Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:147

Thêm vào BST

Báo xấu

55
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là tạo được các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại vào khoai tây trồng, sau đó lai trở lại (backcross) với khoai tây trồng nhằm tạo được nguồn vật liệu di truyền khoai tây kháng bệnh mốc sương.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƢƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62 62 01 11 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Nguyễn Quang Thạch 2. TS. Ramona Thieme HÀ NỘI – 2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận án Hoàng Thị Giang i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Quang Thạch – Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian, tâm huyết và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Ramona Thieme, TS. Thilo Hammann – Viện Nghiên cứu Chọn tạo Giống Cây trồng (Viện JKI)- CHLB Đức, là những ngƣời thầy đã tận tình luôn tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Di truyền và Chọn giống cây trồng, Khoa Nông học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Sinh học Nông nghiệp, đặc biệt là các cán bộ Phòng Sinh học phân tử & Công nghệ vi sinh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày... tháng... năm 20... Nghiên cứu sinh Hoàng Thị Giang ii
MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 3 1.3 Phạm vi nghiên cứu 3 1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3 1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 5 2.2 Nguồn gen khoai tây dại và tình hình khai khác nguồn gen khoai tây dại 7 2.2.1 Vai trò của nguồn gen kháng bệnh trên cây khoai tây 7 2.2.2 Tình hình khai thác nguồn gen kháng bệnh trong chọn tạo giống khoai tây 8 2.3 Cơ sở khoa học của phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 10 2.3.1 Tách tế bào trần 10 2.3.2 Nuôi cấy tế bào trần 11 2.3.3 Tái sinh tế bào trần 12 2.3.4 Dung hợp tế bào trần 13 2.3.5 Chọn lọc các con lai soma 14 2.4 Bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây 15 2.4.1 Giới thiệu về bệnh mốc sƣơng 15 2.4.2 Đặc điểm xâm nhiễm của nấm P. infestans 17 2.4.3 Cơ sở phân tử của tính kháng bệnh mốc sƣơng do nấm P. infestans gây ra 18 iii
2.4.4 Các nghiên cứu về gen kháng bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây 20 2.5 Các phƣơng pháp chọn tạo giống khoai tây 23 2.5.1 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống 23 2.5.2 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen 23 2.5.3 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 24 PHẦN 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 30 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 30 3.1.2 Thời gian nghiên cứu 30 3.2 Vật liệu nghiên cứu 30 3.2.1 Vật liệu thực vật 30 3.2.2 Hóa chất 31 3.2.3 Thiết bị 32 3.3 Nội dung nghiên cứu 32 3.3.1 Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 32 3.3.2 Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp xác định độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 33 3.3.3 Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và các đặc tính nông sinh học 33 3.3.4 Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 34 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.4.1 Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 34 3.4.2 Xác định con lai soma bằng đo độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 38 3.4.3 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 39 3.4.4 Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc 43 3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44 iv
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Kết quả 45 4.1.1 Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 45 4.1.2 Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập đƣợc 48 4.1.3 Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 51 4.1.4 Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 55 4.1.5 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 58 4.1.6 Nghiên cứu tạo con lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng 73 4.2 Thảo luận 84 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 5.1 Kết luận 91 5.2 Kiến nghị 92 Danh mục các công trình công bố 93 Tài liệu tham khảo 94 Phụ lục 104 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : 6-benzyl amino purine BC : Backcross CNSH : Công nghệ sinh học CT : Công thức CV : Coefficient of variation DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme linked imunosorbent assay DNA : Deoxyribonucleic acid ELISA : Enzyme – linked imunosorbent assay FAO : Food and Agriculture Organization GA3 : Gibberellic Acid IAA : Indole-3-acetic acid JKI : Julius Kuehn Institute KLCTB : Khối lƣợng củ trung bình LSD : Least significant difference MS : Murashige and Skoog NAA : Naphthaleneacetic acid NSLT : Năng suất lý thuyết NSTT : Năng suất thực thu OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction PEG : Polyethylene glycol PVX : Potato virus X PVY : Potato virus Y RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA SAS : Statistical Analysis Systems SH : Somatic hybrid SSR : Simple sequence repeat Tm : Nhiệt độ gắn mồi UV : Ultra violet vi
DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Năng suất và năng lƣợng của một số cây lƣơng thực ở các nƣớc đang phát triển 5 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới năm 2013 6 2.3 Tốp 10 quốc gia có sản lƣợng khoai tây lớn nhất thế giới 6 2.4 Diện tích, năng suất và sản lƣợng khoai tây của Việt Nam giai đoạn 2006 - 2013 7 2.5 Tổng kết về kết quả đánh giá tính kháng của các loài khoai tây dại chính đối với một số loại sâu, bệnh hại trên cây khoai tây và chống chịu với các điều kiện bất thuận của môi trƣờng 8 3.1 Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma 31 3.2 Các mồi sử dụng để chọn lọc con lai 32 3.3 Các cặp mồi phát hiện gen kháng mốc sƣơng 32 4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ macerozym và cellulase trong dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế bào trần của các dòng/giống khoai tây thí nghiệm 45 4.2 Ảnh hƣởng của thời gian ủ của mô lá trong dung dịch enzym đến hiệu suất tế bào trần thu đƣợc 47 4.3 Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung hợp (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat) 48 4.4 Kết quả tái sinh và độ bội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật độ tế bào dung hợp khác nhau (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat) 50 4.5 Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội bằng phƣơng pháp xung điện 51 4.6 Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau 52 4.7 Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau 53 vii
4.8 Ảnh hƣởng của môi trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai 54 4.9 Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp 55 4.10 Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai sau dung hợp 56 4.11 Kết quả chọn lọc con lai soma bằng phân tích độ bội và chỉ thị phân tử SSR 58 4.12 Đặc điểm hình thái của nấm P. infestans trong quá trình nuôi cấy 59 4.13 Phản ứng của một số giống khoai tây với 2 mẫu mốc sƣơng thu thập từ Hà Nội và Lạng Sơn 59 4.14 Kết quả đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời 61 4.15 Kết quả đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (tuber slice test) 63 4.16 Kết quả đánh giá các con lai soma và các dòng bố mẹ về khả năng kháng bệnh mốc sƣơng trên đồng ruộng và đánh giá sự thành thục của cây 64 4.17 Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các dòng/giống khoai tây bố mẹ và con lai soma 68 4.18 Đánh giá các tính trạng trên củ của các con lai soma và các dòng bố mẹ 70 4.19 Kết quả lai lai trở lại giữa các con lai soma với giống khoai tây trồng làm bố 74 4.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai BC1 ở giai đoạn cây con 75 4.21-A Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các con lai BC. 78 4.21-B Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các con lai BC 79 4.22 Kết quả đánh giá năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của cá con lai BC1 80 viii
DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 3.1 Các loài khoai tây dại nhị bội đƣợc trồng trong nhà kính để phục vụ thí nghiệm 30 4.1 Hình ảnh tế bào trần của các dòng/giống khoai tây khác nhau với các enzym phù hợp. 46 4.2 Chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở các tần số và số lần xung khác nhau. 48 4.3 Các macrocallus tái sinh sau khi dung hợp 51 4.4 Sự phân chia của tổ hợp lai trn3G + Delikat trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau sau 4 ngày nuôi cấy 52 4.5 Khả năng tái sinh chồi của tổ hợp lai trn + Rasant sau 12 tuần trên môi trƣờng khác nhau 55 4.6 Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây bố mẹ và con lai 56 4.7 Kết quả phân tích SSR với chỉ thị phân tử STIIKA của tổ hợp lai trn 3G + cv.Rasant. 57 4.8 Kết quả phân tích SSR với chỉ thị phân tử STM2022 của tổ hợp lai trn 3G + cv.Rasant 57 4.9 Bọc động bào tử và cành bọc động bào tử của nấm mốc sƣơng 59 4.10 So sánh tính độc của 2 nguồn nấm bệnh phân lập từ Hà Nội và Lạng Sơn 60 4.11 Sự biểu hiện vết bệnh trên lá sau 6 ngày lây nhiễm 62 4.12 Sự biểu hiện tính kháng trên đồng ruộng của con lai soma blb2G + Delikat (SH2283/5) 65 4.13- A Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 1/1’ 66 4.13-B Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb1 66 4.13-C Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb3 67 4.14 Các đặc tính hình thái, sinh trƣởng và đặc điểm ra hoa của các con lai soma (2283/5/1; 2281/10, 2292/4, 2295/1) của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat so với các dòng/giống bố mẹ (Delikat, S.bulbocastanum) 71 4.15-A Các biến dị về hình thái, kiểu sinh trƣởng của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai 72 4.15- B Các biến dị về dạng lá của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai 72 ix
