Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:163

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -------------------------------------------------- PHẠM MỸ DUNG NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -------------------------------------------------- PHẠM MỸ DUNG NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: (1) PGS. TS. PHẠM CÔNG HOẠT (2) GS. TS. LÊ HUY HÀM HÀ NỘI, 2018
i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học và Công nghệ và GS.TS. Lê Huy Hàm, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, những người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn và trở ngại trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo của Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm luận án. Đặc biệt, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại học Vinh, Viện Nông Nghiệp và Tài Nguyên đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ công tác, học tập và nghiên cứu trong bốn năm qua. Tôi xin chân thành cảm ơn đến Khoa Công nghệ sinh học -Viện Đại học Mở Hà Nội, Trại thủy sản mặn lợ - Nghi Xuân của Trường Đại học Vinh đã hỗ trợ, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn bên cạnh chia sẻ, và tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày……. tháng năm 2018
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả này cộng tác với các cộng sự khác. - Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả Hà Nội, ngày….. tháng năm 2018 Tác giả luận án Phạm Mỹ Dung
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH..................................................................................................... ix MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 5 1.1. GELATIN ....................................................................................................................... 5 1.1.1. Cấu trúc và tính chất gelatin ........................................................................................ 5 1.1.2. Gelatin có nguồn gốc từ da cá ..................................................................................... 6 1.2. GELATINASE.............................................................................................................. 11 1.2.1. Đặc điểm, chức năng của gelatinase .......................................................................... 11 1.2.2. Phân loại gelatinase ................................................................................................... 13 1.2.3. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của gelatinase ............................................................. 16 1.2.4. Tính chất chung của gelatinase .................................................................................. 19 1.2.5. Nguồn sản xuất gelatinase ......................................................................................... 25 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP ...................................................... 27 1.3.1. Gen mã hóa gelatinase ............................................................................................... 27 1.3.2. Sản xuất gelatinase tái tổ hợp .................................................................................... 32 1.4. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM ..... 41 1.4.1. Nghiên cứu sản xuất gelatinase.................................................................................. 41 1.4.2. Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá............................................... 42 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 50 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 50 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ.......................................................................................... 50 2.2.1. Hóa chất ..................................................................................................................... 50 2.2.2. Thiết bị ....................................................................................................................... 51 2.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ....................................................................................... 52 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 52 2.4.1. Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase................................................ 52 2.4.2. Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp ............................................................................. 55 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL .................................................. 61 2.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL ............................................. 63
