Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền Trung Việt Nam

Chia sẻ: Dongcoxanh10 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:266

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền Trung Việt Nam" nhằm phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất của ba mẫu thuộc hai loài sên biển thu tại vùng biển Việt Nam. Phát hiện các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào từ các hợp chất phân lập được và nghiên cứu tác động của hoạt chất đến tế bào ung thư trong điều kiện in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền Trung Việt Nam

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Mai Hương NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ HAI LOÀI SÊN BIỂN Aplysia dactylomela VÀ Dendrodoris fumata Ở VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2022
2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Mai Hương NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ HAI LOÀI SÊN BIỂN Aplysia dactylomela VÀ Dendrodoris fumata Ở VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9.42.01.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Văn Thanh 2. PGS.TS. Đỗ Thị Thảo Hà Nội – 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Văn Thanh và PGS. TS. Đỗ Thị Thảo. Các số liệu, kết quả trong luận án hoàn toàn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Phạm Thị Mai Hương
ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng với sự hỗ trợ kinh phí thực hiện của đề tài VAST.TĐ.DLB.06/16-18. Trong quá trình thực hiện luận án, tác giả đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu từ các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Văn Thanh và PGS. TS. Đỗ Thị Thảo là những người thầy đã hết lòng tận tâm hướng dẫn chỉ dạy tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Tôi xin được chân thành cảm ơn tới Ban lãnh đạo và các cán bộ đồng nghiệp phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển, đặc biệt là GS. VS. Châu Văn Minh về sự chỉ bảo, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình thực hiện, hoàn thành luận án. Tôi xin được trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hóa sinh biển và Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập. Tôi xin trân trọng cảm ơn Phòng Hoạt chất sinh học – Viện Hóa Sinh biển, Phòng Thử nghiệm hoạt tính sinh học – Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu thử hoạt tính của hợp chất. Tôi xin được gửi lời biết ơn chân thành nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn quan tâm, động viên và khích lệ trong suốt quá trình thực hiện. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Phạm Thị Mai Hương
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.....……………………………………………………….……... i LỜI CẢM ƠN………………………………………………………….………...... ii MỤC LỤC ……………………………………………………………….………... iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ……………………………….…….. vii DANH MỤC BẢNG………………………………………………………….…… ix DANH MỤC HÌNH..………………………………………………………..…….. xi MỞ ĐẦU …………………………………………………………………….……. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ……………………………………………...………. 3 1.1 Ung thư và mối liên quan giữa tế bào ung thư với quá trình apoptosis..................................................................................................... 3 1.1.1. Khái niệm chung về ung thư………………………………………….…... 3 1.1.2. Apoptosis và tầm quan trọng của apoptosis………………………….…... 4 1.1.3. Mối liên quan giữa tế bào ung thư và quá trình apoptosis…………..…… 6 1.2. Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào..……….….…... 7 1.2.1. Thử nghiệm xác định hoạt tính gây độc tế bào bằng kỹ thuật MTT...... 7 1.2.2. Thử nghiệm xác định khả năng gây apoptosis thông qua sử dụng thuốc nhuộm Hoechst 33342……………………………………………….…… 8 1.2.3. Thử nghiệm xác định khả năng cảm ứng enzyme caspase-3…………...…. 9 1.2.4. Thử nghiệm đánh giá mức độ apoptosis của tế bào bằng kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào (flow cytometry)……………………….……. 10 1.3. Giới thiệu chung về sên biển………………………………..………….. 11 1.3.1. Đặc điểm sinh học của sên biển…………………………………….……. 11 1.3.2. Một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh phân lập từ sên biển…………………………………………………………………........ 13 1.3.3. Tổng quan về chi sên biển Aplysia……………………………………..…. 16 1.3.4. Tổng quan về chi sên biển Dendrodoris……………………………..……. 34 1.3.5 Tình hình nghiên cứu sên biển tại Việt Nam…………………………..…... 37
