Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN của một số nguồn gen cây trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống

Chia sẻ: Chuheodethuong 09 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:236

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài luận án “Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN của một số nguồn gen cây trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống” được thực hiện để xây dựng bộ mã vạch ADN từ đó trợ giúp cho công tác phân loại, nhận dạng được nguồn gen cây ăn quả có giá trị kinh tế gồm bưởi, chuối, nhãn và vải.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN của một số nguồn gen cây trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÃ VẠCH ADN CỦA MỘT SỐ NGUỒN GEN CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ NHẰM PHỤC VỤ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP 1 Hà Nội - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÃ VẠCH ADN CỦA MỘT SỐ NGUỒN GEN CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ NHẰM PHỤC VỤ CÔNG TÁC BẢO TỒN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 9620111 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy 2. PGS.TS. Lã Tuấn Nghĩa Hà Nội - 2020 2
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Hà Nội, ngày… tháng… năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Thị Ngọc Lan i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Thủy; Phó Giáo sư, Tiến Sĩ Lã Tuấn Nghĩa đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Đa dạng sinh học - Trung tâm Tài nguyên thực vật, Bộ môn Đột biến và ưu thế lai - Viện Di truyền nông nghiệp đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn nhóm tác giả thực hiện đề tài “Xây dựng tiêu bản ADN (DNA barcode) cho các cây trồng đặc hữu có giá trị kinh tế của Việt Nam” và đặc biệt là Tiến sĩ Nguyễn Thị Lan Hoa - chủ nhiệm đề tài đã tạo mọi điều kiện hướng dẫn và cho phép tôi thực hiện thí nghiệm cũng như sử dụng các kết quả, số liệu trong đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Di truyền nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ngọc Lan ii
MỤC LỤC Mục Trang LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. vii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................x DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ xii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ....................................................1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ......................................2 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ....................................................................................2 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.....................................................3 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN .............................3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4 1.1. CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ CÔNG TÁC BẢO TỒN, CHỌN TẠO GIỐNG .............................................................................................................4 1.1.1. Các đối tượng nghiên cứu .................................................................................4 1.1.1.1. Cây bưởi .........................................................................................................4 1.1.1.2. Cây chuối .......................................................................................................6 1.1.1.3. Cây nhãn ......................................................................................................10 1.1.1.4. Cây vải .........................................................................................................12 1.1.2. Công tác bảo tồn và chọn tạo giống ................................................................16 1.2. NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ......20 1.3. KHÁI NIỆM VỀ MÃ VẠCH ADN VÀ HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI ................................................................................................23 1.3.1. Khái niệm về mã vạch ADN ...........................................................................23 1.3.2. Các gen được sử dụng xây dựng hệ thống mã vạch ADN phổ biến ...............25 iii