iv 2.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra ........................................................... 65 2.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu....................................................................... 71 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 72 3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE .............................................. 72 3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao .................................. 72 3.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn........ 74 3.2. TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP ........................................................................................ 79 3.2.1. Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E. faecalis MD4 ..... 79 3.2.2. Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase .................................................................... 79 3.2.3. Giải trình tự và phân tích gen gelE ............................................................................ 81 3.2.4. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli BL21(DE3) ............ 84 3.2.5. Tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen gelE .............................................................. 86 3.3. ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL ................................................................................... 87 3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL .................................................................... 88 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL ............................................................ 89 3.3.3. Ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện rGEL ................................................................ 93 3.3.4. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp ....................................... 95 3.4. THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL................................................. 96 3.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL ......................................................................................... 96 3.4.2. Đặc tính của gelatinase tái tổ hợp .............................................................................. 99 3.5. ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA ................................... 106 3.5.1. Kết quả xác định các điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL................. 106 3.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen ....... 111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 121 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 145
v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ ADG : Average daily growth ADN : Acid deoxyribonucleic AMP : Ampicillin ARN : Acid ribonucleic BLAST : Basis Local Aligment Search Tool bp : base pair BSA : Bovine Serum Albumin Dal : Dalton E : Enzym EC : Classification enzyme EDTA : Ethyllene diamine tetraacetic acid EtBr : Ethidium Bromide FCR : Feed change rate IPTG : Isopropyl β-D- thiogalactoside kDa : Kilo Dalton Kb : Kilo base LB : Lubria – Bertani MMP 2 : Matrix metalloprotease 2 MMP 9 : Matrix metalloprotease 9 MMPs : Matrix metalloproteases NST : Nhiễm sắc thể OD : Optical density (mật độ quang) PBS : Phosphate buffer PCR : Polymerase Chain Reactions rGelE : recombinant gelatinase enzyme (enzyme gelatinase tái tổ hợp)
vi RE : Restriction enzyme (enzyme giới hạn) S : Cơ chất SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyarcrylamide gel electrophoresis SGR : Special growth rate sprE : serine proteinase TAE : Tris - acetate - EDTA TSVKHK : tổng số vi khuẩn hiếu khí TTHĐ : Trung tâm hoạt động UV : Ultra violet VT TTH : vector tái tổ hợp VSV : vi sinh vật
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias gariepinus) ........................................................................................................ 8 Bảng 1.2. Các thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và bì lợn (thành phần trong 1000g)...................................................................... 10 Bảng 1.3. Một số loại enzym thuộc nhóm MMPs .......................................... 14 Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng thức ăn ..................................................... 68 Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng các công thức thức ăn thí nghiệm ........... 69 Bảng 2.3. Thành phần axit amin trong các loại thức ăn thí nghiệm .............. 69 Bảng 3.1. Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn phân lập phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy. ...... 72 Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng của chủng MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C.................................................. 75 Bảng 3.3. Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn MD4 với trình tự gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên Genbank (NCBI) .......... 77 Bảng 3.4. Mức độ tương đồng trình tự nucleotit của gen gelE của chủng E. faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên GenBank .......................................................................................................... 81 Bảng 3.5. Mức độ tương đồng trình tự axít amin suy diễn của gen gelE của chủng E. faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên GenBank...................................................................................... 84 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng và biểu hiện GEL ................................................................................................................. 93 Bảng 3.7. Hiệu suất tinh sạch của GEL tái tổ hợp .......................................... 97 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của GEL tái tổ hợp ........................................................................................................ 103 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước khảo sát đến hiệu suất thủy phân ....... 106 Bảng 3.10. Thành phần axít amin của sản phẩm thủy phân từ gelatin da cá Tra ....................................................................................................................... 110
