Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:154

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học "Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B" trình bày các nội dung chính sau: Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân hemophilia B; Khảo sát để xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ sở để chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VŨ THỊ BÍCH HƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VŨ THỊ BÍCH HƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 9 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. DƯƠNG QUỐC CHÍNH Viện Huyết học – Truyền máu TW 2. PGS.TS.ĐỒNG VĂN QUYỀN Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2022
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi là Vũ Thị Bích Hường, nghiên cứu sinh khóa II, năm 2016, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của hai thầy TS. Dương Quốc Chính và PGS.TS. Đồng Văn Quyền. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày 9 tháng 8 năm 2022 Người viết cam đoan NCS. Vũ Thị Bích Hường
iii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Đảng Ủy, Ban Lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu TW đã cho phép tôi được dự tuyển, tham gia khóa đào tạo Tiến sĩ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Dương Quốc Chính, Phó trưởng bộ môn Huyết học – Truyền máu, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; Trưởng khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu TW, người Thầy đã định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu; hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất để tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Đồng Văn Quyền, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Thị Mai, Giám đốc Trung tâm hemophilia; các bác sỹ, điều dưỡng tại Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW; tập thể cán bộ khoa Tiếp nhận máu đã hợp tác và hỗ trợ tôi trong quá trình thu thập mẫu nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bệnh nhân hemophilia B, người nhà bệnh nhân và người hiến máu đã giúp đỡ để tôi có được các số liệu trong luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban giám đốc, Phòng đào tạo Học viện Khoa học và Công nghệ; Khoa Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. - Các thầy cô tham gia giảng dạy trong chuyên ngành Di truyền học, đã truyền đạt kiến thức quý báu cho tôi trong quá trình học tập.
iv - ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi để hoàn thành mọi thủ tục hành chính trong suốt quá trình học tập tại Học viện. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp yêu quý tại Khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW đã luôn sẵn sàng hỗ trợ, chia sẻ với tôi trong suốt quá trình thực hiên nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin chân thành biết ơn gia đình đã luôn ở bên tôi, cổ vũ, động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 9 tháng 8 năm 2022 Người viết cam đoan NCS. Vũ Thị Bích Hường
v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii MỤC LỤC ................................................................................................................. v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... viii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ ix DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. x DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 4 1.1. Tổng quan về bệnh hemophilia B .................................................................... 4 1.1.1. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B ......... 4 1.1.2. Khái quát về bệnh hemophilia B ...................................................................... 6 1.2. Cấu trúc và chức năng của yếu tố IX trong quá trình đông máu ............... 10 1.2.1. Các yếu tố đông máu ...................................................................................... 10 1.2.2. Vai trò của yếu tố IX trong quá trình đông máu ............................................ 11 1.2.3. Cấu trúc yếu tố IX và quá trình hoạt hóa yếu tố IX ....................................... 13 1.2.4. Mối tương tác giữa yếu tố IX với các nhân tố hoạt hóa và đồng yếu tố ........ 15 1.3. Phân tích di truyền bệnh hemophilia B ......................................................... 18 1.3.1. Vai trò của phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B .............................. 18 1.3.2. Đặc điểm đột biến trên gen F9 ....................................................................... 19 1.3.3. Đặc điểm các đa hình nucleotide liên kết với gen F9..................................... 27 1.4. Các kỹ thuật phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B ....................... 30 1.4.1. Kỹ thuật phân tích đột biến ............................................................................ 31 1.4.2. Kỹ thuật phân tích liên kết .......................................................................... 36 1.5. Tình hình nghiên cứu về các biến đổi di truyền trên gen F9 ....................... 38 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 38 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 42 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 45 2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 45 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 46 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................................ 46