1.3.3. Hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới được sử dụng cho mã vạch ADN mở rộng............................................................................................................................27 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG MÃ VẠCH ADN ...............30 1.4.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng mã vạch ADN trên thế giới.....................30 1.4.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng mã vạch ADN ở Việt Nam .....................34 1.4.3. Một số kết quả ứng dụng mã vạch ADN trong công tác bảo tồn và chọn tạo giống ..........................................................................................................................37 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .39 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .............................................................................39 2.1.1. Các nguồn gen nghiên cứu ..............................................................................39 2.1.2. Các chỉ thị phân tử ..........................................................................................44 2.1.3. Các bộ kit và mồi dùng cho giải trình tự GBS ................................................46 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................47 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................48 2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN .........................................................................48 2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị EST-SSR, SCoT ........48 2.3.3. Phương pháp xây dựng mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen rbcL và matK ..........................................................................................................................49 2.3.4. Phương pháp xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa trên SNP bằng công nghệ GBS ...........................................................................................................................51 2.4. PHẦN MỀM XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................53 2.5. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU................................................53 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..............................54 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ LỰA CHỌN MẪU ĐẠI DIỆN CÁC NGUỒN GEN NGHIÊN CỨU BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ.....................54 3.1.1. Đánh giá đa dạng di truyền và lựa chọn mẫu đại diện các giống bưởi bằng chỉ thị EST-SSR ..............................................................................................................54 3.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền và lựa chọn mẫu đại diện nguồn gen chuối, nhãn, vải bằng chỉ thị SCoT ................................................................................................58 iv
3.2. XÂY DỰNG MÃ VẠCH ADN DỰA TRÊN TRÌNH TỰ VÙNG GEN rbcL CHO MỘT SỐ NGUỒN GEN NGHIÊN CỨU ....................................................68 3.2.1. Xây dựng mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen rbcL của các giống bưởi đại diện ......................................................................................................................72 3.2.2. Phân tích mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen rbcL của các giống chuối đại diện ......................................................................................................................76 3.2.3. Phân tích mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen rbcL của các giống nhãn đại diện ......................................................................................................................79 3.2.4. Phân tích mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen rbcL của các giống vải đại diện ............................................................................................................................82 3.3. XÂY DỰNG MÃ VẠCH ADN DỰA TRÊN VÙNG GEN MATK CHO MỘT SỐ NGUỒN GEN NGHIÊN CỨU ..............................................................85 3.3.1. Phân tích mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen matK của các giống bưởi đại diện ......................................................................................................................88 3.3.2. Phân tích mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen matK của các giống chuối đại diện ......................................................................................................................92 3.3.3. Phân tích mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen matK của các giống nhãn đại diện ......................................................................................................................95 3.3.4. Phân tích mã vạch ADN dựa trên trình tự vùng gen matK của các giống vải đại diện ......................................................................................................................99 3.4. XÂY DỰNG MÃ VẠCH ADN MỞ RỘNG DỰA TRÊN SNP BẰNG CÔNG NGHỆ GBS CHO MỘT SỐ NGUỒN GEN NGHIÊN CỨU ...............102 3.4.1. Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa trên SNP bằng công nghệ GBS cho các giống bưởi nghiên cứu ......................................................................................102 3.4.2. Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa trên SNP bằng công nghệ GBS cho các giống nhãn nghiên cứu ......................................................................................113 3.4.3. Xây dựng mã vạch ADN mở rộng dựa trên SNP bằng công nghệ GBS cho các giống vải nghiên cứu.........................................................................................122 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................134 1. KẾT LUẬN ........................................................................................................134 v
2. ĐỀ NGHỊ............................................................................................................135 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ..................................................136 LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..............................................................................136 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................137 I. Tài liệu tham khảo Tiếng Việt ..........................................................................137 II. Tài liệu tham khảo Tiếng Anh ........................................................................145 III. Các website tham khảo ..................................................................................160 PHỤ LỤC BẢNG SỐ LIỆU .................................................................................162 PHỤ LỤC HÌNH ...................................................................................................213 vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt A, C, G, T Adenine, Cytosine, Guanine, Thyamine ADN Acid Deoxyribo Nucleic Axít Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic Axít ribonucleic Barcode Barcode Mã vạch BOLD Barcode of life data system Tổ chức hệ thống dữ liệu mã vạch sống bp Base pair Cặp bazơ CAQMN Cây ăn quả miền Nam cDNA Complementary DNA ADN bổ trợ CIAT The International Center for Trung tâm Nghiên cứu Nông Tropical Agriculture nghiệp Nhiệt đới Quốc tế cpDNA Chloroplast DNA ADN lục lạp CO1 Cytochrome C oxidase 1 CO1 cs Cộng sự DDBJ DNA Data bank of Japan Ngân hàng cơ sở dữ liệu ADN của Nhật Bản DHT Dị hợp tử EMBL The European Molecular Biology Cơ sở dữ liệu của Châu Âu về Laboratory sinh học phân tử enzyme ennzyme enzym EST Expressed Sequence Tag Đoạn trình tự biểu hiện (là một đoạn trình tự ngắn của một chuỗi cDNA) FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông lương Liên Hiệp of the United Nations Quốc FAOSTAT FAO’s statistical Số liệu thống kê của Tổ chức vii