4.15- C Các biến dị về dạng hoa của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai Delikat (+) trn3G 73 4.15- D Các biến dị về dạng củ của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai Rasant (+) trn3G 73 4.16 Một số tổ hợp lai backcross thành công 74 4.17 Cây con sau gieo hạt 10 ngày 75 4.18 Kết quả phân tích độ bội của các con lai BC1 76 4.19 Sự đa dạng kiểu hình của các con lai BC1 của tổ hợp lai Delikat + blb) SH2283/5 x Delikat 83 4.20 Dạng củ của: A- Atlantic; B- pnt2G; C- con lai soma pnt2G (+) Atlantic; D- BC1 của tổ hợp lai khoai tây của một số tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic với giống khoai tây trồng Atlantic 83 x
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Hoàng Thị Giang Tên Luận án: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sƣơng bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62 62 01 11 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài dại vào khoai tây trồng, sau đó lai trở lại (backcross) với khoai tây trồng nhằm tạo đƣợc nguồn vật liệu di truyền khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng. Phƣơng pháp nghiên cứu - Vật liệu nghiên cứu: Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sƣơng (Solanum bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế tại Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank); các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích nghi với điều kiện khí hậu ở Việt Nam - Nội dung và phương pháp nghiên cứu: (1) Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng theo Morller et al. (1992) và đƣợc cải tiến bởi Thieme et al. (1997, 2008); (2) xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội (Flow cytometry) theo (Thieme et al., 2008) và bằng chỉ thị phân tử SSR (theo Dinu and Thieme, 2001; Song et al., 2005); (3) đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo (theo Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) và bằng chỉ thị phân tử (theo Wang et al., 2008 và Lokossou et al., 2010); (4) lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc Kết quả chính - Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông xi
số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trƣờng nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để tạo callus và môi trƣờng RJM để tái sinh chồi. - Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.). Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh của Việt Nam. - Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo đƣợc 11 tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nƣớc ta. xii
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Hoang Thi Giang Thesis title: Study of interspecific somatic hybrids between wild potato species and potato cultivars via protoplast fusion for selection of late blight resistant potato Major: Genetics and Plant Breeding Code: 62 62 01 11 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives The aims of this study was to produce interspecific somatic hybrids and then to investigate the possibilities to incorporate late blight resistance from diploid wild potato species into tetraploid potato cultivars. These hybrids and progenies could be promising materials for breeding program of late blight resistant potato in Vietnam. Materials and Methods - Material: Late blight resistant wild-type potatoes (Solanum bulbocastanum, S. tarnii, S. Pinnatisectum) that come from the Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank, Germany); cultivated potatoes with promising agronomical traits in Vietnamese condition. - Methods: Protoplast fusion was conducted between late blight resistant wild- type potates (S. bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum) and potato cultivars (Solanum tuberosum L.). In the present study, protocols for protoplast isolation, fusion, and culture according to Morller and Wenzel (1992) and modified by Thieme et al. (1997, 2008) were used to obtain interspecific somatic hybrids. Flow cytometry (Dinu and Thieme, 2001) and single sequence repeat methods (Song Ye-Su et al., 2005) were ultilized to identify all the regenerated plants and selected interspecific somatic hybrids which were hexaploid (2n=6x=72). These interspecific somatic hybrids were assessed continuously resistance to late blight via detached leaflet assay, tuber slice test and field test (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) and molecular markers to find the presence of resistant genes Rpi-blb (Wang et al., 2008, Lokossou et al., 2010). In addition, backcrossing (backcross-BC) between the somatic hybrids and the cultivated potato varieties as the pollen donor to generate the BC1 progeny were conducted in the present study. xiii
