Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu

Chia sẻ: Chuheodethuong 09 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:159

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nhằm làm rõ chức năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp ứng với điều kiện hạn ở cây mô hình Arabidopsis và tìm ra các gen CaNAC tiềm năng liên quan đến đáp ứng với điều kiện hạn ở cây đậu gà.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------- NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------- NGUYỄN HỮU KIÊN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN Ở CÂY HỌ ĐẬU Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng 2. TS. Trần Phan Lam Sơn HÀ NỘI - 2020 ii
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng và TS. Trần Phan Lam Sơn. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học quốc tế và đã được sự đồng ý của tất cả các tác giả trong các bài báo, và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị nào khác. Tất cả trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 TÁC GIẢ Nguyễn Hữu Kiên i
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo hợp tác quốc tế IPA (International Program Associate) liên kết giữa Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam) và Viện Nghiên cứu RIKEN Nhật (Bản) đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng (Nguyên Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp) và TS. Trần Phan Lam Sơn (Trưởng Nhóm nghiên cứu về con đường dẫn truyền tín hiệu (nay đổi tên thành Nhóm nghiên cứu về đáp ứng với yếu tố bất lợi) thuộc Trung tâm Khoa học về nguồn tài nguyên bền vững, Viện RIKEN, Nhật Bản) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện và hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các postdoc, kỹ thuật viên và nhân viên trong nhóm nghiên cứu của TS. Trần Phan Lam Sơn, nơi tôi thực hiện các nội dung của luận án đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện vể thời gian cho tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Đào tạo Sau đại học, thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đặc biệt bố mẹ, anh chị và vợ luôn ủng hộ, động viên, khích lệ và là chỗ dựa về tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án nghiên cứu. Ngoài ra, tôi cũng gửi lời cảm ơn tới bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ và có những ý kiến đóng góp quý báu để tôi có thể hoàn thành luận án nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 TÁC GIẢ Nguyễn Hữu Kiên ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... x DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ xii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án............................................................ 2 2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................... 2 2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án............................................ 3 3.1. Ý nghĩa khoa học.................................................................................. 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................. 3 4. Những đóng góp mới của luận án........................................................... 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 6 1.1. Hạn hán và những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán đối với cây trồng ......6 1.1.1. Những thiệt hại của ngành trồng trọt do hạn hán gây ra ............. 6 1.1.2. Hạn hán và nguyên nhân gây ra hạn hán ở cây trồng ................ 11 1.1.3. Ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng .......................................... 12 1.1.3.1. Ảnh hưởng của hạn tới sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng...13 1.1.3.2. Ảnh hưởng của hạn tới đặc điểm hình thái và giải phẫu ............ 14 1.1.3.3. Ảnh hưởng của hạn tới mối quan hệ giữa cây và nước ............... 15 1.1.3.4. Ảnh hưởng của hạn tới quá trình quang hợp .............................. 15 1.1.3.5. Ảnh hưởng của hạn tới quá trình hô hấp..................................... 17 1.1.3.6. Ảnh hưởng của hạn tới sự hấp thu dinh dưỡng khoáng .............. 18 1.1.3.7. Ảnh hưởng của hạn tới sự cân bằng hormone............................. 18 1.1.3.8. Ảnh hưởng của hạn tới hàm lượng protein, axit amin và khoáng chất...19 iii