Nông lương Liên hiệp quốc GBS Genotyping By Sequencing Phân tích kiểu gen bằng giải trình tự GDP Gross Domestic Product Tổng sản phẩm quốc nội IBPGR International Board for Plant Ủy ban Quốc tế về nguồn gen Genetic Resources cây trồng ID Identification Nhận dạng ISSR Internal Simple Senquence Repeats Chuỗi lặp lại đơn giản giữa ITS Internal Transcribed Spacer Vùng đệm trong được sao mã KHKT NLN Khoa học kỹ thuật Nông lâm MNPB nghiệp miền núi phía Bắc MatK Maturase K MatK NCBI National Center for Biotechnology Trung tâm thông tin Công nghệ Information Sinh học Quốc gia NC Nghiên cứu cây ăn quả miền CAQMN Nam NCRQ Nghiên cứu rau quả nDNA Nuclear DNA ADN nằm trong nhân NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới NHGRI National Human Genome Research Viện nghiên cứu hệ gen người Institute Quốc gia NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn NST Nhiễm sắc thể PIC Polymorphism Information content Hệ số đa dạng gen PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trung hợp RAPD Random amplified polymorphic ADN đa hình được nhân bản DNA ngẫu nhiên RbcL Ribulose-1,5-bisphosphate rbcL viii
carboxylase rDNA Recombinant DNA ADN tái tổ hợp SBL Sequencing By Ligation Giải trình tự bằng gắn nối SBS Sequencing By Synthesis Giải trình tự bằng tổng hợp SCoT Start Codon Targeted SCoT SNP Single Nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotit SSRs Simple Sequence Repeats Các chuỗi lặp lại đơn giản STS Sequence tagged sites Vị trí chuỗi đánh dấu USD United States dollar Đô la Mỹ USDA United States Department of Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ Agriculture ix
DANH MỤC BẢNG TT Bảng Tên Bảng Trang Bảng 2.1. Danh sách các giống bưởi nghiên cứu ......................................................39 Bảng 2.2. Danh sách các giống chuối nghiên cứu ....................................................40 Bảng 2.3. Danh sách các giống nhãn nghiên cứu .....................................................41 Bảng 2.4. Danh sách các giống vải nghiên cứu ........................................................43 Bảng 2.5. Danh sách các cặp mồi EST-SSR được sử dụng cho nghiên cứu ............44 Bảng 2.6. Danh sách các chỉ thị SCoT sử dụng trong nghiên cứu............................45 Bảng 2.7. Danh sách mồi khuếch đại vùng gen rbcL và matK .................................46 Bảng 2.8. Danh sách mồi cho thí nghiệm GBS ........................................................46 Bảng 2.9. Danh sách oligo barcode bố trí cho thí nghiệm GBS ...............................47 Bảng 3.1. Các alen đặc trưng của giống bưởi nghiên cứu bằng chỉ thị EST-SSR ....54 Bảng 3.2. Tổng số alen và alen đặc trưng theo từng locut của các nguồn gen chuối, nhãn, vải được phân tích bằng chỉ thị SCoT .............................................................58 Bảng 3.3. Bảng mã một số vị trí có sự khác biệt alen trong vùng gen rbcL của các nguồn gen nghiên cứu ...............................................................................................71 Bảng 3.4. Bảng mã một số vị trí có sự khác biệt alen trong vùng gen matK của các nguồn gen nghiên cứu ...............................................................................................87 Bảng 3.5. Kết quả lắp ráp các trình tự của các giống bưởi nghiên cứu ..................103 Bảng 3.6. Kết quả tập hợp bản đồ lắp ráp của các trình tự bưởi nghiên cứu ..........105 Bảng 3.7. Số lượng SNP đặc trưng nhận dạng cho từng giống bưởi nghiên cứu ...106 Bảng 3.8. Một số mã vạch ADN dựa trên SNP đặc trưng của các giống bưởi nghiên cứu ...........................................................................................................................107 Bảng 3.9. Ma trận khoảng cách di truyền của các giống bưởi nghiên cứu .............111 Bảng 3.10. Kết quả lắp ráp các trình tự của các giống nhãn nghiên cứu ................114 Bảng 3.11. Kết quả tập hợp bản đồ lắp ráp của các trình tự nhãn nghiên cứu .......116 Bảng 3.12. Một số mã vạch ADN dựa trên SNP đặc trưng của các giống nhãn nghiên cứu ...............................................................................................................117 Bảng 3.13. Ma trận khoảng cách di truyền của các giống nhãn nghiên cứu ..........119 x
Bảng 3.14. Kết quả lắp ráp của trình tự của các giống vải nghiên cứu ..................123 Bảng 3.15. Kết quả tập hợp bản đồ lắp ráp của các trình tự vải nghiên cứu ..........125 Bảng 3.16. Một số mã vạch ADN dựa trên SNP đặc trưng của các giống vải nghiên cứu ...........................................................................................................................126 Bảng 3.17. Số lượng SNP nhận dạng cho từng giống vải nghiên cứu ....................127 Bảng 3.18. Ma trận khoảng cách di truyền giữa các giống vải nghiên cứu ............129 Bảng 3.19. Tỷ lệ dị hợp tử của các giống vải nghiên cứu .......................................130 xi