viii Bảng 3.11. Diễn biến các yếu tố môi trường nước trong quá trình ương cá Mú chấm đen ....................................................................................................... 111 Bảng 3.12. Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo khối lượng ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau .................... 113 Bảng 3.13. Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo chiều dài ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau ....................... 114 Bảng 3.14. Hệ số chuyển đổi thức ăn của cá Mú ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau ...................................................................................... 116 Bảng 3.15. Hệ số biến động của cá Mú chấm đen giai đoạn giống .............. 117
ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 . Cấu trúc điển hình của gelatinase A, B có nguồn gốc từ người ... 17 Hình 1.2. Cấu trúc của các enzym gelatinase ................................................. 18 Hình 1.3. Sơ đồ trình tự axit amin dự đoán của gelatinase ............................ 28 Hình 1.4. A) Hệ thống điều hòa sự biểu hiện của gen gelE bởi operon ......... 31 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định nồng độ protein................................. 61 Hình 2.2a. Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) ............................... 67 Hình 2.2b. Hệ thống giai ương thí nghiệm ..................................................... 67 Hình 2.3. Thức ăn công nghiệp dùng cho cá Mú chấm đen ........................... 68 Hình 3.1. Khả năng thủy phân gelatin (nồng độ 7,5 g/l) sang dạng lỏng của chủng MD4 ...................................................................................................... 73 Hình 3.2. Vòng phân giải cơ chất gelatin của chủng vi khuẩn ....................... 73 Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường MPA (a), tế bào MD4 dưới kính hiển vi điện tử quét (b) và nhuộm Gram (c) ........................................... 75 Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0% ................................................................................................... 76 Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại dựa trên việc so sánh trình tự gen 16S rRNA của chủng MD4 với các trình tự gen tương ứng của các chủng khác trên GenBank................................................................................................... 78 Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen gelE từ DNA của E. faecalis MD4. ............................................................................................................... 80 Hình 3.7. Điện di đồ kiểm tra plasmid đã mang gen. ..................................... 80 Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tách dòng bằng enzym giới hạn. 80 Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide của gen gelE từ chủng E. faecalis MD4 với trình tự của các gen gelE được đăng ký trên GenBank ........................... 83 Hình 3.10: Trình tự axit amin suy diễn của gelE của chủng E. faecalis MD484 Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm gen tinh sạch từ vector tách dòng và cắt mở vòng vector biểu hiện pET-22b(+). ................................................................ 85 Hình 3.12. Điện di đồ DNA plasmid từ thể biến nạp (a) và plasmid tái tổ hợp được xử lý bằng HindIII và SalI (b)................................................................ 85 Hình 3.13. Điện di đồ protein tái tổ hợp trên SDS-PAGE . ............................ 86
x Hình 3.14. Hình ảnh sàng lọc các dòng E. coli BL21(DE3)[pET22b(+)-gelE] trên môi trường thạch và hình ảnh kiểm tra hoạt tính GEL của các dòng trên đĩa thạch đục lỗ....................................................................................... ........ 87 Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện gelE tái tổ hợp ......................... 88 Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện gelE tái tổ hợp.................. 90 Hình 3.17 Điện di đồ GEL biểu hiện ở 37oC (a) và 34oC(b) trên gel SDS- PAGE. ............................................................................................................. 91 Hình 3.18. Điện di đồ protein GEL tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau trên gel SDS-PAGE. ...................................................................... 94 Hình 3.19. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rGEL ........................ 