iv CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...………...… 39 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu.……………………………………..... 39 2.1.1. Mẫu sên biển A.dactylomela…………………………………….….......... 39 2.1.2. Mẫu sên biển D. fumata..……………………………………..................... 40 2.1.3. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………….…. 41 2.2. Phương pháp nghiên cứu…..……………………………………..…..… 41 2.2.1. Xử lý, tạo dịch chiết methanol của các mẫu sên biển nghiên cứu…….…… 41 2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất...…………………………….……... 42 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất………….……… 51 2.3.1. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonace spectrometry - NMR)………………………………………………….….. 51 2.3.2. Phương pháp phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)…………….….. 51 2.3.3. Một số phương pháp khác………………………………………………... 51 2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào ung thư…. 52 2.4.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư……………………………….…… 52 2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư (Phương pháp MTT)………………………………………………………………..…….. 52 2.4.3. Phương pháp đánh giá tác động cảm ứng apoptosis…………………...… 53 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………..…. 56 3.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài A. dactylomela thu tại vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế.......................................... 56 3.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài A. dactylomela thu tại vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa…………..............................….. 66 3.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài D. fumata thu tại vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa………………...….......................... 69 3.4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ các mẫu sên biển…………………………………………………............ 72 3.4.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ các loài A. dactylomela thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế….…............. 72 3.4.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ mẫu sên biển A. dactylomela thu tại tỉnh Thanh Hóa….…............. 74
v 3.4.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ mẫu sên biển D. fumata…………………………..…..................... 75 3.4.4. Đánh giá thử nghiệm hoạt tính cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư của hợp chất AD02 và hợp chất DN01..........………………………………... 75 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………….….... 84 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ mẫu sên biển A. dactylomela thu tại vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế.......... 84 4.1.1. Hợp chất mới ASP01……………………………………………………... 84 4.1.2. Hợp chất mới ASP02……………………………………………………... 86 4.1.3. Hợp chất mới ASP03……………………………………………………... 86 4.1.4. Hợp chất mới ASP05……………………………………………………... 87 4.1.5. Hợp chất mới ASP06……………………………………………………... 87 4.1.6. Hợp chất mới ASP08……………………………………………………... 88 4.1.7. Hợp chất mới ASP09……………………………………………………... 88 4.1.8. Hợp chất mới ASP12……………………………………………………... 89 4.1.9. Hợp chất mới ASP14……………………………………………………... 91 4.1.10. Hợp chất mới ASP15……………………………………………………... 91 4.1.11. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại………………………..……... 92 4.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ mẫu sên biển A. dactylomela thu tại vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa……............. 93 4.2.1. Hợp chất mới AD01………………………………………………..……... 93 4.2.2. Hợp chất mới AD02…………………………………………………..…... 94 4.2.3. Hợp chất mới AD03…………………………………………………..…... 96 4.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ mẫu sên biển D. fumata……………..……………………………………….................. 98 4.3.1. Hợp chất mới DN11…………………………………………………..…... 98 4.3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất còn lại…………………………………..... 100 4.4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất đã phân lập được từ sên biển A. dactylomela và D. fumata…................................ 101
vi 4.4.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài sên biển A. dactylomela thu tại biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế.......……..………………………………………................................. 101 4.4.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài sên biển A. dactylomela thu tại biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hoá.. 104 4.4.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài sên biển D. fumata thu tại biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa.......... 107 4.4.4. Đánh giá thử nghiệm hoạt tính cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư của hợp chất AD02 và DN01……………......................................................... 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………...……... 114 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN........................................................ 116 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ…………………………...… 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………...……. 118 PHỤ LỤC……………………………………………….......................................... -PL1-