DANH MỤC HÌNH TT Hình Tên Hình Trang Hình 2.1. Sơ đồ tiếp cận hướng nghiên cứu ..............................................................48 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình các bước chính chuẩn bị thư viện GBS cho NGS ...........51 Hình 3.1. Khảo sát các giống bưởi của chỉ thị CgEMS-31, CgEMS-36, CgEMS-138 và CgEMS-139 ..........................................................................................................55 Hình 3.2. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của các giống bưởi nghiên cứu .............................................................................................................................56 Hình 3.3. Khảo sát các giống chuối nghiên cứu của chỉ thị SCoT4, SCoT9 và SCoT17......................................................................................................................60 Hình 3.4. Khảo sát các giống nhãn nghiên cứu của chỉ thị SCoT23 và SCoT27 .....61 Hình 3.5. Khảo sát các giống vải nghiên cứu tại chỉ thị SCoT17 và SCoT34 ..........62 Hình 3. . Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của các giống chuối nghiên cứu .................................................................................................................63 Hình 3. . Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của các giống nhãn nghiên cứu .................................................................................................................65 Hình 3.8. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của các giống vải nghiên cứu .............................................................................................................................67 Hình 3.9. Khuếch đại gen rbcL bằng cặp mồi RbcLa-F/724R của các nguồn gen bưởi, chuối, nhãn và vải nghiên cứu .........................................................................69 Hình 3.10. So sánh và cây phân loại trình tự gen rbcL của các nguồn gen nghiên cứu và trình tự tham khảo .........................................................................................70 Hình 3.11. Trình tự gen rbcL của các giống bưởi nghiên cứu ..................................72 Hình 3.12. Cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL của các giống bưởi .....................73 Hình 3.13. Cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL của các giống bưởi nghiên cứu và trình tự tham khảo trong họ Rutaceae .......................................................................75 Hình 3.14. Trình tự gen rbcL của các giống chuối nghiên cứu ................................76 Hình 3.15. Cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL của các giống chuối ...................77 xii
Hình 3.16. Cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL của các giống chuối nghiên cứu và trình tự tham khảo trong họ Musaceae ......................................................................78 Hình 3.17. So sánh trình tự gen rbcL của các giống nhãn đại diện ..........................79 Hình 3.18. Cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL của các giống nhãn ....................80 Hình 3.19. Cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL của các giống nhãn nghiên cứu đại diện với các trình tự tham khảo .................................................................................81 Hình 3.20. So sánh trình tự gen rbcL của giống vải nghiên cứu ..............................82 Hình 3.21. Cây phân loại dựa trên đoạn gen rbcL của các giống vải nghiên cứu ....83 Hình 3.22. Khuếch đại gen matK bằng cặp mồi Kim3F/1R của các nguồn gen bưởi, chuối, nhãn và vải nghiên cứu...................................................................................85 Hình 3.23. So sánh và cây phân loại trình tự gen matK của .....................................86 các nguồn gen nghiên cứu và trình tự tham khảo .....................................................86 Hình 3.24. Trình tự của mã vạch matK các giống bưởi nghiên cứu .........................89 Hình 3.25. Cây phân loại dựa trên đoạn gen matK của các giống bưởi nghiên cứu ...90 Hình 3.26. Cây phân loại dựa trên đoạn gen matK của các