Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:193

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Sàng lọc và xác định được điều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam, tiềm năng lựa chọn được cho sản xuất squalene; xác định điều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn được; đánh giá độ an toàn và tác dụng sinh học, dược lý của squalene tách chiết được theo định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC Hà Nội - Năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội – Năm 2020
i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học và giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo và bộ phận đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Trong quá trình viết luận án tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của TS. Hoàng Thị Lan Anh. Ngoài ra tôi cũng nhận được sự giúp đỡ của các đồng nghiệp làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh Hiền, TS. Ngô Thị Hoài Thu, TS. Lưu Thị Tâm, ThS. NCS. Lê Thị Thơm. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Hoàng Ngân- Học viện Quân Y, đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của squalene. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá và khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển của Việt Nam” (2013-2016) do PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid của các hợp chất từ thực vật biển Việt Nam trong phòng và điều trị bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu” (2014-2016) và đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi trồng lượng lớn sinh khối tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 và tách chiết qualene đủ tiêu chuẩn nguyên liệu làm thực phẩm chức năng” (2014-2016) do TS. Hoàng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả Nguyễn Cẩm Hà
ii Lời cam đoan Tôi xin cam Ďoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần Ďã Ďược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự Ďồng ý và cho phép của các Ďồng tác giả; Phần còn lại chưa Ďược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020 Tác giả Nguyễn Cẩm Hà
iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn……………………………………………………………………... i Lời cam Ďoan…………………………………………………………………... ii Mục lục………………………………………………………………………… iii Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt………………………………………….. viii Danh mục các bảng……………………………………………………............. xi Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị………………………………………………….. xii MỞ ĐẦU………………………………………………………………………. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………….... 4 1.1. Giới thiệu chung về squalene………………………………….. 4 1.1.1. Tính chất hóa lý của squalene…………………………………... 4 1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene……………………………. 4 1.1.3 Các con Ďường sinh tổng hợp của squalene ở Ďộng vật, thực vật và vi sinh vật…………………………………………………….. 6 1.1.4 Ứng dụng của squalene…………………………………………. 11 1.1.5. Các nguồn cung cấp squalene…………………………………... 18 1.2. Công nghệ tách chiết và tinh sạch squalene……………..…… 21 1.2.1. Công nghệ tách chiết squalene…………………………………. 21 1.2.2. Các phương pháp Ďịnh lượng và tinh sạch squalene…………..... 27 1.3. Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng……… 29 1.4. Giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium………. 33 1.4.1 Đặc Ďiểm chung của chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium…. 33 1.4.2. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene…………………………………………… 37 1.4.2.1. Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium cho sản xuất squalene trên thế giới……………………………...... 37 1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng Schizochytrium cho sản xuất squalene ở Việt Nam……………………………………………….............. 39 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………... 43
iv 2.1. Vật liệu…………………………………………………………. 43 2.1.1. Mẫu vật………………………………………………………….. 43 2.1.2. Các bộ kít sinh phẩm……………………………………………. 44 2.1.3. Động vật thí nghiệm…………………………………………….. 45 2.1.4. Các dòng tế bào…………………………………………………. 46 2.1.5. Hoá chất…………………………………………………………. 46 2.1.6. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm………………………………….. 46 2.1.7. Môi trường nuôi cấy…………………………………………….. 47 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………… 48 2.2.1. Nhóm phương pháp xác Ďịnh chủng/loài; Ďặc Ďiểm sinh học; Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao ……………….................................................. 48 2.2.1.1. Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh khối khô………………………………………………………………… 48 2.2.1.2. Phương pháp chụp ảnh hình thái………………………………....... 49 2.2.1.3. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối tảo……………………………………………………………………….. 49 2.2.1.4. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red………………………….. 49 2.2.1.5. Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA…………………… 49 2.2.1.6. Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene……………….. 50 2.2.1.7. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao …………………………………………………………... 50 2.2.2. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 53 2.2.2.1. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………… 53 2.2.2.2. Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………… 55 2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene.. ..................................................................................... 56