95 Hình 3.20. Điện di đồ protein tái tổ hợp trước và sau tinh sạch GEL bằng cột sắc ký ái lực ..................................................................................................... 97 Hình 3.21. Quy trình thu nhận gelatinase tái tổ hợp từ chủng E. coli BL21 (DE3) ) [pET 22(b+) –GelE]……………………………………………...…97 Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của rGEL ………… ...... 100 Hình 3.23. Độ bền nhiệt của rGEL ............................................................... 100 Hình 3.24. Ảnh hưởng của pH tới hoạt động xúc tác của GEL .................... 101 Hình 3.25. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của GEL tái tổ hợp .................... 102 Hình 3.26. Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính của rGEL ................ 105 Hình 3.27. Biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ gelatinase (a) và đồ thị Lineaweaver -Burk của gelatinase tái tổ hợp với cơ chất gelatin (b). .......... 106 Hình 3.28. Hiệu quả thủy phân gelatin ở các nồng độ gelatinase khác nhau 107 Hình 3.29. Hiệu suất thủy phân gelatin bằng gelatinase ở các mức nhiệt độ khác nhau....................................................................................................... 108 Hình 3.30. Hiệu suất thủy phân gelatin bằng gelatinase ở các mức thời gian thủy phân ....................................................................................................... 109 Hình 3.31. Tỷ lệ sống của cá Mú chấm đen khi kết thúc thí nghiệm ........... 113
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Gelatinase (GEL) là một trong những enzym được nghiên cứu nhiều hiện nay với tác dụng thủy phân gelatin, pheromone, collagen, casein và fibrinogen thành các đoạn peptit ngắn và các axít amin. Gelatinase là enzym chứa kim loại, thuộc nhóm protease ngoại bào sử dụng trong ngành công nghiệp hóa chất, y học, công nghệ thực phẩm... Gelatinase tự nhiên được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi khác nhau như Staphylococcus, Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter, Bacillus… Tuy nhiên, phần lớn vi khuẩn sinh gelatinase nói trên là các đối tượng vi sinh vật (VSV) gây bệnh có thể gây hại đối với con người, động vật nên không được sử dụng trực tiếp để sản xuất gelatinase. Ngoài ra, các vi khuẩn tự nhiên sinh gelatinase có hoạt tính không cao. Để khắc phục những tồn tại trên đối với nguồn gelatinase tự nhiên, hướng nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp đã và đang được các nhà khoa học, doanh nghiệp quan tâm nghiên cứu nhằm nâng cao hoạt tính enzym, sản xuất ở quy mô lớn và ứng dụng rộng rãi. Ngoài ra, gelatinase tái tổ hợp sản xuất được sẽ loại trừ tính độc của các chủng vi khuẩn tự nhiên, hạn chế tác dụng gây hại tới con người hay động vật. Một trong những phương pháp hiệu quả được chú trọng phát triển trên thế giới là ứng dụng kỹ thuật di truyền và công nghệ lên men tạo ra các chủng VSV tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp (rGEL) hoạt tính cao, sản lượng lớn và có khả năng ứng dụng trong công nghiệp. Trong nhiều công bố, hoạt tính rGEL thu được cao hơn nhiều lần so với GEL từ VSV tự nhiên. Trong số các hệ biểu hiện rGEL, Escherichia coli được xem là một trong những hệ biểu hiện nhanh, hiệu quả rGEL và tạo cơ sở khoa học cho nghiên cứu đặc tính enzym để phát triển nghiên cứu sâu hơn. Các nghiên cứu trước đây đã công bố rGEL được biểu hiện từ E. coli BL21 (DE3) cho hoạt
2 tính gelatinase đạt 38,14 U/mg và thể hiện khả năng ứng dụng hiệu quả trong thủy phân. Gelatinase là một trong những enzym quan trọng thuộc metalloproteases và chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ trong hóa học, y tế và các ngành công nghiệp mà còn trong thực phẩm và khoa học sinh học cơ bản. Cụ thể, trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thư: các enzym của họ metalloproteinase này có khả năng làm giảm hầu hết các thành phần ngoại bào và đó là chất trung gian quan trọng trong việc tái tạo mô sinh lý và trong quá trình bị bệnh lý chẩn đoán ung thư. Còn trong công nghiệp thực phẩm, gelatinase được ứng dụng để thủy phân da bò, da cá thành các axít amin. Theo Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, cả nước có diện tích trên 6.078 ha nuôi cá Tra đạt sản lượng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm và có tổng giá trị xuất khẩu cá tra của Việt Nam đạt 1,78 tỷ USD năm 2017. Sản phẩm xuất khẩu chủ yếu là cá phi-lê dạng miếng, nhưng theo ước tính cứ 2 ÷ 2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến được 1 kg cá phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 ÷ 1,5 kg sẽ nằm trong phần phụ phẩm chế biến, trong đó da cá chiếm từ 4 ÷ 6% trên tổng lượng phụ phẩm. Từ da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao hơn và có nhiều ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Vì thế, trong những năm gần đây, nhiều công ty cổ phần Việt Nam như Công ty Vĩnh Hoàn, công ty Nam Việt…đã tăng cường đầu tư các công nghệ để tối đa hóa giá trị của các phụ phẩm từ nhà máy chế biến cá Tra như sản xuất dầu, collagen, gelatin, thức ăn cho động vật. Hơn thế, gelatin có thể được thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên, các công nghệ sản xuất này yêu cầu thiết bị có tính chịu nhiệt, chịu axit hoặc base, đồng thời có thể gây ô nhiễm môi trường. Hơn nữa, việc sử dụng các dung dịch base hoặc axit để thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây hiện tượng làm chuyển dạng đồng phân của các axít amin, đây là nguyên nhân