1.1.3.9. Ảnh hưởng của hạn tới lipid ........................................................ 22 1.1.3.10. Ảnh hưởng của hạn tới quá trình oxy hóa ................................. 22 1.1.3.11. Ảnh hưởng của hạn tới các phân tử........................................... 23 1.2. Sự đáp ứng của cây trồng với hạn ..................................................... 24 1.3. Vai trò của yếu tố phiên mã NAC trong quá trình đáp ứng với stress hạn của cây trồng ............................................................................ 27 1.3.1. Tổng quan yếu tố phiên mã NAC ..................................................... 27 1.3.2. Cấu trúc đặc trưng của các protein NAC ........................................ 29 1.3.3. Chức năng của yếu tố phiên mã NAC trong quá trình đáp ứng với hạn ở cây trồng .................................................................................................... 29 1.4. Vai trò của cây họ đậu ........................................................................ 35 1.4.1. Vai trò của cây đậu tương ............................................................. 35 1.4.2. Vai trò của cây đậu gà ................................................................... 37 1.4.3. Ảnh hưởng của hạn tới cây đậu tương và đậu gà........................ 39 1.5. Cải thiện khả năng chống chịu hạn của cây họ đậu sử dụng kỹ thuật chuyển gen ........................................................................................ 43 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 47 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 47 2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................. 47 2.1.2. Các chủng khuẩn, nấm men và vector ......................................... 47 2.1.3. Các cặp mồi được sử dụng cho PCR và qRT-PCR ...................... 47 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 47 2.2.1. Thời gian nghiên cứu .................................................................... 47 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 48 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 48 2.3.1. Trồng và xử lý cây đậu tương ................................................... 48 2.3.2. Tách chiết, tinh sạch RNA và tổng hợp cDNA cho tách dòng gen GmNAC085................................................................................................ 48 2.3.3. Thiết kế cấu trúc vector và phân tích khả năng hoạt động phiên mã của GmNAC085 trong nấm men .............................................................. 49 iv
2.3.4. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen GmNAC085 trong cây mô hình Arabidopsis ...................................................................................... 50 2.3.5. Phương pháp biến nạp và sàng lọc cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 ....................................................................................... 52 2.3.6. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 35S:GmNAC085 bằng kỹ thuật lai southern blot .............................................................................. 53 2.3.7. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 trong điều kiện thường ........................................ 53 2.3.8. Phương pháp đo hàm lượng diệp lục ở lá .................................... 54 2.3.9. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 trong điều kiện xử lý hạn ............................................ 54 2.3.9.1. Phương pháp đánh giá hạn trên cùng khay................................. 55 2.3.9.2. Phương pháp cân trọng lượng cốc .............................................. 55 2.3.10. Phương pháp đo nhiệt độ bề mặt lá của cây WT và cây chuyển gen 35S:GmNAC085 trong điều kiện xử lý hạn..................................... 56 2.3.11. Đo tỷ lệ thành phần nước, mức độ rò rỉ ion và độ ẩm đất ......... 