v 2.2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc của squalene.............................. 57 2.2.3. Nhóm phương pháp xác Ďịnh các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6……………………….. 57 2.2.4. Nhóm phương pháp Ďánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên Ďộng vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)…………………... 58 2.2.4.1 Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo……………………………………………………………………… 58 2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro………………………………………………….. 59 2.2.5. Thống kê phân tích số liệu……………………………………… 63 2.2.6. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu…………… 63 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN….……………. 65 3.1. Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất squalene………………………………………………………… 65 3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 lên sinh trƣởng và hàm lƣợng squalene………………………….. 67 3.2.1. Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất squalene ở cấp Ďộ bình tam giác………………………………… 67 3.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác……………………………………………….. 67 3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 69 3.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác……………………… 70 3.2.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ tebinafine lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác …………………………… 72 3.2.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác………….…………... 73 3.2.2 Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên men 30 lít Ďể thu sinh khối tảo giàu squalene…………………... 75
vi 3.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống bình lên men 30 lít…………………………………………. 75 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống lên men 30 lít…………………………………………………………... 77 3.2.2.3 Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6……... 79 3.2.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6…………………………. 81 3.3. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6…………………………………………………. 86 3.3.1. Tối ưu Ďiều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ S. mangrovei PQ6……………………………………………….. 86 3.3.1.1. Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6……….... 86 3.3.1.2 Tách chiết lipid không xà phòng hóa từ lipid tổng số……………. 90 3.3.1.3. Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp…………………………………………………………. 91 3.3.1.4. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi………………………………………………………………... 92 3.3.2. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô pilot từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 94 3.3.2.1. Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene từ sinh khối khô S. mangrovei PQ6……………………………………. 95 3.3.2.2. Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 sau quá trình nuôi cấy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất ………… 97 3.3.2.3. Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp sắc ký cột……... 98 3.3.2.4. Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6……………………………… 101 3.3.3. Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S.mangrovei PQ6... 103 3.3.4. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………. 105 3.4. Tính an toàn và tác dụng dƣợc lý của squalene tách chiết từ
vii S. mangrovei PQ6 trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)……………………………… 107 3.4.1. Độc tính cấp của squalene trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm…………………………………………………………... 107 3.4.2. Độc tính bán trường diễn của squalene trên mô hình Ďộng vật thực nghiệm……………………………………………………... 108 3.4.2.1. Ảnh hưởng của squalene lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày……………………. 108 3.4.2.2. Ảnh hưởng của squalene đối với một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa của chuột…………………………………………………….. 109 3.4.2.3. Đánh giá mức độ tổn thương chức năng gan, thận chuột khi dùng squalene dài ngày………………………………………………. 112 3.4.3. Tác dụng dược lý của squalene trên chuột nhắt trắng thí nghiệm…………………………………………………………... 114 3.5. Bƣớc đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro……………………………………………………………... 117 3.5.1. Đánh giá Ďộc tính của squalene trên các dòng tế bào…………… 117 3.5.2. Tác dụng giảm lipit của squalene lên tế bào gan và tế bào Ďại thụ thể…………………………………………………………… 118 3.5.2.1. Tối ưu hóa thời gian và nồng độ ủ squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid trong tế bào gan HepG2……………………………….. 118 3.5.2.2. Tác dụng của squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid nội bào trong tế bào gan HepG2 và RAW264.7…………………………….. 119 3.5.3. Cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………………………………. 121 3.5.4. Tác dụng giảm triglyceride của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………………………………………….. 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………... 127 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ……………………………… 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 131 PHỤ LỤC