vii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton 1 H- H COSY 1H-1H Chemical Shift 1 Phổ tương tác proton-proton Correlation Spectroscopy 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance Spectroscopy cacbon 13 đồng vị 5-EPA 5-Episinuleptolide acetate 5-Episinuleptolide acetate 6-OHDA 6-Hydroxydopamine 6-Hydroxydopamine AD Aplysia dactylomela was Aplysia dactylomela thu tại collected in Hon Me island, vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Thanh Hoa province Hóa ASP Aplysia dactylomela was Aplysia dactylomela thu tại collected in Lang Co, Thua vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thien Hue province Thiên Huế ATCC American Type Culture Ngân hàng chủng chuẩn của Collection Mỹ CC Chromatography column Sắc kí cột CD Circular dichroism Phổ lưỡng sắc tròn Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarization Transfer DISC Death-inducing signaling Phức hợp tín hiệu gây chết complex DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Môi trường Dulbecco’s Medium Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide DN Dendrodoris fumata was Dendrodoris fumata thu tại collected in Hon Me island, vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Thanh Hoa province Hóa DNA Deoxyribo Nucleic Acid Axit Deoxyribo Nucleic FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bò H2SO4 Sulfuric acid Axit Sunfuric HepG2 Human hepatocellular Tế bào ung thư biểu mô gan ở carcinoma cell người dòng HepG2 HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thư bạch cầu cấp ở người cell dòng HL-60 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết HPLC High Performance Liquid Sắc ký hiệu năng cao Chromatography HR-ESI-MS High Resolution Electrospray Phổ khối lượng phân giải cao Ionization Mass Spectrometry phun mù điện
viii HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 Coherence liên kết IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% KB Human epidemoid carcinoma Tế bào ung thư biểu mô ở cell người IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại LNCaP Lymph Node Carcinoma of Ung thư tiền liệt ở người the Prostate LC-MS Liquid chromatography-mass Sắc kí lỏng – phổ khối Spectroscopy LU-1 Human lung carcinoma Cell Tế bào ung thư phổi ở người dòng LU-1 MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú ở người dòng MCF-7 MDA-MB- Human breast cancer cell Tế bào ung thư vú ở người 231 dòng MDA-MB-231 MIC Minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration MS Mass Spectroscopy Khối phổ MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenylterazolium bromide 2,5-diphenylterazolium bromide NOESY Nuclear Overhauser Phổ NOESY Enhancement Spectroscopy PI3K/Akt An intracellular signaling Một đường tín hiệu nội bào pathway important in quan regulating the cell cycle trọng trong việc điều hòa chu kỳ tế bào PS Phosphatidylserine Phosphatidylserine SK-Mel-2 Human Melanoma cell Tế bào ung thư da ở người dòng SK-Mel-2 TNF Tumor Necrosis Factors Yếu tố hoại tử khối u TRAIL Tumor necrosis factor-related Phối tử kích hoạt apoptosis liên apoptosis-inducing ligand quan đến nhân tố hoạt tử khối u TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng
ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất đã được phân lập và nghiên cứu hoạt tính sinh học từ chi Sên biển Aplysia…………………………………………………. 18 Bảng 1.2. Các hợp chất đã được phân lập từ chi sên biển Dendrodoris............... 36 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP01……………………………… 57 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP02……………………………… 58 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP03……………………………… 59 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP05……………………………… 60 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP06……………………………… 61 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP08……………………………… 62 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP09……………………………… 63 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP12……………………………… 64 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP14……………………………… 65 Bảng 3.10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ASP15……………………………… 66 Bảng 3.11. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AD01……………….……………… 67 Bảng 3.12. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AD02………………….…………… 68 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AD03…………………….………… 69 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất DN01………………..……………… 71 Bảng 3.15. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào của các hợp chất ASP………………………………………………...…………… 73 Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào của hợp chất AD………………………………………………………………........ 74 Bảng 3.17. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào của các hợp chất DN……………………………………………………….……… 75 Bảng 3.18. Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của hợp chất AD02 ở các nồng độ khác nhau (AD02 0 µg/mL, AD02 0.34µg/mL, AD02 0.68µg/mL) trên dòng tế bào ung thư gan HepG2…….………………………… 78 Bảng 3.19. Tỉ lệ tế bào apoptosis dưới tác động của hợp chất DN01 ở các nồng độ khác nhau (DN01 0 µg/mL, DN01 10 µg/mL, DN01 5 µg/mL) trên dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp ở người HL-60….......……………... 84