56 2.3.12. Xác định hàm lượng malondiadehyde và khả năng hoạt động của các enzyme chống oxy hóa ............................................................... 57 2.3.13. Phương pháp trồng, xử lý và thu mẫu của cây đậu gà .............. 57 2.3.14. Tách chiết RNA, xử lý DNAseI, và tổng hợp cDNA cho phân tích qRT-PCR ........................................................................................... 58 2.3.15. Phân tích sự biểu hiện của các gen bằng kỹ thuật qRT-PCR ... 58 2.3.16. Tiêu chuẩn lựa chọn gen CaNAC đáp ứng hạn tiềm năng ....... 59 2.3.17. Phân tích ý nghĩa thống kê.......................................................... 60 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 61 3.1. Nghiên cứu chức năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp ứng với điều kiện hạn ở cây mô hình Arabidopsis ................................... 61 3.1.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector và phân tích sự hoạt động phiên mã của GmNAC085 trong nấm men ....................................................... 61 3.1.2. Kết quả phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen GmNAC085 trong cây mô hình Arabidopsis ............................................................... 63 v
3.1.3. Kết quả sàng lọc và lựa chọn các dòng cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 ................................................................................ 66 3.1.4. Kết quả đánh giá kiểu hình của cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều kiện thường ................................ 68 3.1.5. Kết quả đánh giá khả năng kháng hạn của cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 ................................................................... 70 3.1.6. Kết quả đánh giá mức độ phá hủy tế bào và tốc độ thoát hơi nước của các cây chuyển gen 35S:GmNAC085 ở điều kiện xử lý hạn .......... 72 3.1.7. Sự biểu hiện của GmNAC085 tăng cường bảo vệ cây Arabidopsis chuyển gen chống lại phản ứng oxy hóa do stress hạn gây ra .............. 74 3.1.8. Sự biểu hiện của GmNAC085 làm tăng mức biểu hiện của các gen chỉ thị trong cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 ở điều kiện stress hạn .......................................................................................... 77 3.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của các gen CaNAC trong cây đậu gà ở điều kiện xử lý hạn và ABA....................................................................... 84 3.2.1. Kết quả so sánh tỷ lệ thành phần nước giữa hai giống đậu gà Hashem và ILC482 ở điều kiện xử lý mất nước..................................... 84 3.2.2. Đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC ở lá và rễ của giống Hashem và ILC482 trong điều kiện xử lý hạn ................................................................ 85 3.2.3. Đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC ở lá và rễ của giống Hashem và ILC482 trong điều kiện xử lý ABA...................................... 94 3.2.4. Sự biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC ở trong lá của 2 giống ILC482 và Hashem ...................................................................... 102 3.2.5. Sự biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC trong rễ của 2 giống ILC482 và Hashem ................................................................................ 105 3.2.6. Lựa chọn các gen CaNAC tiềm năng cho nghiên cứu chức năng sâu hơn ................................................................................................... 