viii Q111`DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt ABCA1 ATP-binding cassette protein A1 Protein A1 liên kết với ATP ABCG1 ATP-binding cassette protein G1 Protein G1 liên kết với ATP ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase ApoE Apolipoprotein E Apolipoprotein E AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate CCT Chuột cống trắng Chuột cống trắng CNT Chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng CYP7A1 Cholesterol 7a- hydroxylase Cholesterol 7a- hydroxylase DHA Docosahexaenoic acid Axít docosahexaenoic DMAPP Dimethylallyl diphosphate Dimethylallyl diphosphate DMEM Dulbecco's modified eagle Môi trường DMEM medium DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic DO Dissolved oxygen Oxy hòa tan DXP 1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate 1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate EN Ectoplasmic net Mang lưới ngoại chất ER Endoplasmic reticulum Màng lưới nội chất EPA Eicosapentaenoic acid Acid eicosapentaenoic FAS Fatty acid synthase Fatty acid synthase
ix ESFA Este steryl fatty acid Acid béo este steryl FBS Fetal bovine serum Huyết thanh phôi bò FPP Farnesyl diphosphate Farnesyl diphosphate GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate GAPDH dehydrogenase GC Gas chromatography Sắc ký khí GPP Geranyl diphosphate Geranyl diphosphate HDL-C high density lipoprotein- cholesterol gắn với lipooprotein tỷ cholesterol trọng cao HMG-CoA 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA HMGR 3 - hydroxyl - 3 - methylglutaryl 3 - hydroxyl - 3 - methylglutaryl coenzyme A reductase coenzyme A reductase HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng cao áp chromatography IPP Isopentenyl diphosphate Isopentenyl diphosphate KLCT Khối lượng cơ thể Khối lượng cơ thể KXPH Không xà phòng hóa Không xà phòng hóa LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết 50% số Ďộng vật thực nghiệm LDL-C Low density liporotein-cholesterol Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng thấp LDL-R Low density lipoprotein - receptor Thụ thể lipoprotein có tỷ trọng thấp LXR Liver X receptor Thụ thể gan X MĐTB Mật Ďộ tế bào Mật Ďộ tế bào
x MEP Methylerythritol phosphate Methylerythritol phosphate MJA Methyl jasmonate Methyl jasmonate MVA Mevalonate Mevalonat NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân OA Oleic acid Acid oleic ORO Oil Red O Oil red O PA Palmitic acid Palmitic acid PBS Phosphate buffered salina Muối Ďệm phosphate PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PUFA Polyunsaturated fatty acid Axít béo không bão hòa Ďa nối Ďôi RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic SCF Super critical fluid Chất lỏng siêu tới hạn SKK Sinh khối khô Sinh khối khô SKT Sinh khối tươi Sinh khối tươi TB Tế bào Tế bào TG Triglycerid Triglycerit TBNF Terbinafine Terbinafine TBS Tris-buffered saline Tris-buffered saline TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng VLDL-C Very low density-cholesterol Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ trọng rất thấp VTBDD Vi tảo biển dị dưỡng Vi tảo biển dị dưỡng
xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene…………………………………..… 4 Bảng 1.2 Một số tiêu chuẩn của squalene thương mại…………………………. 17 Bảng 1.3. Tính chất vật lý của một số chất lỏng siêu tới hạn (SCF)……………. 23 Bảng 1.4. Các phương pháp tách chiết squalene từ nguồn tự nhiên…………….. 24 Bảng 1.5. Sự phân loại của lớp Labyrinthulea Ďược Ďiều chỉnh từ các nghiên của Anderson và Cavalier-Smith (2012), Gomaa và cộng sự (2013), Beakes và cộng sự, (2014)……………................................................. 35 Bảng 2.1. Danh sách các chủng thuộc chi Schizochytrium và Thraustochytrium.. 44 Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi Ďược sử dụng trong phản ứng qPCR………….. 45 Bảng 2.3. Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu………………… 63 Bảng 3.1. Sinh trưởng, hàm lượng lipid tổng số và squalene của các chủng thuộc chi Schizochytrium, Thraustochytrium Ďã phân lập…………..... 65 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên hàm lượng và sản lượng squalene trong quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất của tế bào S. mangrovei PQ6………………………………………………………... 84 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên hàm lượng và hiệu suất tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số của chủng PQ6…………………………………………………………….. 91 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên hiệu suất tách chiết lipid KXPH và hàm lượng squalene từ lipid tổng số của chủng PQ6……………………………………………………... 91 Bảng 3.5. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6…………………………….. 106 Bảng 3.6. Độc tính cấp theo Ďường uống của squalene trên chuột nhắt trắng…... 107 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của squalene lên thể trọng chuột cống trắng……………... 109 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của squalene lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa trong máu chuột……………………………………………………….. 109 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của squalene lên nồng Ďộ HDL-C máu chuột……………. 112 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của squalene lên cân nặng cơ thể và gan chuột nghiên cứu 115 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của squalene lên các chỉ số lipid máu chuột……………... 116