Main findings and conclusions In the present study 1612 calluses from seven different fusion combinations were generated, of which 188 progeny plants were regenerated. Flow cytometry (Dinu and Thieme, 2001) and single sequence repeat methods (Song Ye-Su et al., 2005) were ultilized to identify all the regenerated plants and selected 69 interspecific somatic hybrids which were hexaploid (2n=6x=72). These interspecific somatic hybrids were assessed continuously resistance to late blight via detached leaflet assay, tuber slice test and molecular markers to find the presence of resistant genes Rpi-blb. Only somatic hybrid plants between S. bulbocastanum with Delikat exhibited resistance against late blight disease. Futhermore, Rpi-blb1 and Rpi-blb3 genes, which belong to resistant- related genes, Rpi-blb, were found in somatic hybrids of these combination. Moreover, these BC1 also exposed many precious agronomical characteristics of cultivated potatoes. These hybrids and progenies could be promising materials for breeding program of late blight resistant potato in Vietnam. xiv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Khoai tây là một trong bốn cây lƣơng thực quan trọng của loài ngƣời. Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, khoai tây bị nhiều tác nhân gây bệnh tấn công, ảnh hƣởng đáng kể tới năng suất. Trong các bệnh gây hại khoai tây, bệnh mốc sƣơng do Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây ra đƣợc coi là bệnh phổ biến và nguy hại nhất. Trong điều kiện thuận lợi bệnh có thể phát triển nhanh thành dịch, phá hủy toàn bộ mùa màng trong vòng một đến hai tuần lễ. Nhiều biện pháp đã đƣợc xây dựng và đề xuất để hạn chế tác hại của bệnh mốc sƣơng nhƣ sử dụng giống kháng bệnh và đặc biệt sử dụng các loại thuốc hoá học phòng chống bệnh mốc sƣơng. Trung tâm Khoai tây quốc tế (CIP) ƣớc lƣợng hàng năm Mỹ, châu Âu và các nƣớc đang pháp triển phải chi khoảng 1 tỉ đôla cho thuốc hóa học để kiểm soát bệnh mốc sƣơng (Anonymous, 1997). Việc sử dụng biện pháp phòng chống bệnh hại bằng thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi trƣờng vừa tăng chi phí sản xuất (Darsow et al., 2008) nhƣng vẫn không giảm thiệt hại hoàn toàn. Hơn nữa, nấm mốc sƣơng có tính di truyền khá linh động và thích ứng cao nên dễ kháng các loại thuốc hóa học. Chọn giống kháng bệnh mốc sƣơng đƣợc coi là một biện pháp hiệu quả, đặc biệt sau dịch bệnh mốc sƣơng gây ra nạn đói ở Ái-nhĩ-lan giữa thế kỷ 19 (1845-1846) và các dịch bệnh xảy ra vào nửa đầu thế kỷ 20 ở châu Âu. Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu thế kỷ 20 (những năm 1950 và 1960) tập trung vào việc sử dụng các gen trội (R còn gọi là gen Rpi) chính kháng mốc sƣơng từ loài hoang dại Solanum demissum và 11 gen R đƣợc chuyển vào khoai tây. Mặc dù gen kháng chính có hiệu quả cao, nhƣng tính kháng ở các giống mang gen kháng chính R nhanh chóng bị vƣợt qua vì nấm mốc sƣơng có khả năng thích nghi với cây kháng rất nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde, 2002). Tuy nhiên, nhiều chiến lƣợc khác nhau đƣợc xem xét để sử dụng các gen kháng nhằm tạo khả năng kháng đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al., 2009) và sử dụng các gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác nhau. Các gen kháng từ các nguồn khác nhau đƣợc tích tụ nhờ phƣơng pháp lai chuyển gen truyền thống và sử dụng chị thị phân tử (Tan et al., 2008, 2010). Các nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài khoai tây dại nhƣ Solanum pinnatisectum (pnt2G), Solanum tarnii (trn3G), Solanum bulbocastanum (blb2G) 1
(Thieme et al., 2008; Szczerbakowa et al., 2005), Solanum cardiophyllum (Thieme et al., 2010) mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng cao. Tuy nhiên, rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua con đƣờng lai hữu tính giữa các loài hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do cơ chế cách ly về sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể là sự khác biệt về số lƣợng nhiễm sắc thể và số cân bằng nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010). Để khắc phục rào cản lai này nhà chọn giống có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi. Dung hợp tế bào trần để tạo con lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa (Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen kháng vào khoai tây trồng. Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các tính trạng đơn gen và đa gen từ các loài hoang dại vào khoai tây nhƣng vẫn bảo toàn đƣợc hệ gen nhân và tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) và tạo ra nguồn vật liệu đa dạng mang mức kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Davey et al., 2005; Thieme et al., 2010). Các nhà nghiên cứu đã thu nhận đƣợc nhiều con lai soma kháng mốc sƣơng giữa khoai tây trồng với S. circaeifolium (Mattheij et al., 1992), S. pinnatisectum (Thieme et al., 1997), S. bulbocastunum (Helgeson et al., 1998), S. nigrum (Horsma et al., 2001), S. berthaultii (Bidani et al., 2007), S. tarnii (Thieme et al., 2008) và S. cardiophyllum (Thieme et al., 2010). Một số con lai soma giữa khoai tây với S. bulbocastunum (Helgeson et al., 1998), S. nigrum (Horsman et al., 2001), S. tarnii (Thieme et al., 2004, 2008) đã đƣợc lai lại với khoai tây trồng tạo vật liệu tiền chọn giống để khai thác trong các chƣơng trình chọn giống. Mặc dù quy trình lai soma ở thực vật, kể cả khoai tây đã đƣợc thiết lập, phƣơng pháp phân lập tế bào trần và tái sinh cây đối với các loài hoang dại từ Mexico chƣa đạt hiệu quả cao (Chen et al., 2006). Chen et al. (2006) cho rằng để ứng dụng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần hai tiêu chí phải thỏa mãn, đó là phải phân lập đƣợc số lƣợng tế bào trần đủ lớn và chúng có khả năng nhân và tái sinh thành cây mới. Nhìn chung, tế bào trần có thể phân lập dễ dàng từ mô lá thông qua xử lý emzym. Song các điều kiện phân lập phụ thuộc vào kiểu gen, thay đổi mạnh giữa các loài do sự khác nhau về thành phần của thành tế bào. Davis (1985) chỉ ra rằng các điều kiện khác nhau ảnh hƣởng tới năng suất và khả năng tái sinh của tế bào trần, do đó cần phải xác định pháp và điều kiện cụ thể cho từng loài. 2
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập tế bào trần từ ba loài khoai tây hoang dại S. pinnatisectum, S. tarnii và S. bulbocastanum (pnt2G, trn3G và blb2G) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và dung hợp với tế bào trần từ các giống khoai tây trồng tứ bội Delikat, Atlantic, Agave và Rasant, mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định đƣợc các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sƣơng và các giống khoai tây trồng mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng. Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sƣơng từ loài dại vào khoai tây trồng. Tạo đƣợc các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo đƣợc dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng ở Việt Nam. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trên cơ sở thu thập đƣợc nguồn vật liệu quý là các dòng khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình tách, dung hợp tạo các thể lai soma cải thiện đƣợc khả năng kháng bệnh mốc sƣơng đồng thời tổ hợp đƣợc những tính trạng quý từ khoai tây trồng. Trên nền đa dạng di truyền đã tạo ra, đánh giá, chọn lọc các thể lai soma có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng và mang các đặc tính nông sinh học phù hợp. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trƣờng nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để tạo callus và môi trƣờng RJM để tái sinh chồi. Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội 3
(2x) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta và Rasant) nhƣng có năng suất và chất lƣợng tốt. Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh của Việt Nam. Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo đƣợc 11 tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nƣớc ta. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Đây là một nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu về di truyền chọn giống cây trồng. Đề tài cũng là một bƣớc phát triển kỹ thuật cao của công nghệ tế bào thực vật (kỹ thuật dung hợp tế bào trần) trong tạo giống khoai tây. Các kết quả của đề tài có giá trị khoa học cả trong nƣớc và quốc tế. Đề tài đã góp phần chứng minh khả năng chuyển đƣợc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ các loài khoai tây dại sang các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần và ứng dụng thành công kết quả này trong chọn tạo các giống khoai tây trồng kháng các loại bệnh quan trọng. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đã chọn tạo đƣợc thành công 4 dòng con lai soma và khoai tây trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat là các dòng 13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11 có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng đồng thời có đặc điểm nông sinh học phù hợp. Đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chƣơng trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng ở Việt Nam. 4