3 làm mất hoạt tính của axít amin. Vì vậy, công nghệ enzym được lựa chọn như giải pháp an toàn. Mặt khác, hiện nay nghề nuôi cá biển đang phát triển mạnh ở nước ta, nguồn thức ăn của cá biển rất cần bổ sung các axít amin thiết yếu vào bằng thức ăn bởi bản thân cá biển không tự tổng hợp được. Xuất phát từ cơ sở thực tiễn như trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra”. 2. Mục tiêu của luận án Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả. 3. Nội dung của luận án - Sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa GEL từ vi khuẩn phân lập tại Việt Nam. - Tạo chủng E. coli tái tổ hợp sinh gelatinase và nghiên cứu điều kiện lên men biểu hiện rGEL . - Lựa chọn điều kiện thu hồi sản phẩm rGEL kỹ thuật và nghiên cứu đặc tính của rGEL. - Ứng dụng rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Kết quả của luận án góp phần cung cấp thêm dữ liệu về nguồn gen các chủng vi sinh vật tổng hợp gelatinase tự nhiên. Từ đó tạo chủng E. coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase hiệu quả và ứng dụng gelatinase trong thủy phân da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn nuôi cá Mú giống. Ý nghĩa thực tiễn
4 Đưa ra khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ hợp để thủy phân da cá Tra thành bột axít amin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn ương nuôi cá Mú chấm đen nhằm nâng cao hiệu quả. 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 5.1. Đối tượng nghiên cứu - Chủng vi khuẩn MD4 sinh gelatinase tại Bộ sưu tập vi sinh vật của Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội; Các chủng E. coli BL21(DE3), XL1-blue, nhận từ phòng thí nghiệm Genomics, Khoa Vi sinh vật học, Trường đại học quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc.- Da cá Tra được thu tại công ty cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc, Thành phố Cần Thơ. Mẫu sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20 ± 2°C cho đến khi xử lý và phân tích. Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus): khỏe mạnh, đồng đều kích cỡ 7 cm/con, khối lượng cá trung bình 7,067 g/con được thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An. 5.2. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp, ứng dụng thủy phân gelatin da cá tra với quy mô phòng thí nghiệm, triển khai tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở HN. - Nghiên cứu ứng dụng bổ sung chế phẩm axit amin triển khai ở phạm vi mô hình thử nghiệm, được triển khai tại Trại Thực Nghiệm nuôi Hải sản – Trường Đại học Vinh. 5.3. Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017. 6. Những đóng góp mới của luận án - Là luận án đầu tiên phân lập nguồn gen gel mã hóa GEL từ nguồn vi khuẩn Enterococcus faecalis phân lập tại Việt Nam. - Đã tạo được chủng E. coli BL21[pET22(b)-gelE] tái tổ hợp sinh gelatinase. - Ứng dụng hiệu quả rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra tạo chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn giống
5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GELATIN 1.1.1. Cấu trúc và tính chất gelatin Gelatin là hỗn hợp không đồng nhất các protein hòa tan trong nước có trọng lượng phân tử cao (Budavari, 1996). Theo Karim và cộng sự (2009) gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ yếu của da, xương và mô liên kết động vật. Với trọng lượng khô cơ bản, gelatin bao gồm từ 98 đến 99% protein. Trọng lượng phân tử của gelatin lớn, dao động từ 20.000 đến 300.000 Dalton (Keenan và cộng sự, 1994; Boran và cộng sự, 2010). Trong các dung dịch nước, gelatin là hỗn hợp các chuỗi polypeptit khác biệt bao gồm các thành phần α, x (dimers của α-chain) và γ (trimers α-chain) có khối lượng khoảng 90, 180 và 300 x 103 g/mol tương ứng (Rbii và cộng sự, 2011). Giống như collagen, gelatin có cấu trúc dạng chuỗi gồm những phân tử có kích thước nhỏ liên kết với nhau bằng liên kết hydro tạo thành mạng lưới. Trong đó, mỗi phân tử gelatin là các chuỗi axít amin được liên kết bằng liên kết peptit. Trình tự axít amin của gelatin chủ yếu là Gly-Pro-Hyp (Poppe, 1997). Hàm lượng axít amin của gelatin tương đối cao: glycine (Gly) 26-34%; Proline (Pro) 10-18%; và hydroxy proline (Hyp) 7-15% (Veis, 1964, Poppe, 1997). Các axít amin quan trọng khác bao gồm: Alanin (Ala) 8-11%; Arginine (Arg) 8-9%; axít aspartic (Asp) 6-7%; và glutamic(Glu)10-12% (Hudson, 1994, Poppe, 1997). Gelatin không chứa Tryptophan và chứa ít Isoleucin, Threonin và Methionin (Potter và Hotchkiss, 1998). Các tính chất quan trọng nhất của gelatin có thể được chia thành ba nhóm: i) đặc tính liên quan đến hoạt động của chất gel, ví dụ: sự hình thành gel, tăng cường kết cấu và tăng cường khả năng phụ thuộc nước, ii) Các tính chất hydrat hóa cơ bản như sưng và tan iii) các tính chất liên quan đến hoạt động bề mặt của chúng, bao gồm nhũ tương, tạo thành bọt, tính ổn định, sự bám dính, sự gắn kết, chức năng keo và khả năng tạo màng.