xii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene và tiền chất của nó…………………… 5 Hình 1.2. Tổng hợp squalene thông qua con Ďường MVA ở Ďộng vật có vú (A). Tổng hợp squalene ở thực vật thông qua con Ďường MVA tại phần bào tan và MEP ở lạp thể (B)…………………………………………. 7 Hình 1.3 Sinh tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP ở vi khuẩn E. coli (A). Sinh tổng hợp squalene ở nấm men Sacchacromyces cerevisae (B)………………………………………………………………… 8 Hình 1.4. Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và DHA ở Thraustochytrids………………………………………………………. 9 Hình 1.5. Các hệ thống bình lên men 5 lít, 10 lít, 30 lít và 150 lít cho nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng S. mangrovei PQ6…..………………………………. 41 Hình 2.1. Sơ Ďồ thí nghiệm nghiên cứu squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6……………………………………………………………………. 64 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ lên sinh trưởng (A) và hàm lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau…………………………………… 68 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng Ďộ cao nấm men lên sinh trưởng (A) và hàm lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau ............................... 69 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên sinh trưởng (A) và hàm lượng lipit (B) của S. mangrovei PQ6……………………………………….. 70 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên hàm lượng squalene (A) và hiệu suất squalene (B) của S. mangrovei PQ6............................................... 71 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng Ďộ terbinafine lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), hàm lượng lipid và squalene (C) của S. mangrovei PQ6........ 73 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6…………………. 74 Hình 3.7. Ảnh hưởng của các nồng Ďộ glucose khác nhau lên sinh trưởng (A-B) và hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6............................. 76 Hình 3.8. Hình thái của S. mangrovei PQ6 khi nuôi trồng ở các nồng Ďộ glucose ban Ďầu khác nhau dưới kính hiển vi quang học (Ďộ phóng Ďại x400). 77 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối
xiii khô (B), sản lượng squalene (C), Ďường dư (D) của tế bào S. mangrovei PQ6 ....................................................................................... 78 Hình 3.10. Ảnh hình thái của S. mangrovei PQ6 dưới kính hiển vi quang học ở các thời Ďiểm khác nhau khi nuôi lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất trong bình 30 Lít.................................................................................. 80 Hình 3.11. Mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), sản lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6 và hàm lượng Ďường dư (D) trong nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất.................................................................................. 81 Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin B1, B6, B12 lên sinh khối (A), hàm lượng squalene (B) và lượng Ďường dư (C) trong môi trường khi nuôi cấy theo mẻ S. mangrovei PQ6............................................................. 82 Hình 3.13. Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn nuôi cấy của quá trình lên men fed-batch. A- Trước thời Ďiểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ sung glucose lên 22%............................................................................. 85 Hình 3.14. Ảnh hưởng của các yếu tố dung môi (A), nhiệt Ďộ (B), thời gian (C), số lần chiết (D) tỷ lệ sinh khối/dung môi (E), chế Ďộ khuấy trộn (G), nhiệt Ďộ sấy sinh khối (H), Ďộ ẩm sinh khối (I) lên hiệu suất tách chiết lipid ......................................................................................................... 87 Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc ký Ďồ squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) ..................................... 92 Hình 3.16. Hàm lượng squalene qua các bước làm giàu và tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6 ................................................................................... 92 Hình 3.17. Ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký Ďồ của squalene tinh sạch sau quá trình làm giàu thông qua quy trình 6 bước (B) ......................... 93 Hình 3.18. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6...................................................................................... 94 Hình 3.19. Ảnh hưởng của dung môi lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene thô Ďược tách chiết từ sinh khối tảo với các loại dung môi khác nhau ................. 95 Hình 3.20. Ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối tảo lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene trong mẫu squalene thô Ďược tách chiết từ sinh khối tảo có