vi 2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình nucleotide ........................ 46 2.2.3. Các bước nghiên cứu ...................................................................................... 46 2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu...................................................................... 50 2.3.1. Hóa chất .......................................................................................................... 50 2.3.2. Vật tư – Trang thiết bị .................................................................................... 51 2.4.1. Thu thập mẫu nghiên cứu ............................................................................ 52 2.4.2. Tách chiết ADN .............................................................................................. 52 2.4.3. Thiết kế các trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX ................... 52 2.4.4. Khuếch đại các phân đoạn a1-a8 bằng kỹ thuật Longrange PCR ................. 53 2.4.5. Tinh sạch sản phẩm Longrange PCR khuếch đại các vùng gen F9 ............... 54 2.4.7. Khẳng định kết quả giải trình tự gen F9 trên NGS ........................................ 55 2.4.8. Khẳng định các mất đoạn/lặp đoạn gen F9 bằng kỹ thuật MLPA ................. 56 2.4.9. Phân tích đột biến gen từ dữ liệu giải trình tự ................................................ 56 2.4.10. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 từ dữ liệu giải trình tự ................. 58 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 60 3.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ............................................................................... 60 3.1.2. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 61 3.2. Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX ............................. 62 3.2.1. Thiết kế bộ mồi khuếch đại toàn bộ gen F9 ................................................... 62 3.2.2. Tối ưu quy trình LR- PCR khuếch đại 8 vùng gen F9 ................................... 63 3.2.3. Chuẩn bị thư viện ADN .................................................................................. 67 3.2.4. Giải trình tự với quy trình NGS đã tối ưu ...................................................... 68 3.2.5. Khẳng định kết quả giải trình tự NGS ............................................................ 70 3.3. Giải trình tự gen F9 ở các mẫu nghiên cứu................................................... 73 3.4. Phân tích đột biến gen ở 100 bệnh nhân nghiên cứu .................................. 76 3.5.1. Kiểu đột biến gen............................................................................................ 80 3.5.2. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen ................................. 80 3.5.3. Đánh giá mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu ......... 81 3.6. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh ................................... 82 3.7. Lập bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam............. 83 3.7.1. Phân bố đột biến trên gen F9 .......................................................................... 83 3.7.2. Phân bố của các đột biến trên các domain của phân tử FIX .......................... 84
vii 3.7.3 Bản đồ đột biến gen F9 của bệnh nhân hemophilia B Việt Nam .................... 84 3.8. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9........................................................ 1 3.8.1. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen mã hoá yếu tố IX................................... 1 3.8.2. Tần suất alen đa hình trong quần thể người bình thường ................................. 1 3.8.3. Phân tích liên kết giữa các đa hình nucleotide ................................................. 2 3.8.4. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao .................................................... 6 3.8.5. Xác nhận hiệu quả của bộ đa hình trên gia đình người bệnh ........................... 7 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................. 9 4.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ................................................................................. 9 4.2. Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX ..................... 11 4.2.1. Thiết kế bộ mồi khuếch đại gen F9 ................................................................ 11 4.2.2. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9 .................................... 12 4.2.3. Chuẩn bị thư viện ADN .................................................................................. 14 4.2.4. Giải trình tự gen F9 với quy trình đã tối ưu ................................................... 14 4.2.5. Đánh giá kết quả giải trình tự NGS ................................................................ 15 4.3. Giải trình tự gen F9 của các mẫu nghiên cứu ............................................... 15 4.4. Phân tích đột biến gen của 100 bệnh nhân nghiên cứu ................................ 16 4.5. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu ....................................... 20 4.6. Mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh ............................ 21 4.7. Bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam .................... 22 4.7.1. Phân bố đột biến trên gen F9 .......................................................................... 22 4.7.2. Phân bố đột biến trên phân tử protein yếu tố IX ............................................ 23 4.8. Đa hình di truyền trên gen F9 ........................................................................ 26 4.8.1. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen F9 ........................................................ 26 4.8.2. Tần suất alen đa hình trong nghiên cứu.......................................................... 28 4.8.3. Phân tích mối liên kết di truyền giữa các đa hình nucleotide ......................... 30 4.8.4. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao .................................................. 31 4.8.5. Khẳng định hiệu quả của bộ đa hình ............................................................. 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 36 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ............................... 37 CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ............................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 38
viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Chú thích FIX Factor IX Yếu tố IX Hemophilia Bệnh lý rối loạn đông máu do thiếu B hụt FIX F9 Gen mã hóa yếu tố IX DNA Deoxyribonucleic Acid Phân tử ADN PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi LD-PCR Long Distance PCR Phản ứng tổng hợp chuỗi dài NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới RFLP Polymorphism hạn MLPA Multiplex Ligation-dependent Phương pháp multiplex PCR phát Probe Amplification hiện số lượng bản sao bất thường Kb Kilo base Đơn vị đo chiều dài của ADN SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotide VNTR Variable Number Tandem Repeat Các trình tự ADN lặp lại ngắn 5’UTR 5′ Untranslated Region Vùng không mã hóa ở đầu 5’ 3’UTR 3′ Untranslated Region Vùng không mã hóa ở đầu 3’ WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới European Association for EAHDA Hiệp hội bệnh hemophilia và các rối Haemophilia and Allied loạn đông máu Châu Âu Disorders United Kingdom Haemophilia Tổ chức các bác sỹ thuộc Trung tâm UKHCDO Centre Doctors’ Organisation hemophilia Vương quốc Anh CDC The Centers for Disease Control Trung tâm kiểm soát và phòng chống and Prevention bệnh dịch HGVS Human Genome Variation Hiệp hội biến đổi bộ gen người Society PolyPhen-2 Polymorphism Phenotyping v2 Phần mềm dự đoán tác động các biến đổi axit amin đến cấu trúc và chức SIFT Sorting Intolerant From Tolerant năng của phân tử protein
ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Kích thước các exon và intron trên gen F9 ở người ................................ 14 Bảng 1.2. Tần suất alen của một số đa hình trong các quần thể khác nhau ............. 30 Bảng 2.1: Trình tự mồi giải trình tự gen F9 bằng phương pháp Sanger .................. 51 Bảng 3.1. Đặc điểm của các bệnh nhân nghiên cứu ................................................. 60 Bảng 3.2. Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của một số mẫu ADN .......................... 61 Bảng 3.3. Phân đoạn ADN và các trình tự mồi thiết kế ........................................... 62 Bảng 3.4. Thành phần phản ứng LR-PCR khuếch đại các đoạn a1-a8 .................... 66 Bảng 3.5. Chu trình nhiệt của phản ứng LR-PCR cho đoạn a1, a2, a5, a6, a7 ........ 67 Bảng 3.6. Chu trình nhiệt của phản ứng LR-PCR cho đoạn a3 và a4 ...................... 67 Bảng 3.7. Chu trình nhiệt độ của phản ứng LR-PCR cho đoạn a8 .......................... 67 Bảng 3.8. Danh sách 16 đột biến mới....................................................................... 77 Bảng 3.9. Danh sách 58 đột biến phát hiện trong nghiên cứu ................................. 77 Bảng 3.10. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu ................................ 77 Bảng 3.11. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen ........................ 80 Bảng 3.12. Mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu ............... 