated bacteria) ở lúa, khoai trồng trên đất phèn vùng đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện. 2
1.2 Mục tiêu Phân lập các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân hiện diện trong đất và nội sinh trong cây lúa, khoai lang trên đất phèn. Xác định và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân có ảnh hưởng đến sinh trưởng, năng suất của lúa và khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. Đề xuất 2-3 chủng vi khuẩn triển vọng phục vụ cho ổn định năng suất của lúa và khoai lang trồng trên đất phèn. 1.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Thu thập mẫu đất, mẫu cây của lúa và khoai lang trồng trên đất phèn ở các vùng sinh thái tại đồng bằng sông Cửu Long. - Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn liên kết với thực vật có khả năng cố định đạm, hòa tan lân. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và một số đặc điểm tế bào của các chủng vi khuẩn được phân lập. Xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của các chủng vi khuẩn được phân lập. - Nội dung 3: Nhận diện, định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn. Nhận diện một số dòng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử. - Nội dung 4: Tuyển chọn vi khuẩn trước khi tiến hành đánh giá hiệu quả vi khuẩn. Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn ở pH = 4. Xác định khả năng hòa tan lân (Fe-PO4, Al-PO4) của vi khuẩn ở pH = 4. - Nội dung 5: Xác định hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên cây lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số nghiệm thức chủng vi khuẩn lên năng suất lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới. Chọn các nghiệm thức để thử nghiệm ngoài đồng. - Nội dung 6: Xác định hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên cây khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số nghiệm thức chủng vi khuẩn lên năng suất khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới. 3
Chọn các nghiệm thức để thử nghiệm ngoài đồng. 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa, khoai lang. * Phạm vi nghiên cứu: 4 vùng đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long. 1.5 Những đóng góp mới của luận án Phân lập được 431 dòng vi khuẩn liên kết với cây lúa, trong đó có 272 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 159 chủng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Phân lập được 424 chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai, trong đó có 271 chủng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ và 153 dòng vi khuẩn nội sinh. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được có màu sắc khác nhau: trắng đục, trắng trong vàng nhạt và vàng đậm. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên, một số lượng nhỏ các chủng vi khuẩn có tế bào dạng hình cầu, Gram dương. Các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và có khả năng hòa tan lân khó tan. Hai mươi chín chủng vi khuẩn liên kết với cây lúa mà có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA. Các chủng vi khuẩn này đa dạng về loài thuộc 3 nhóm vi khuẩn: Bacilli, Gammaproteobacteria và Betaproteobacteria. Mười hai chủng vi khuẩn liên kết với cây khoai lang có khả năng tổng hợp đạm cao, hòa tan lân khó tan đã được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn 16S rDNA. Các chủng vi khuẩn này đa dạng về loài thuộc 2 nhóm vi khuẩn: Bacilli và Gammaproteobacteria. Không bón đạm đã làm giảm năng suất lúa trên đất phèn, Long Mỹ - Hậu Giang, Hòn Đất - Kiên Giang và Hồng Dân, Bạc Liêu, nhưng bón 60 kg N ha-1 kết hợp với vi khuẩn Burkholderia vietnamiensis X1 đã đạt năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Hòn Đất-Kiên Giang. Tương tự, vi khuẩn B. vietnamiensis X3 đã đạt năng suất cao hơn so với đối chứng 90N-60P2O5-30K2O trên đất phèn Long Mỹ - Hậu Giang, và Hồng Dân, 4