giống bưởi nghiên cứu đại diện và trình tự tham khảo trong chi Citrus ........................................................91 Hình 3.27. So sánh trình tự gen matK của các giống chuối nghiên cứu ...................92 Hình 3.28. Cây phân loại dựa trên đoạn matK của các giống chuối nghiên cứu ......94 Hình 3.29. So sánh trình tự gen matK của các giống nhãn nghiên cứu ....................95 Hình 3.30. Cây phân loại dựa trên đoạn gen matK của các giống nhãn ...................97 Hình 3.31. Cây phân loại dựa trên đoạn gen matK của các giống nhãn nghiên cứu đại diện và trình tự nhãn tham chiếu .........................................................................98 Hình 3.32. Cây phân loại dựa trên đoạn gen matK của các giống vải ......................99 Hình 3.33. Cây phân loại dựa trên đoạn gen matK của các giống vải nghiên cứu .100 Hình 3.34. Kết quả lắp ráp trình tự các giống bưởi nghiên cứu..............................104 Hình 3.35. Phân tích cấu trúc quần thể các giống bưởi tại các locut SNP (K = 6) bằng phần mềm STRUCTURE ...............................................................................112 Hình 3.36. Kết quả lắp ráp trình tự các giống nhãn nghiên cứu .............................115 Hình 3.37. Phân tích cấu trúc quần thể của các giống nhãn tại các locut SNP .......121 (K = 9) bằng phần mềm STRUCTURE ..................................................................121 xiii
Hình 3.38. Kết quả lắp ráp trình tự các giống vải nghiên cứu ................................124 Hình 3.39. Phân tích cấu trúc quần thể của các nguồn gen vải tại các locut SNP (K = 3) bằng phần mềm STRUCTURE ..........................................................................131 xiv
MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Các tỉnh miền bắc Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, cùng sự phân hóa của độ cao địa hình tạo nên những tiểu vùng sinh thái đa dạng, có thể phát triển nhiều loại cây ăn quả có nguồn gốc nhiệt đới như chuối, dứa, xoài, á nhiệt đới như vải, nhãn, hồng, cây ăn quả có múi (cam, quýt, bưởi) và một số cây ăn quả ôn đới như lê, đào, mận, mơ. Cho đến nay, nước ta đã hình thành các vùng cây ăn quả hàng hóa tập trung quy mô lớn như: vải thiều ở các tỉnh Bắc Giang, Hải Dương; nhãn lồng ở Hưng Yên, Sơn La; bưởi ở Hà Nội, Phú Thọ, Bắc Giang; chuối ở Hưng Yên, Phú Thọ; na ở Lạng Sơn, Quảng Ninh; xoài ở Sơn La; mận ở Lào Cai và Sơn La. Các vùng trồng cây ăn quả đã góp phần tạo ra các sản phẩm đa dạng phục vụ tiêu dùng và xuất khẩu. Trong đó, bốn loại cây ăn quả có diện tích và sản lượng lớn nhất theo thống kê của Cục Trồng trọt - Bộ Nông nghiệp & PTNT là chuối (63870 ha), vải (58876 ha), nhãn (395 0 ha) và bưởi (34286 ha). Bảo tồn, lưu giữ và khai thác nguồn gen có ý nghĩa vô cùng quan trọng, cung cấp nguồn nguyên liệu khởi đầu phục vụ công tác nghiên cứu khoa học, cải tạo giống, duy trì đa dạng sinh học. Hiện nay, việc duy trì khai thác và phát triển các nguồn gen cây trồng đặc sản một cách hiệu quả và bền vững đang là xu hướng chung của nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Phương pháp phân loại thực vật truyền thống thường sử dụng những đặc điểm hình thái hoặc các đặc tính sinh lý, sinh hóa để mô tả và giúp nhận dạng giống. Tuy nhiên phương pháp này còn gặp nhiều khó khăn như mẫu vật chưa phát triển đầy đủ hoặc bị hư hỏng. Ngoài ra, việc thu thập đánh giá còn tốn thời gian, chịu tác động của điều kiện môi trường vì thế dễ gặp sai số trong phân tích số liệu. Trong thời gian gần đây, mã vạch ADN (DNA barcode) đã được sử dụng như một công cụ bổ sung trong công tác nhận dạng sinh vật. Các nhà phân loại học phân tử đã sử dụng mã vạch ADN thông qua việc xác định các trình tự đặc trưng và 1