82 Bảng 3.13. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh ............................. 82 Bảng 3.14. Danh sách 12 SNP phát hiện từ dữ liệu giải trình tự ............................. 86 Bảng 3.15. Tần suất alen đa hình gặp trong nghiên cứu .......................................... 87 Bảng 3.16 : Thống kê sự đồng biểu hiện của các đa hình nucleotide ...................... 88 Bảng 3.17. Phân nhóm SNP theo mức độ liên kết ................................................... 92 Bảng 3.18. Bộ SNP có giá trị thông tin .................................................................... 92 Bảng 4.1. Tỷ lệ đột biến mới trong một số nghiên cứu trên thế giới ..................... 105 Bảng 4.2. Tần suất alen đa hình ở một số quần thể khác nhau .............................. 114 Bảng 4.3. Tần suất alen của đa hình MseI ở các quần thể trên thế giới ................. 115 Bảng 4.4. Tần suất dị hợp tử của một số đa hình liên kết với gen F9 ở các quần thể .... 119
x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ di truyền trong bệnh hemophilia B .................................................. 8 Hình 1.2. Sơ đồ con đường đông máu ...................................................................... 12 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử yếu tố IX ....................................................................... 13 Hình 1.4. Tương tác của yếu tố FIXa với phức hợp TF/FVIIa ................................ 15 Hình 1.5. Tương tác của FIXa với FVIIIa ................................................................ 16 Hình 1.6. Các vị trí đột biến trên trình tự phân tử FIX............................................. 20 Hình 1.7. Kiểu đột biến và tỷ lệ đột biến trong gen F9 ............................................ 24 Hình 1.8: Sơ đồ các đột biến điểm trong vùng promoter của gen F9 ...................... 25 Hình 1.9. Số đột biến mới được công bố hàng năm ................................................ 27 Hình 1.10. Vị trí đa hình trên gen F9 ....................................................................... 29 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................... 49 Hình 2.2: Xác định giá trị D’ trên phần mềm Haploview ........................................ 59 Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................... 61 Hình 3.2. Kết quả kiểm tra độ bao phủ gen F9 của các trình tự mồi ....................... 63 Hình 3.3. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a1 và a2 .................................... 63 Hình 3.4. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a3 và a4 ..................................... 64 Hình 3.5. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a5 và a6 .................................... 64 Hình 3.6. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a7 và a8 .................................... 64 Hình 3.7. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a8............................................... 65 Hình 3.8. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a8............................................... 66 Hình 3.9. Hình ảnh khuếch đại các phân đoạn a1-a8 ở điều kiện Tm tối ưu. .......... 66 Hình 3.10. Kết quả kiểm tra thư viện ADN trên hệ thống điện di mao quản.......... 68
xi Hình 3.11. Các chỉ số chất lượng và hình ảnh kết quả giải trình tự ......................... 69 Hình 3.12. Kết quả phân tích đột biến với quy trình NGS và Sanger ...................... 73 Hình 3.13. Kết quả Longrange PCR của các mẫu H14, H94, H97 .......................... 74 Hình 3.14. Kết quả giải trình tự gen NGS của các mẫu H14, H94, H97 ................. 75 Hình 3.15. Kết quả phân tích MLPA của các mẫu H14, H94, H97 ......................... 76 Hình 3.16. Phân bố đột biến trên gen F9 .................................................................. 83 Hình 3.17. Phân bố đột biến trên domain của phân tử FIX ...................................... 84 Hình 3.18. Bản đồ đột biến gen F9 của bệnh nhân hemophilia B ở Việt Nam ........ 85 Hình 3.19. Kết quả phân tích mối liên kết giữa các trên phần mềm Haploview 4.2........... 91 Hình 3.20. Kết quả khảo sát hiệu quả của bộ đa hình nucleotide ............................ 93