6 1.1.2. Gelatin có nguồn gốc từ da cá Gelatin được sản xuất nhiều nhất từ da lợn (46%), da trâu, bò (29,4%), thịt lợn và xương gia súc (23,1%). Gelatin cá chiếm dưới 1,5% tổng sản lượng gelatin trong năm 2007, tỷ lệ này tăng gấp đôi vào năm 2002, cho thấy xu hướng sản xuất gelatin từ các động vật không phải là động vật có vú ngày càng gia tăng. Gelatin từ cá loại bỏ nguy cơ lây nhiễm bệnh bò điên và có thể sử dụng cho các cộng đồng không sử dụng các sản phẩm tư gia súc như lợn, bò (Gómez-Guillén và cộng sự, 2011; Ahmad & Benjakul, 2011 ). Gelatin có nguồn gốc từ cá có thể được chiết xuất từ da và xương của cá. Phụ phẩm và chất thải trong quá trình chế biến thủy sản chiếm đến 75% tổng khối lượng nguyên liệu sản xuất gelatin từ cá (Shahidi, 1995). Khoảng 30% chất thải của da và xương có hàm lượng collagen cao có thể được sử dụng để sản xuất gelatin (Gómez-Guillén và cộng sự, 2002). Việc chiết xuất gelatin từ da cá có thể cung cấp sản phẩm thay thế phục vụ cộng đồng Hồi giáo và nâng cao giá trị ngành sản xuất cá tuyết (Gudmundsson và Hafsteinsson, 1997;Montero và cộng sự, 1999), cá megrim (Montero và Gómez-Guillén., 2000) và cá rô phi (Grossman và Bergman., 1992; Jamilah và Harvinder., 2002). Năng suất và chất lượng gelatin bị ảnh hưởng không chỉ bởi các loài hoặc mô cá mà còn vào độ pH, nhiệt độ và thời gian trong quá trình tiền xử lý và chiết xuất (Montero và Gómez-Guillén, 2000). Da cá là sản phẩm phụ chủ yếu của ngành công nghiệp chế biến cá, gây lãng phí, ô nhiễm môi trường và có thể cung cấp một nguồn gelatin có giá trị (Badii và Howell, 2006). Da cá chứa một lượng lớn collagen. Nagai và Suzuki (2000) công bố rằng hàm lượng collagen trong phụ phẩm da cá của cá Vược Nhật Bản, cá chẻ và cá mập lần lượt là 51,4%, 49,8% và 50,1% (khối lượng khô). Năm 2002, Gómez-Guillén và cộng sự đã công bố rằng 30% chất thải của cá ở dạng xương và da có collagen cao. Từ những năm 1960, gelatin đã được sản xuất quy mô công nghiệp sử dụng axit làm tác nhân thủy phân (Norland, 1990). Năm 1992, quy trình sản
7 xuất gelatin từ cá và đặc tính gelatin thu được đã được mô tả bởi Grossman và Bergman (1992). Kể từ đó, gelatin cá được chiết xuất từ da và xương của nhiều cá nước lạnh khác nhau như cá tuyết,cá hồi và các loài cá nước ấm như cá ngừ, cá da trơn, cá rô phi, cá Nile, cá mập và cá biển. Gelatin được sản xuất qua ba giai đoạn: tiền xử lý nguyên liệu thô, chiết xuất gelatin và làm sạch kết hợp làm khô. Tùy thuộc vào phương pháp mà collagen được xử lý trước, hai loại gelatin có thể được sản xuất. Chất gelatin loại A (điểm đẳng điện áp ở pH 6÷9) được sản xuất từ collagen được xử lý