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 113 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..115 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 116 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 134 vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ tiếng anh Thuật ngữ tiếng việt ABA Abscisic acid Axit abscisic Ade Adenine A-đê-nin ABRC3 ABA response complex 3 Phức hợp đáp ứng ABA 3 AD Activation domain Vùng trình tự hoạt hóa AP2/ERF APETALA2/Ethylene response Các yếu tố liên kết đáp ứng element binding factors với ethylene APX Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase AREB/ABF Abscisic acid-responsive Liên kết yếu tố đáp ứng ABA element binding ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphat bZIP bZIP transcription factor Yếu tố phiên mã bZIP CAT Catalase Catalaza CCA1 Circadian clock associated 1 Liên kết nhịp sinh học 1 cDNA complementary DNA ADN bổ sung CO2 Carbon dioxide cacbon điôxít CSD1 Copper/Zinc superoxide Copper/Zinc superoxide dismutase 1 dismutase 1 D Drought Xử lý hạn DAD Days after drought Ngày sau xử lý hạn DNA Deoxinucleic acid Axit deoxinucleic DREB Dehydration responsive Protein liên kết với yếu tố đáp element-binding protein ứng mất nước ERD1 Early responsive to Đáp ứng sớm với bất lợi mất dehydration stress 1 nước 1 GM Germination medium Môi trường nảy mầm vii
GR Glutathione reductase Glutathione reductase His Histidine Histidin IAA Indole-3-acetic acid Axit indole-3-acetic LB Lysogeny broth Môi trường giàu dinh dưỡng nuôi khuẩn E.coli LEA Late embryogenesis abundant Sự phát triển phôi muộn LHY Late elongated hypocotyl Chậm kéo dài trụ dưới lá mầm MDA Malondiadehyde Malondialdehyd MGDG Monogalactosyldiacylglycerol Monogalactosyldiacylglycerol miRNA microRNA ARN không mã hóa mRNA Messenger RNA RNA thông tin MYB/MYC MYB/MYC transcription Yếu tố phiên mã MYB/MYC factor NAC NAM (no apical meristem), Yếu tố phiên mã NAC ATAF1/2, CUC2 (cup- shaped cotyledon) NACRS NAC recognition sequence Trình tự nhận biết NAC NADPH Nicotinamide adenine Nicotinamit adenin dinucleotide phosphate dinucleotit phosphat NCED Nine-cis-epoxy carotenoid Nine-cis-epoxy carotenoid dioxygenase dioxygenase O2- Superoxide Superoxit OE Overexpression Sự biểu hiện PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase POD Peroxidase Peroxidase PSI Photosystem I Hệ thống quang hợp I PSII Photosystem II Hệ thống quang hợp II qRT-PCR Quantitative real-time PCR PCR định lượng thời gian thực viii
RD20 Responsive to desiccation 20 Đáp ứng với sự mất nước 20 RD29B Responsive to desiccation 29B Đáp ứng với sự mất nước 29B RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNAi RNA interference RNA can thiệp ROS Reactive oxygen species Các loại phản ứng oxi hóa RT-PCR Reverse transcription Chuỗi phản ứng polymerase polymerase chain reaction phiên mã ngược RuBisCO Ribuloses-bisphosphate Ribuloses-bisphosphate carboxylase/oxygenase carboxylase/oxygenase sAPX Stromal ascorbate peroxidase Stromal ascorbate peroxidase SD Synthetic dropout Môi trường nuôi nấm men SOD Superoxide dismutase Superoxide dismutase SSC Saline-sodium citrate Saline-sodium citrate TF Transcription factor Yếu tố phiên mã Trp Tryptophan Tryptophan TRR Transcriptional regulatory region Vùng điều hòa phiên mã WT Wild-type Loài (cây) gốc, loài nguyên thủy, cây đối chứng không chuyển gen WW Well-watered Tưới nước đầy đủ WRKY WRKY transcription factor Yếu tố phiên mã WRKY YEB Yeast Extract Broth Dịch chiết nấm men nuôi khuẩn Agrobaceria ix
DANH MỤC BẢNG TT Bảng Nội dung Trang 1.1 Diện tích canh tác của một số cây trồng bị ảnh hưởng 7 bởi hạn hán trên thế giới 1.2 Ảnh hưởng của hạn hán đến năng suất của các cây trồng 9 ở một số nước trên thế giới 1.3 Một số yếu tố phiên mã NAC ở cây trồng khác nhau 29 1.4 Một số gen NAC được nghiên cứu chức năng trong quá 33 trình đáp ứng với hạn hán ở cây trồng 1.5 Sản lượng đậu tương theo từng năm trên thế giới (triệu tấn) 37 1.6 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những 38 năm gần đây 1.7 Tình hình sản suất đậu gà trên thế giới năm 2018 40 1.8 Ảnh hưởng của hạn hán đến một số giai đoạn của cây đậu 44 tương và đậu gà 1.9 Một số gen ứng viên đã được chuyển vào cây họ đậu 45 nhằm tăng cường khả năng chịu hạn 3.1 Kết quả dự đoán trình tự nhận biết NAC (CACG) trong 79 vùng promoter 1000bp của một số gen chỉ thị 3.2 Mức độ biểu hiện của các gen CaNAC ở lá trong giống đậu 88 gà chịu hạn tốt ILC482 và chịu hạn kém Hashem ở điều kiện xử lý mất nước 3.3 Mức độ biểu hiện của các gen CaNAC ở rễ trong giống 90 đậu gà chịu hạn tốt ILC482 và chịu hạn kém Hashem ở điều kiện xử lý mất nước 3.4 Mức độ biểu hiện của các gen CaNAC ở lá trong giống 96 x