1 MỞ ĐẦU Hemophilia B là hội chứng rối loạn chảy máu nghiêm trọng. Biểu hiện chính của bệnh là hiện tượng chảy máu lâu cầm sau nhổ răng, vết rách, sau chấn thương, sau phẫu thuật hoặc chảy máu sinh lý khác. Ở bệnh mức độ nặng hiện tượng chảy máu trong có thể gây tổn thương các cơ quan và mô, dẫn đến tàn phế và đe dọa tính mạng của người bệnh [1] [2]. Đây là bệnh lý dai dẳng, khó điều trị và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh. Hemophilia B chiếm tỷ lệ từ 15-20% trong nhóm bệnh hemophilia với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30.000 nam giới [3] [4]. Cơ chế sinh bệnh xuất phát từ các đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Các đột biến tác động làm suy giảm hoặc làm ngừng quá trình tổng hợp yếu tố IX của gen, gây thiếu hụt yếu tố IX và dẫn đến hiện tượng chảy máu kéo dài. Gen F9 là gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X (Xq27.1-q27.2) do đó hemophilia B là bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính. Nam giới bị bệnh sinh ra tất cả con gái là người mang gen bệnh. Phụ nữ mang gen bệnh có 50% nguy cơ truyền nhiễm sắc thể X đột biến cho con trong mỗi lần sinh [5]. Chính vì vậy, phòng bệnh thông qua chẩn đoán người mang gen bệnh là cách tiếp cận hữu hiệu và duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. Đây là nhiệm vụ, là mục tiêu chính của các chiến lược quản lý bệnh hemophilia B. Hiện nay, trên thế giới có hai cách tiếp cận khác nhau để chẩn đoán người mang gen bệnh đó là phương pháp phân tích trực tiếp đột biến gây bệnh và phương pháp chẩn đoán gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide liên kết với gen F9. Phân tích trực tiếp là phương pháp đi tìm đột biến gen ở người bị bệnh, sau đó sử dụng chính đột biến ở người bệnh làm chỉ thị phân tử để chẩn đoán tình trạng mang gen và chẩn đoán trước sinh cho các thành viên nữ trong gia đình. Như vậy, trong phương pháp phân tích trực tiếp, đột biến gen ở người bệnh là cơ sở để xác định tình trạng mang gen bệnh. Phân tích gián tiếp còn được gọi là phân tích liên kết (linkage analysis). Phương pháp này không cần xác định cụ thể đột biến gây bệnh mà sử dụng các đa hình liên kết với gen F9 bệnh như những “chỉ điểm” để lần theo dấu vết gen
2 bệnh, từ đó xác định người mang gen bệnh. Để áp dụng phân tích liên kết, ngoài việc đáp ứng các yêu cầu về mẫu bệnh phẩm, trong gia đình người bệnh cần xác định được người chắc chắn mang gen bệnh và dị hợp tử với ít nhất một đa hình trên gen F9. Việc tìm ra được một đa hình dị hợp tử ở người mang gen sẽ gặp nhiều khó khăn nếu như không có thông tin về tần suất dị hợp tử của các đa hình. Do đó, khảo sát để tìm ra các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao, đặc trưng cho quần thể đóng là bước quan trọng đầu tiên để có thể ứng dụng hiệu quả phương pháp phân tích liên kết [5] [6]. Trên thế giới, các nghiên cứu về biến đổi di truyền trên gen F9 đã được thực hiện từ rất lâu [7]. Đến nay, cơ sở dữ liệu đột biến trên thế giới đã ghi nhận trên 1000 đột biến gen liên quan đến bệnh hemophilia B và nhiều đa hình nucleotide trên gen F9 [4]. Nhiều quốc gia đã xây dựng được cơ sở dữ liệu đột biến gen của bệnh nhân đồng thời xác định được các đa hình có giá trị trong chẩn đoán, do đó áp dụng linh hoạt được cả hai phương pháp phân tích trực tiếp và gián tiếp trong chẩn đoán người mang gen, hỗ trợ hiệu quả công tác kiểm soát và quản lý bệnh [8] [9] [10] [11] [12] [13]. Tại Việt Nam, chẩn đoán và quản lý bệnh hemophilia B vẫn còn là một vấn đề nan giải. Theo ghi nhận của Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học - Truyền máu TW, mỗi năm có hàng trăm ca bệnh mới được phát hiện. Số liệu ước tính của trung tâm cho thấy có ~ 30.000 người mang gen bệnh trên cả nước nhưng chỉ 20% trong số đó được chẩn đoán và quản lý [14]. Chẩn đoán người mang gen để tư vấn tiền hôn nhân và tư vấn sinh sản là biện pháp duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. Tuy nhiên, hiện chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu về các đa hình nucleotide trên gen F9 ở người Việt Nam; nghiên cứu về đột biến gen F9 liên quan đến bệnh hemophilia B mặc dù đã được tiến hành trong một vài nghiên cứu nhưng cỡ mẫu chưa nhiều do đó dữ liệu về đột biến gen ở bệnh nhân còn rất thiếu. Do đó công tác chẩn đoán và quản lý người mang gen chưa hiệu quả dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh gia tăng. Chính vì vậy, với mong muốn tiếp cận để phối hợp được cả hai phương pháp phân tích trực tiếp và phân tích gián tiếp trong chẩn đoán người mang gen bệnh hemophilia B tại Việt Nam, nghiên cứu sinh thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B”.
3 MỤC TIÊU Mục tiêu 1: Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân hemophilia B. Mục tiêu 2: Khảo sát để xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ sở để chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết. NỘI DUNG 1. Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX trên máy giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing). - Thiết kế các cặp mồi gối đầu nhau để khuếch đại toàn bộ gen F9 - Xây dựng và tối ưu quy trình Long-range PCR khuếch đại gen F9 - Xây dựng quy trình giải trình tự gen F9 bằng kỹ thuật NGS - Khẳng định độ tin cậy của quy trình NGS bằng phương pháp Sanger 2. Giải trình tự gen F9 và lập bản đồ đột biến gen F9 ở 100 bệnh nhân hemophilia B. Khảo sát mối tương quan kiểu gen đột biến và tình trạng bệnh ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu. 3. Giải trình tự gen F9 ở 100 người phụ nữ khỏe mạnh. Xác định tần suất và tỷ lệ dị hợp tử các đa hình nucleotide trên gen F9. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu số lượng lớn và tổng thể về đột biến trên toàn bộ gen mã hóa yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, bao gồm tất cả các vùng chức năng, các exon và intron, sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen NGS. 2. Là công trình nghiên cứu tính đa hình nucleotid trên gen mã hóa yếu tố IX đầu tiên tại Việt Nam, thực hiện nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn, phục vụ chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh hemophilia B 1.1.1. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B Theo ghi chép của các sử gia Châu Âu, những ghi nhận đầu tiên về bệnh máu khó đông, tên gọi khác của bệnh hemophilia B đã được đề cập đến từ thế kỷ thứ hai sau công nguyên khi các giáo sỹ Do Thái cổ đại thực hiện thủ thuật cắt bao quy đầu cho các bé trai mới sinh. Người ta quan sát thấy nhiều em bé bị chảy máu kéo dài dẫn tới tử vong sau khi thực hiện thủ thuật này. Ở thời điểm đó, hiện tượng này chưa được coi là một căn bệnh, cũng chưa được mô tả hay điều trị gì, mà chỉ được xem như một sự nhiễm trùng. Mặc dù vậy, với những hậu quả nghiêm trọng đã xảy ra, quy định cắt bao quy đầu sau đó đã được miễn cho các cậu bé mà tiền sử đã có hai anh trai bị chết vì chảy máu [15] [16]. Vào thế kỷ thứ 10, bác sỹ người Ả Rập, Al-Zahrawi - Albucasis (936-1013), người đầu tiên mô tả về căn bệnh này, đã phát hiện ra ở một số người nam giới có hiện tượng dễ bị chảy máu kéo dài khi gặp chấn thương dù rất nhỏ. Mặc dù chưa biết nguyên nhân của bệnh nhưng ông đã đặt tên là “bệnh máu”, đồng thời đề xuất phương pháp điều trị là đốt vị trí tổn thương đến khi mạch ngừng chảy máu. Đây được coi là phương pháp điều trị sơ khai đầu tiên của căn bệnh này [15] [16]. Năm 1803, bác sỹ người Mỹ, John Conrad Otto đã công bố kết quả của nghiên cứu “mô tả tình trạng máu khó đông ở một số gia đình” [17]. Trong nghiên cứu, ông đã nhận ra rối loạn này có tính chất di truyền, chỉ người nam giới mới bị và bệnh là do những người phụ nữ không bị bệnh truyền cho các con trai của họ với một tỷ lệ nhất định. Những phát hiện này định hình cơ bản đặc điểm của một căn bệnh và là tiền đề cho những nghiên cứu vô vùng mạnh mẽ ở thế kỷ 19. Năm 1928, thuật ngữ “hemophilia” với ý nghĩa bệnh ưa chảy máu mới được đề cập lần đầu tiên tại đại học Zurich để mô tả về căn bệnh này [15]. Bệnh hemophilia B bùng nổ vào thế kỷ 19 đến 20 và được xem như một căn bệnh “hoàng gia” khi nhiều hoàng tộc Châu Âu đều mắc bệnh này. Nữ hoàng Anh, Victoria được coi là người đầu tiên mang gen bệnh hemophilia B. Con trai bà mất do xuất huyết não sau chấn thương
5 ở tuổi 31. Gen bệnh từ hai người con gái của bà đã lan truyền khắp các hoàng tộc như Tây Ban Nha, Đức và Nga. Sự bùng nổ của bệnh hemophilia trong các gia đình hoàng gia lúc bấy giờ đã thúc đẩy mạnh mẽ việc tìm hiểu các kiến thức y học của căn bệnh này [15] [16]. Năm 1952, Rosemary Biggs phát hiện ra bệnh hemophilia B, còn được gọi là bệnh Chrismas (theo họ của bệnh nhân hemophilia B đầu tiên, Stephan Chrismas). Yếu tố IX đồng thời cũng được gọi là yếu tố Christmas. Các mô hình nghiên cứu điều trị bệnh hemophia B được tập trung nghiên cứu. Các chế phẩm điều trị bệnh hemophilia B được tối ưu qua từng giai đoạn: chế phẩm huyết tương tươi và máu toàn phần (1960), tủa lạnh (1964), yếu tố cô đặc có nguồn gốc huyết tương (từ 1970), yếu tố cô đặc tái tổ hợp (từ 1994 đến nay) [15] [16] [18]. Năm 1963, Liên đoàn hemophilia thế giới được thành lập, cho thấy một sự quan tâm đặc biệt tới căn bệnh này. Liên đoàn đã tạo ra sự lãnh đạo toàn cầu với mục tiêu cải thiện và hỗ trợ để duy trì sự chăm sóc với cho tất cả bệnh nhân bị bệnh máu di truyền, trong đó có bệnh hemophilia. Các phương thức hoạt động của Liên đoàn bao gồm: cung cấp các khóa đào tạo cơ bản để tăng độ chính xác trong chẩn đoán bệnh, cải thiện chuyên môn trong chăm sóc người bệnh; tăng khả năng tiếp cận với các sản phẩm đã được xử lý an toàn và đăc biệt là liên kết với các trung tâm/đơn vị điều trị các bệnh máu di truyền để giúp họ đạt được sự hỗ trợ của chính phủ thông qua vận động chính sách. Hiện nay, Liên đoàn hemophilia thế giới đã trở thành một mạng lưới toàn cầu, hoạt động hiệu quả với 97 quốc gia thành viên [19] Năm 1982 đến 1983, gen F9 đã được tách dòng. Năm 1985, toàn bộ trình tự gen F9 được công bố. Cấu trúc và chức năng của gen F9 được sáng tỏ [7]. Từ thời điểm này, phân tích đột biến để xác định tình trạng mang gen và chẩn đoán trước sinh hoặc phân tích di truyền gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide để theo dõi các alen đột biến trong gia đình hemophilia B đã được thực hiện [4]. Đến nay, nhiều đột biến gen liên quan đến bệnh hemophilia và các đa hình trên gen F9 được biết đến, mối liên quan giữa kiểu đột biến gen với kiểu hình bệnh, mối liên quan giữa đột biến gen với chất ức chế cũng được làm sáng tỏ, hỗ trợ tích cực trong công tác chẩn đoán, điều trị, quản lý và kiểm soát bệnh hemophilia B.