bằng axít và gelatin loại B (điểm đẳng điện khoảng pH 5) được sản xuất từ collagen bằng phương pháp xử lý kiềm (Stainsby, 1987). Xử lý axít là thích hợp nhất cho collagen được tìm thấy trong da lợn hoặc cá, xử lý kiềm phù hợp cho các collagen phức tạp hơn được tìm thấy trong da bò. Gelatin từ da cá đã được chiết xuất bằng một số cách khác nhau. Thông thường, da cá được xử lý trong điều kiện axit yếu trước khi chuyển qua công đoạn tạo gelatin. Gómez-Guillén và Montero (2001) đã công bố quy trình sản xuất gelatin từ da cá bao gồm các công đoạn: tiền xử lý colagen trong dung dịch axit yếu, tiếp đó trích xuất trong nước ở nhiệt độ vừa phải (45 oC) và xử lý nhiệt ở nhiệt độ trên 40oC, toàn bộ quá trình mất khoảng 24 giờ. Theo Yang và cộng sự (2007) gelatin được tạo thành từ cá da trơn bằng cách tiền xử lý da bằng dung dịch kiềm NaOH, tiếp theo là dung dịch axít acetic, sau đó 30g da được rửa sạch, xử lý với NaOH theo tỷ lệ 1: 6 ( w/v) cho thời gian biến đổi và rửa bằng nước máy lặp lại hai lần trước khi mẫu được xử lý bằng axit acetic (1: 6 w/v). Loại bỏ nước và rửa mẫu bằng nước máy theo tỉ lệ (1: 6 w/v), bước này lặp lại ba lần. Sau các bước xử lý trên, bổ sung nước không chứa ion vào mẫu và bảo quản ở 4°C. Năm 2008, quy trình tách chiết da cá da trơn được hai nhóm nghiên cứu cùng đưa ra. Theo quy trình đó, da cá da trơn được ngâm trong dung dịch 50- mmol /L axít acetic theo tỉ lệ 1:8 v/w ở 15 oC trong 18 giờ. Da được tiếp tục xử lý rửa bằng nước cất cho đến khi độ pH đạt 3,5÷4,0. Quá trình tách chiết
8 có sự tham gia của pepsin. Sự tách chiết gelatin được thực hiện trong nước cất ở 45oC trong 7 giờ (Nalinanon và cộng sự, 2008; Liu và cộng sự, 2008). Theo Sanaei Ardekani và cộng sự (2013) đã công bố điều kiện tối ưu cho chiết xuất gelatin từ da cá da trơn thu được bằng cách sử dụng 0,13 mol/L NaOH và 0,09 mol/L axit axetic xử lý trong thời gian 1 giờ và tiếp theo là chiết xuất nước nóng ở 64,92°C trong 3 giờ. Và nhóm nghiên cứu này cũng công bố rằng gelatin da cá da trơn khi được thủy phân với 6 mol/L HCl ở 110ºC trong 16 giờ. Sau đó, dịch thủy phân được hòa tan trong nước khử ion và được lọc. Thành phần axit amin đã được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC). Kết quả thành phần axit amin của gelatin da cá da trơn (Clarias gariepinus) được trình bày ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias gariepinus) (Sanaei Ardekani và cộng sự, 2013) Axit amin Số dư lượng/1000 Alanine 86 Arginine 78 Aspartic acid 50 Cystine 0 Glutamic acid 85 Glycine 250 Histidine 11 Hydroxyproline 58 Isoleucine 13 Leucine 22 Lysine 33 Methionine 92 Phenylalanine 16