đậu gà chịu hạn tốt ILC482 và chịu hạn kém Hashem ở điều kiện xử lý ABA 3.5 Mức độ biểu hiện của các gen CaNAC ở rễ trong giống 98 đậu gà chịu hạn tốt ILC482 và chịu hạn kém Hashem ở điều kiện xử lý ABA 3.6 So sánh tỷ lệ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong lá của 105 giống ILC482 và Hashem ở điều kiên thường, xử lý mất nước và ABA 3.7 So sánh các mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong 108 rễ của giống ILC482 và Hashem ở điều kiên thường, xử lý mất nước và ABA xi
DANH MỤC HÌNH TT Hình Nội dung Trang 1.1 Biểu đồ nhiệt độ trên thế giới 7 1.2 Bản đồ diện tích khô hạn tỉnh Ninh Thuận năm 2014-2016 10 1.3 Ảnh hưởng của hạn hán tới cây trồng và cơ chế chống chịu 13 của cây trồng đối với hạn hán 1.4 Sự đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán 28 1.5 Cấu trúc đặc trưng của yếu tố phiên mã NAC 30 1.6 Ảnh hưởng của hạn hán tới cây họ đậu 41 3.1 Kết quả thiết kế vector pGBKT7:TRR cho phân tích sự 64 biểu hiện ở nấm men 3.2 Kết quả phân tích khả năng phiên mã của GmNAC085 64 trong nấm men 3.3 Kết quả nhân dòng gen GmNAC085 từ thư viện cDNA 66 và PCR kiểm tra khuẩn lạc của vector tái tổ hợp pKS:GmNAC085 3.4 Kết quả sàng lọc và lựa chọn cây Arabidopsis chuyển 68 gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 trên môi trường GM có chứa kháng sinh kanamycin 3.5 Kết quả phân tích southern blot của các cây Arabidopsis 69 chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 3.6 Kiểu hình lá và thân của cây Arabidopsis chuyển gen 70 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều kiện bình thường 3.7 Kiểu hình rễ và hàm lượng diệp lục trong lá của cây 71 Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều kiện bình thường xii
3.8 Kiểu hình chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển 72 gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 sử dụng phương pháp phân tích tỷ lệ cây sống sót 3.9 Kiểu hình chịu hạn của các cây 35S:GmNAC085 OE1 và 73 OE2 sử dụng phương pháp phân tích giảm sinh khối 3.10 So sánh tỷ lệ thành phần nước và mức độ dò rỉ ion của 75 cây WT và cây chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều kiện xử lý hạn. 3.11 So sánh nhiệt độ bề mặt lá của cây WT và cây 76 chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều kiện xử lý hạn 3.12 Hàm lượng Malondialdehyde (MDA) ở trong lá của cây WT 77 và cây 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 sau 12 ngày xử lý hạn 3.13 Hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa và mức độ biểu 78 hiện của các gen liên quan ở trong lá của cây WT và cây 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 sau 12 ngày xử lý hạn 3.14 Mức độ biểu hiện của các gen liên quan tới bất lợi ở trong 80 lá của cây WT và cây 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 sau 12 ngày xử lý hạn 3.15 Cơ chế đáp ứng của cây Arabidopsis chuyển gen 84 35S:GmNAC085 với điều kiện hạn 3.16 So sánh tỷ lệ thành phần nước giữa hai cây đậu gà ILC482 và 86 Hashem trong quá trình xử lý mất nước 3.17 Mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong lá của giống 89 chịu hạn kém Hashem và giống chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện xử lý mất nước 3.18 Mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong rễ của giống chịu 91 xiii
hạn kém Hashem và giống chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện xử lý mất nước 3.19 Sự trùng lặp của các gen CaNAC ở cả rễ và lá của hai 92 giống Hashem và ILC482 trong điều kiện xử lý mất nước 3.20 Mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong lá của giống chịu 97 hạn kém Hashem và giống chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện xử lý ABA 3.21 Mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong rễ của giống 99 chịu hạn kém Hashem và giống chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện xử lý ABA 3.22 Sự trùng lặp của các gen CaNAC ở cả rễ và lá của hai 100 giống Hashem và ILC482 trong điều kiện xử lý ABA xiv