6 1.1.2. Khái quát về bệnh hemophilia B 1.1.2.1. Đặc điểm của bệnh Người khỏe mạnh bình thường có nồng độ yếu tố IX hoạt tính dao động từ 50- 150% [20]. Khi mạch máu bị tổn thương hoặc đứt, quá trình cầm máu được đáp ứng rất nhanh, khu trú tại vùng tổn thương và được kiểm soát chặt chẽ bằng các cơ chế co mạch, hình thành nút tiểu cầu, đông máu, tan cục máu đông hoặc phát triển mô xơ trong cục máu đông để đóng kín vết thương. Người bệnh hemophilia B là những người bị mất khả năng kiểm soát quá trình đông máu do nồng độ yếu tố IX hoạt tính giảm dưới 40%, đặc trưng là hiện tượng chảy máu kéo dài và dễ bị bầm tím [20] [21]. Cơ chế phát sinh bệnh hemophilia B là do xảy ra các đột biến trên gen F9. Các đột biến làm biến đổi cấu trúc gen, gây suy giảm khả năng tổng hợp protein của gen. Tùy từng loại đột biến và vị trí xảy ra đột biến sẽ tạo ra các mức độ thiếu hụt yếu tố IX khác nhau, gây ra các mức độ bệnh khác nhau. Dựa vào kết quả định lượng nồng độ yếu tố IX hoạt tính trong huyết tương, bệnh hemophilia B được chia thành 3 mức độ: nặng khi nồng độ yếu tố IX < 1%; trung bình khi nồng độ yếu tố IX từ 1% - 5%; nhẹ khi nồng độ yếu tố IX dao động từ > 5% đến < 40% [20] [21]. Trường hợp bệnh mức độ trung bình và nhẹ thường có hiện tượng chảy máu kéo dài sau phẫu thuật hoặc chấn thương. Mức độ nặng thường xuất hiện tự chảy máu trong cơ khớp mà không cần lý do. Khi bị chảy máu, đặc biệt trong cơ, khớp hoặc các cơ quan nội tạng thì bệnh nhân nhẹ nhất có thể tàn phế, bệnh nhân nặng có thể tử vong rất nhanh. Nhưng nếu được chẩn đoán sớm và điều trị đầy đủ, bệnh nhân hemophilia B vẫn có thể có cuộc sống gần như người bình thường. Bệnh hemophilia B di truyền gen lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X, vì vậy đa số nam giới biểu hiện bệnh, nữ giới thường là người mang gen bệnh [22]. Người mang gen bệnh không có triệu chứng của bệnh, nhưng cũng có nguy cơ chảy máu bất thường khi nồng độ yếu tố IX thấp dưới mức bình thường hoặc do mất cân đối quá trình bất hoạt nhiễm sắc thể X (skewed X inactivation). Thế giới đã ghi nhận một số trường hợp nữ giới mắc bệnh hemophilia B, đó là các trường hợp mang đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép trên gen F9 hoặc người mang gen hemophilia B có hội
7 chứng Turner (mất một nhiễm sắc thể X) hoặc người mang gen hemophilia B có hội chứng Testicular Feminization (người nữ giới có kiểu gen của nam giới, 46 XY) [3] [4]. Đột biến gen trong bệnh hemophilia B không tự mất đi, mức độ bệnh thường cũng không thay đổi trong suốt cuộc đời người bệnh. Tuy nhiên, năm 1970, Veltlkamp và cộng sự đã công bố một biến thể mới của bệnh hemophilia B đó là kiểu hình hemophilia B Leyden [23]. Theo đó, kiểu hình này xuất hiện trong khoảng 3% bệnh nhân, đặc trưng bởi sự thiếu hụt yếu tố IX nghiêm trọng ở lúc mới sinh, nhưng từ tuổi thứ 10 nồng độ yếu tố IX bắt đầu tăng dần và sau 20 tuổi nồng độ yếu tố IX gần như đạt mức bình thường và duy trì như vậy trong suốt cuộc đời . Đa số bệnh nhân hemophilila B Leyden không cần điều trị gì trong cuộc sống hàng ngày mà chỉ phải bổ sung yếu tố đông máu khi gặp tai nạn hoặc điều trị dự phòng trước phẫu thuật. Cơ chế hoạt động của gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Leyden liên quan tới đáp ứng androgen của nhân tố điều hòa phiên mã nằm trong vùng promoter của gen F9. 