dùng chúng để nhận biết các mẫu vật. Phương pháp này có thể áp dụng cho các đối tượng khác nhau từ động vật, thực vật cho tới vi sinh vật…. Sử dụng mã vạch ADN là phương pháp chính xác và nhanh chóng giúp nhận dạng sinh vật ở giai đoạn sớm; bộ dữ liệu thu được, kết quả phân tích, so sánh sẽ được lưu giữ đơn giản. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN của một số nguồn gen cây trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Đề tài luận án “Nghiên cứu xây dựng mã vạch ADN của một số nguồn gen cây trồng có giá trị kinh tế nhằm phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống” được thực hiện để xây dựng bộ mã vạch ADN từ đó trợ giúp cho công tác phân loại, nhận dạng được nguồn gen cây ăn quả có giá trị kinh tế gồm bưởi, chuối, nhãn và vải. Những mục tiêu cụ thể của đề tài luận án như sau: Lựa chọn được mẫu đại diện nguồn gen bưởi, chuối, nhãn và vải bằng chỉ thị phân tử EST-SSR/ SCoT để tiến hành xây dựng mã vạch ADN; Khuếch đại và giải trình tự được vùng gen lục lạp rbcL, matK để đánh giá đa dạng di truyền, từ đó xây dựng mã vạch ADN cho nguồn gen bưởi, chuối, nhãn và vải; Thiết lập được dữ liệu SNP bằng công nghệ GBS để xây dựng mã vạch ADN mở rộng các nguồn gen nghiên cứu. 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Trên cơ sở kế thừa các thông tin tư liệu, kết quả thu thập, lưu giữ, bảo tồn các nguồn gen tại ngân hàng gen cây trồng Quốc gia, đề tài luận án đã lựa chọn được một số giống/nguồn gen cây trồng (bưởi, chuối, nhãn, vải) có giá trị kinh tế cao. Đây hầu hết là những giống đặc sản, nổi tiếng về phẩm chất, chất lượng tại các địa phương, phần lớn đã và đang được làm hồ sơ bảo hộ giống để khai thác phát triển và nằm trong danh mục cây trồng quý hiếm đang được lưu giữ tại Trung tâm Tài nguyên thực vật; 2
Đề tài luận án được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Tài nguyên thực vật (An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội). 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Việc nhận dạng được một số giống cây ăn quả đặc sản (bưởi, chuối, nhãn, vải) của Việt Nam bằng mã vạch ADN có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo hộ thương hiệu cây ăn quả của nước ta. Luận án là công trình nghiên cứu công phu, bài bản sử dụng bộ chỉ thị phân tử EST-SSR/ SCoT để đánh giá đa dạng giống cây ăn quả đặc sản của Việt Nam (bưởi, chuối, nhãn, vải), hỗ trợ công tác định danh loài, có thể sử dụng để phân loại sớm và ứng dụng trong chọn giống cây trồng ở nước ta. 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Công trình nghiên cứu đã tạo ra cơ sở dữ liệu về phân loại phân tử của một số cây trồng đặc sản bao gồm bưởi, chuối, nhãn, vải trồng tại Việt Nam, góp phần bảo tồn, lưu giữ và phát triển nguồn gen địa phương. Kết quả của luận án cung cấp thông tin nhận dạng giống cây trồng bản địa phục vụ công tác bảo hộ giống cây trồng đặc sản địa phương. Kết quả của luận án là cơ sở khoa học cho việc xác định nguồn vật liệu trong chọn giống (bưởi, chuối, nhãn, vải), góp phần giải quyết những tranh chấp về thương hiệu giống cây ăn quả đặc sản, đồng thời phục vụ công tác bảo hộ, chỉ dẫn địa lý, phục tráng, phát triển sản phẩm đặc hữu gắn với vùng miền địa phương trên cả nước. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ CÔNG TÁC BẢO TỒN, CHỌN TẠO GIỐNG 1.1.1. Các đối tượng nghiên cứu 1.1.1.1. Cây bưởi Cây bưởi có tên khoa học là Citrus maxima (Burm.) Merr. hay Citrus grandis L. Osbeck, nằm trong hệ thống phân loại thực vật sau đây: Thuộc Ngành: Hạt kín Angiospermae Thuộc Lớp: Hai lá mầm (Ngọc Lan) Dicotyledonae (Magnoliopsida) Thuộc Bộ: Bồ Hòn Sapindales Thuộc Họ: Cam Rutaceae Thuộc Họ phụ: Aurantioideae Thuộc Chi: Cam Citrus Loài: Bưởi Citrus maxima Chi Citrus là một chi lớn nằm trong họ Rutaceae. Họ này có 150 chi và 2000 loài, phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta hiện biết được 23 chi và 105 loài (Phạm Hoàng Hộ, 2000). Theo sơ đồ phân loại cây có múi của Swingle (1948) thì có hai loài bưởi khác nhau trong chi Citrus là bưởi Citrus grandis L. Osbeck (ở miền Bắc nước ta có bưởi Phúc Trạch - Hà Tĩnh, bưởi Đoan Hùng - Phú Thọ, bưởi Thanh Trà - Huế, bưởi Phú Diễn - Hà Nội..., ở các tỉnh phía Nam có bưởi Ổi, bưởi Năm Roi, bưởi Da xanh…) và bưởi chùm Citrus paradisi Macf. (ở nước ta chỉ mới có vài giống nhập nội) (Vũ Công Hậu, 1996; Phạm Văn Duệ, 2005; Nguyễn Hữu Thọ, 2015). Hàng năm trên thế giới vẫn sản xuất cả hai loại bưởi chùm và bưởi, chiếm 5,4 - 5,6% tổng sản lượng cây có múi, trong đó chủ yếu là bưởi chùm (chiếm 2/3 sản lượng). Sản xuất bưởi chùm chủ yếu tập trung ở các nước châu Mỹ, châu Âu và được dùng cho chế biến nước quả. Bưởi chủ yếu được sản xuất ở các nước châu Á, tập trung nhiều ở một số nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Việt Nam… được sử dụng để ăn tươi là chủ yếu (Lương Thị Kim Oanh, 2011). Theo số liệu 4