xiv Ďộ ẩm khác nhau. (B) Hàm lượng squalene thô thu Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%. (C) Hàm lượng squalene có mặt trong squalene thô thu Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%....................................................................................... 96 Hình 3.21. Ảnh hình thái tế bào S. mangrovei PQ6 sau 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C) và 6 h (D) có bổ sung KOH 45% và duy trì pH=10............................... 97 Hình 3.22. Hàm lượng squalene thô (A) và squalene có mặt trong squalene thô (B) tách chiết từ sinh khối khô và dịch lên men tế bào S. mangrovei PQ6......................................................................................................... 98 Hình 3.23. Sắc ký lớp mỏng xác Ďịnh squalene từ mẫu chuẩn và mẫu squalene thô của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau...................... 99 Hình 3.24. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và tinh sạch squalene thô qua cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là n- hexan/chloroform (9:1; v/v)................................................................... 100 Hình 3.25. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và tinh sạch squalene thô qua cột silica gel với dung môi rửa giải là n- hexane................................................................................................... 100 Hình 3.26. Quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6………………….. 102 Hình 3.27. Ảnh minh họa sản phẩm squalene thô (A), squalene tinh sạch và hỗn hợp acid béo (B) tách từ dịch lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất từ sinh khối tảo chủng PQ6……………………………………………… 103 Hình 3.28. Sắc ký Ďồ HPLC của squalene chuẩn (A) và squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6 (B)……………………………………… 104 Hình 3.29. Phổ 1H (A) và 13 C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S. mangrovei PQ6………………………………………………………………. 104 Hình 3.30. Hình ảnh Ďại thể và mô bệnh học vi thể - tương ứng (HE, x 400) của gan, thận, lách chuột tương ứng sau 60 ngày uống thuốc lô Ďối chứng (a, d, g, k), lô thí nghiệm 1 (b, e, h, l) và lô thí nghiệm 2 (c, f, i, m)…. 114 Hình 3.31. Tỷ lệ sống sót của tế bào HepG2 và RAW246.7 Ďược ủ với squalene ở các nồng Ďộ khác nhau……………………………………………… 117
xv Hình 3.32. Ảnh hưởng của thời gian ủ squalene sau 24 h (A), 48 h (B) và 72 h (C) lên khả năng tích lũy lipid trong tế bào gan HepG2 Ďược gây rối loạn chuyển hóa lipid…………………………………………………. 118 Hình 3.33. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrvei PQ6 lên sự tích lũy hàm lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm lipid bằng Oil Red O (C) trong tế bào HepG2…………………………………… 120 Hình 3.34. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 lên hàm lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm Oil Red O (C) trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7……………………………………….. 120 Hình 3.35. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện mRNA của các gen tham gia vào các quá trình trao Ďổi cholesterol trong tế bào HepG2 ..... 121 Hình 3.36. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện gen của LXR α (A) và LXR β (B) trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7…………………….. 122 Hình 3.37. Squalene Ďiều hòa quá trình vận chuyển ngược cholesterol và mức Ďộ biểu hiện các gen Ďích của LXRs trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7……………………………………………………………. 124 Hình 3.38. Ảnh hưởng của squalene trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride trong tế bào HepG2 ................................................................................ 125 Hình 3.39. Sơ Ďồ tóm tắt bước Ďầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………………………………………………... 126
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt Ďới rất Ďa dạng, phong phú về thành phần loài và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược.... Trong Ďó vi tảo với ưu Ďiểm chính là giàu dinh dưỡng, có kích thước tế bào nhỏ (< 10 µm) phù hợp với miệng của các ấu trùng thủy hải sản, dễ tiêu hóa, không Ďộc, có tốc Ďộ sinh trưởng cao và sức chống chịu cao với những Ďiều kiện khắc nghiệt của môi trường, Ďược coi là mắt xích Ďầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn biển. Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng cho người và Ďộng vật nuôi như: các loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein, các acid béo không bão hòa Ďa nối Ďôi (polyunsaturated fatty acid - PUFA)....Ďặc biệt là squalene. Squalene là một tripterpene tự nhiên, là tiền chất steroid của Ďộng, thực vật thường Ďược sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm và y học. Squalene Ďược ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học Ďã cho thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở Ďộng vật thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể do nó là một chất chống oxy hoá tự nhiên có vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt Ďộng của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) Ďã Ďược chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm Ďáng kể bệnh tim mạch và ung thư vì vậy, chúng cũng Ďược dùng phổ biến trong dược phẩm. Cho Ďến nay, các nguồn sản xuất squalene Ďược biết Ďến nhiều nhất là các loại dầu Ďộng, thực vật. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng Ďến sự bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng, mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn Ďến nguồn khai thác squalene Ďang dần cạn kiệt. Trong khi Ďó, hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm Ďang ngày càng tăng. Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống Ďể tách chiết squalene là rất cần thiết và Ďang Ďược các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong Ďó, vi sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô
2 lớn. Gần Ďây một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids Ďược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao trong Ďó có squalene. Tuy nhiên việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới Ďược bắt Ďầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban Ďầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có Ďược các phương pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có Ďược Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao; chưa có Ďược quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo Ďảm an toàn cho sử dụng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện Ďề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hƣớng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dƣợc phẩm”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Sàng lọc và xác Ďịnh Ďược Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam, tiềm năng lựa chọn Ďược cho sản xuất squalene. - Xác Ďịnh Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn Ďược; Ďánh giá Ďộ an toàn và tác dụng sinh học, dược lý của squalene tách chiết Ďược theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Sàng lọc Ďược chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam - Tối ưu Ďiều kiện nuôi cấy Ďể thu Ďược sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao ở chủng tiềm năng lựa chọn Ďược ở quy mô bình tam giác; bình lên men 30 Lít. - Tối ưu Ďiều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối chủng vi tảo biển lựa chọn Ďược; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene; xác Ďịnh Ďộ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết Ďược. - Đánh giá tính an toàn của squalene bao gồm Ďộc tính cấp và bán trường diễn, tác dụng sinh dược trên mô hình in vivo (mô hình Ďộng vật thực nghiệm). - Bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên mô hình in vitro (mô hình tế bào). 4. Những đóng góp mới của luận án - Luận án là công trình Ďầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về: sàng lọc; nuôi trồng chủng tiềm năng Schizochytrium mangrovei PQ6
3 có hàm lượng squalene cao (sản lượng squalene Ďạt Ďược sau quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất là 6,9 g/L); lựa chọn Ďược Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ chủng PQ6 có Ďộ tinh sạch Ďạt 90- 95%; squalene tách chiết Ďược là an toàn, có tác dụng làm giảm cholesterol tổng số và làm tăng hàm lượng lipoptrotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol ở mô hình Ďộng vật thực nghiệm, Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm. - Lần Ďầu tiên ở Việt Nam Ďã chứng minh Ďược squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 có tác dụng giảm cholesterol do tăng Ďiều hòa biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình hấp thu, vận chuyển, lưu thông cholesterol từ các mô ngoại biên Ďến tế bào gan; bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm triglyceride của squalene. 5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án - Có Ďược những dẫn liệu khoa học về Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng S. mangrovei PQ6 phân lập Ďược từ huyện Ďảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang vào năm 2006-2008 (lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất glucose 22% vào môi trường nuôi tại 36 h; bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45g/L; vitamin B6 - 45 g/L; và vitamin B12- 0,25g/L)) cho sinh trưởng Ďạt sinh khối khô (75,41±1,35) g/L, hàm lượng squalene Ďạt (91,53±2,45) mg/g sinh khối khô, sản lượng squalene Ďạt 6,9 g/L. - Có Ďược quy trình tách chiết lượng lớn squalene từ chủng S. mangrovei PQ6 có Ďộ tinh sạch cao 90- 95%, an toàn và Ďạt tiêu chuẩn Ďảm bảo chất lượng Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm. - Góp phần làm sáng tỏ squalene tách chiết từ chủng PQ6 có tác dụng giảm cholesterol và tryglycerol nội bào, tăng hàm lượng cholesterol gắn với lipoprotein có tỷ trọng cao, HDL-C và tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần trong máu; giảm cholesterol gắn với LDL-C và VLDL-C trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự phát triển cân nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride ở mô hình tế bào và Ďộng vật thực nghiệm; bước Ďầu Ďã cung cấp cơ sở khoa học cho việc Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm có. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 148 trang, trong Ďó phần mở Ďầu 3 trang; Tổng quan tài liệu 39 trang; Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22 trang; Kết quả và thảo luận 62 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình Ďã công bố 2 trang; Tài liệu tham khảo 18 trang gồm 179 tài liệu. Trong luận án có 19 bảng, 45 hình và 28 trang phụ lục.