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hạn hán được biết tới như là một trong những yếu tố bất lợi phi sinh học ảnh hưởng tiêu cực tới năng suất cây trồng và an ninh lương thực trên toàn thế giới. Hơn nữa, hạn hán là nguyên nhân gây ra một số ảnh hưởng bất lợi khác nhau về quá trình trao đổi chất ở thực vật như sự co giãn tế bào, phá hủy màng tế bào, giảm chức năng của các enzyme tham gia quá trình liên kết màng, oxy hóa lipid và các protein bởi việc tích lũy sản phẩm dư thừa của các phản ứng oxy hóa, và ức chế khả năng quang hợp. Để đối phó với hạn, cây trồng kích hoạt một số cơ chế đáp ứng với bất lợi ở các mức độ sinh hóa, sinh lý và phân tử khác nhau để giúp chúng sống sót. Hơn nữa, thực vật cũng có thể đáp ứng với hạn hán một cách gián tiếp thông qua một số mạng lưới điều khiển khác nhau, trong đó các yếu tố phiên mã (TF) đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện của các gen mục tiêu. Các protein NAC được biết tới như là một siêu họ trong số các họ TF và có mặt ở hầu hết các loài thực vật. Các TF NAC tham gia vào tất cả các quá trình sinh trưởng, phát triển và đáp ứng với các môi trường bất lợi khác nhau ở thực vật. Trong những năm gần đây, nhiều công bố đã chỉ ra vai trò của các TF NAC tham gia quá trình đáp ứng hạn ở thực vật. Cụ thể, một vài gen NAC đã được phát hiện và nghiên cứu chức năng trong điều kiện stress hạn hoặc stress thẩm thấu ở cây mô hình Arabidopsis (ANAC019, ANAC055, ANAC072/RD26 và ANAC016), và một số cây trồng quan trọng như cây lúa (OsNAC5, OsNAC6 và OsNAC10), cây lúa mỳ (TaNAC2, TaNAC29 và TaNAC67), cho thấy tiềm năng trong việc cải thiện khả năng chống chịu hạn cho cây trồng. Tuy nhiên, có rất ít các công bố nghiên cứu chức năng cụ thể của các TF NAC trên đối tượng cây họ đậu. Trong khi, cây đậu tương (Glycine max L.) và đậu gà (Cicer arietinum L.) được biết tới như là những cây trồng họ đậu quan trọng được trồng ở nhiều vùng trên thế giới và là nguồn thực phẩm cung cấp 1
dinh dưỡng thiết yếu cho con người và vật nuôi cũng đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hạn hán. Cụ thể, hạn hán ảnh hưởng tới tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây họ đậu dẫn đến làm giảm năng suất và sản lượng cây đậu tương và đậu gà trên toàn thế giới. Chính từ những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán đối với cây trồng nói chung và cây họ đậu nói riêng; cùng với đó là vai trò và tầm quan trọng của cây họ đậu, cụ thể là cây đậu tương và đậu gà đối với nền nông nghiệp của Việt Nam cũng như trên thế giới, chúng tôi đã xây dựng một luận án nghiên cứu khoa học với tiêu đề “Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu”. Trong đó, nghiên cứu sẽ tập trung làm rõ chức năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp ứng với hạn hán trên đối tượng cây mô hình Arabidopsis thaliana. Sau đó, dựa trên các kết quả nghiên cứu chức năng cụ thể của gen GmNAC085 được làm sáng tỏ, sẽ tiếp tục sàng lọc và phân tích để phát hiện ra các gen NAC khác có tiềm năng đáp ứng tốt với hạn trên đối tượng cây họ đậu quan trọng khác, cụ thể là cây đậu gà. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án 2.1. Mục tiêu tổng quát Mục tiêu của đề tài nhằm làm rõ chức năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp ứng với điều kiện hạn ở cây mô hình Arabidopsis và tìm ra các gen CaNAC tiềm năng liên quan đến đáp ứng với điều kiện hạn ở cây đậu gà. 2.2. Mục tiêu cụ thể  Nghiên cứu để làm rõ chức năng của gen GmNAC085trong quá trình đáp ứng với điều kiện xử lý hạn ở cây mô hình Arabidopsis, từ đó tìm ra các cơ chế chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085.  Phân tích, đánh giá mức độ biểu hiện của các gen CaNAC giữa hai giống đậu gà chịu hạn kém Hashem và chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện xử lý mất nước và ABA bằng kỹ thuật qRT-PCR để tìm ra các gen CaNAC tiềm năng có 2