1.1.2.2. Cơ chế di truyền của bệnh Hemophilia B là bệnh lý di truyền bẩm sinh. Trong đó có ~70% bệnh là do nhiễm sắc thể X đột biến di truyền qua các thế hệ trong gia đình (70%). Có ~30% trường hợp hemophilia B không có tiền sử gia đình, trong gia đình chỉ có một người bị bệnh, những trường hợp đó được gọi là hemophilia B đơn phát (sporadic hemophilia). Hemophilia B đơn phát phát sinh do các đột biến mới (de novo) xuất hiện trong chính đời sống của cá thể mang bệnh [24]. Gen mã hóa yếu tố IX nằm trên nhiễm sắc thể X vì vậy hemophilia B là rối loạn di truyền gen lặn liên kết nhiễm sắc thể X (X-linked recessive disorder) [6] [25]. Căn cứ vào quy luật di truyền của Mendel, phân tích phả hệ của các gia đình có tiền sử hemophilia B có thể phát hiện được các thành viên chắc chắn mang gen bệnh, các thành viên có nguy cơ mang gen bệnh hoặc bị bệnh. Người nam giới bị bệnh hemophilia B sẽ sinh ra tất cả con gái mang gen bệnh (obligate carrier) (Hình 1a). Người phụ nữ mang gen bệnh có nguy cơ truyền nhiễm sắc thể X đột biến cho con là 50% trong mỗi lần sinh (Hình 1b). Với các trường hợp hemophilia đơn phát, gen bệnh bắt đầu di truyền từ khi phát hiện người bệnh đầu tiên, do đó các thành viên nữ các thế
8 hệ tiếp theo trong các gia đình này là những người cần được phân tích di truyền để chẩn đoán tình trạng mang gen [5] [21]. (1a) (1b) Hình 1.1. Sơ đồ di truyền trong bệnh hemophilia B [26] 1.1.2.3. Phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh a) Chẩn đoán xác định bệnh Nguyên nhân gây bệnh hemophilia B là do các đột biến trên gen F9. Tuy nhiên, với bệnh nhân hemophilia B không cần thực hiện xét nghiệm phân tích đột biến để chẩn đoán bệnh mà chỉ cần thực hiện xét nghiệm định lượng yếu tố IX, xem xét các đặc điểm lâm sàng kết hợp với khai thác tiền sử gia đình [14] [21]. Về đặc điểm lâm sàng, bệnh nhân hemophilia B thường là nam giới với các biểu hiện như: dễ bầm tím từ khi còn nhỏ; chảy máu lâu cầm, tái phát nhiều lần ở các vị trí chân răng, mũi, vết thương, đái máu, đi ngoài ra máu, đặc biệt hay bị ở khớp và cơ, có tính chất lặp lại ở một cơ, một khớp. Chảy máu kéo dài bất thường sau chấn thương, nhổ răng hoặc phẫu thuật, biến dạng khớp, teo cơ do chảy máu nhiều lần ở khớp. Khai thác tiền sử gia đình có có người nam giới liên quan họ mẹ bị chảy máu lâu cầm [14] [21]. Về xét nghiệm, bệnh nhân hemophilia B có kết quả định lượng yếu tố IX trong huyết tương bằng 0 hoặc < 40% [14] [21]. Trong quá trình chẩn đoán, cần phân biệt hemophilia B di truyền với hemophilia B mắc phải. Bệnh nhân hemophilia mắc phải thường không có tiền sử chảy