khả năng đáp ứng tốt với hạn hán. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3.1. Ý nghĩa khoa học  Các kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy GmNAC085 là gen đáp ứng với bất lợi ở cây đậu tương đóng vai trò như một yếu tố hoạt hóa phiên mã. Sự biểu hiện liên tục của GmNAC085 trong cây Arabidopsis dưới sự điều khiển của promoter 35S đã làm tăng cường khả năng chống chịu hạn của các cây chuyển gen thông qua sự điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây, giảm tỷ lệ thoát hơi nước và sự phá hủy màng tế bào, nhưng tăng mức độ hoạt động của các enzyme chống oxy hóa và tăng sự biểu hiện của các gen đáp ứng tới bất lợi trong các cây chuyển gen.  Kết quả của luận án cũng đã cung cấp các dữ liệu khoa học về sự biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC ở cả hai giống đậu gà chịu hạn kém Hashem và chịu hạn tốt ILC482 trong điều kiện xử lý mất nước và ABA; đồng thời dựa vào kết quả so sánh về mức độ biểu hiện của các gen CaNAC giữa hai giống đậu gà này và tiêu chí lựa chọn gen ứng viên, xác định được một số gen CaNAC có tiềm năng đáp ứng với hạn tốt cho nghiên cứu chức năng cụ thể ở trên đối tượng cây mô hình/cây trồng quan trọng.  Ngoài ra, luận án được xem như tài liệu tham khảo có ý nghĩa cho công tác giảng dạy cũng như các hoạt động nghiên cứu khoa học liên quan tới lĩnh vực cải tạo cây trồng nông nghiệp có khả năng đáp ứng tốt với hạn hán. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn  Kết quả của luận án cung cấp cái nhìn chi tiết về vai trò tích cực của gen GmNAC085 trong việc điều khiển sự thích nghi của cây trồng với hạn hán, từ đó cho thấy tiềm năng ứng dụng của gen GmNAC085 đối với việc phát triển cây trồng chuyển gen chịu hạn.  Mặt khác, luận án cũng cung cấp 5 gen CaNAC ứng cử viên đầy triển 3
vọng đáp ứng với mất nước cho nghiên cứu chức năng cụ thể trước khi sử dụng chúng trong kỹ thuật di truyền để phát triển cây đậu gà chuyển gen, cũng như các cây trồng khác có năng suất vượt trội ở điều kiện thiếu nước. 4. Những đóng góp mới của luận án  Kết quả của luận án cho thấy GmNAC085 đóng vai trò như là một chất hoạt hóa phiên mã trong nấm men, với vùng hoạt hóa nằm ở đầu C- của GmNAC085. Khi so sánh với cây đối chứng không chuyển gen (WT), các cây Arabidopsis chuyển gen (35S:GmNAC085) đã cho thấy là giảm sự tăng trưởng, nhưng cải thiện khả năng chịu hạn thông qua việc tăng cường tính toàn vẹn của màng tế bào và giảm tốc độ thoát hơi nước ở điều kiện thiếu nước. Hơn nữa, sự giảm hàm lượng MDA đi kèm với việc tăng khả năng hoạt động của các enzyme chống oxy hóa SOD, CAT và APX trong các cây 35S:GmNAC085. Cùng với đó, sự biểu hiện mạnh hơn của các gen mã hóa các enzyme chống oxy hóa và các gen đáp ứng với hạn trong cây 35S:GmNAC085 so với cây WT ở điều kiện hạn. Các kết quả này cung cấp cái nhìn rõ nét về vai trò tích cực của GmNAC085 trong việc điều hòa sự đáp ứng của cây trồng với hạn hán, từ đó cho thấy tiềm năng ứng dụng của GmNAC085 trong công tác phát triển giống cây trồng kháng hạn.  Cùng với đó, luận án đã đánh giá sự biểu hiện của 19 gen CaNAC đáp ứng với mất nước trong lá và rễ của hai giống đậu gà đối lập nhau về tính chịu hạn ở trong các điều kiện ngâm nước (đối chứng), xử lý mất nước và ABA, để kiểm tra sự tương quan giữa mức độ biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC và khả năng chịu hạn khác nhau của hai giống này. Kết quả phân tích qRT-PCR cho thấy mối quan hệ tích cực giữa số lượng gen tăng và giảm bởi xử lý mất nước và khả năng chịu hạn. Khả năng chịu hạn cao hơn của giống ILC482 có thể, hoặc ít nhất một phần là do nhiều gen CaNAC tăng mức độ biểu hiện hơn và ít gen giảm mức độ biểu hiện hơn trong cả mô lá và rễ của giống ILC482 so với Hashem. Ngoài ra, khi so sánh đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC trong lá và rễ của giống đậu gà ILC482 và Hashem cho thấy các đặc trưng biểu hiện đáp ứng với xử lý mất nước là khác nhau, điều này chỉ ra rằng sự biểu hiện 4