x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Phân chia tế bào bình thường và tế bào ung thư [8]……….….......... 3 Hình 1.2. Các con đường bên ngoài và bên trong của apoptosis [14]………... 5 Hình 1.3. Các cơ chế làm giảm quá trình apoptosis và gây ung thư [16].......... 7 Hình 1.4. Mối quan hệ phát sinh loài giữa các bộ phận phân loại hiện được công nhận đối với Nudibranchia và được sử dụng trong tổng quan này. Các nhánh được kết thúc bằng các siêu họ (được gạch dưới), trong khi các gốc đại diện cho các phân chia phân loại [37]……..... 13 Hình 1.5. Hợp chất jorumycin, safracin và sên biển Jorunna funebris............. 15 Hình 1.6. Hợp chất monomethyl auristatin E và thuốc Brentuximab vedotin.. 16 Hình 1.7. Bản đồ phân bố sên biển Aplysia [38]…………………………..... 17 Hình 1.8. Cấu trúc minh họa một số hợp chất acetogenin phân lập từ loài sên biển A. dactylomela…………………………….......…................... 24 Hình 1.9. Cấu trúc minh họa một số hợp chất alkaloid phân lập từ loài sên biển A. dactylomela…………………………….......….................. 24 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học một số hợp chất monoterpene phân lập từ loài sên biển A. dactylomela ………………………………….................... 25 Hình 1.11. Apoptosis trong tế bào bệnh bạch cầu ở người HL 60 (a-c) và THP 1 (d-f) trong nhóm đối chứng (a, d) và dactylone nồng độ 4080 µmol/L (b, e) và 80 µmol/L (c, f) ……………………...….............. 29 Hình 1.12. Cấu trúc hóa học một số hợp chất sesquiterpene phân lập từ loài sên biển A. dactyolomela…………………………………............ 32 Hình 1.13. Cấu trúc hóa học một số hợp chất diterpene phân lập từ loài sên biển A. dactylomela………………………………….................... 33 Hình 1.14. Cấu trúc hóa học một số hợp chất triterpenoid phân lập từ sên biển A. dactylomela…………………………………........................... 34 Hình 1.15. Cấu trúc hóa học một số hợp chất phân lập từ chi Dendrodoris...... 37 Hình 1.16. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài sên biển Phyllidiella pustulosa thu tại Việt Nam…………………................................... 38
xi Hình 2.1. Mẫu sên biển A. dactylomela thu tại vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế…………………............................................................ 39 Hình 2.2. Mẫu sên biển A. dactylomela thu tại vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa………………........................................................................... 40 Hình 2.3. Mẫu sên biển D. fumata thu tại vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa………………........................................................................... 40 Hình 2.4. Sơ đồ mô tả quá trình chiết và thu được các phân đoạn chiết từ sên biển A. dactylomela.(ASP)............................................................... 43 Hình 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài sên biển A. dactylomela (ASP).. 45 Hình 2.6. Sơ đồ mô tả quá trình chiết và thu được các phân đoạn chiết từ sên biển A. dactylomela (AD) ............................................................... 47 Hình 2.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài sên biển A. dactylomela (AD)... 48 Hình 2.8. Sơ đồ mô tả quá trình chiết và thu được các phân đoạn chiết từ sên biển D. fumata (DN) …………………………….......................... 48 Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các chất từ sên biển D. fumata (DN) …................. 50 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài A. dactylomela thu tại Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế……………………………... 56 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài A. dactylomela thu tại Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa…………………………………… 66 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài D. fumata ….. 70 Hình 3.4. Ảnh hưởng của hợp chất AD02 ở các nồng độ khác nhau (A: 0 µg/mL (0 µM); B: 0.685 µg/mL (2.5 µM), C: 1.73 µg/mL (5 µM)) đến sự thay đổi hình thái của tế bào HepG2 sau 48h tác động. Kính hiển vi được quan sát dưới độ phóng đại 40X. Mũi tên chỉ ra các tế bào chết do apoptosis với những điểm đặc trưng thay đổi hình thái tế bào: tế bào cô đặc, nhân phân 76 mảnh........….................................... Hình 3.5. Tác động của hợp chất AD02 đến quá trình apoptosis tế bào HepG2 thông qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit của Invitrogen sau 48h điều trị ở tại các nồng độ khác (AD02 0 µg/mL, AD02 0.685 µg/mL, AD02 1.73 µg/mL). Trong đó, các
xii mẫu thử được phân tích bằng hệ thống flowcytometry Novocyte (ACE Biosciences Inc.) và phần mềm NovoExpress. Trục x thể hiện mức độ nhuộm mầu Annexin V, trục y thể hiện mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log. Q2-1 hoại tử, Q2-2 apoptosis muộn, Q2- 4 apoptosis sớm, và Q2-3 tế bào sống.............................................. 77 Hình 3.6. Tỉ lệ phần trăm của quần thể tế bào ung thư gan HepG2 ở các nồng độ điều trị với hợp chất AD02 khác nhau (AD02 0 µg/mL, AD02 0.685µg/mL, AD02 1.73µg/mL). Các giá trị được trình bày dưới dạng trung bình (n = 3) ± SD; * P
xiii Hình 3.10. Khả năng cảm ứng tế bào HL-60 sản sinh caspase-3của mẫu DN01 ở các nồng độ khác nhau (DN01 0 µg/mL, DN01 10 µg/mL, DN01 5µg/mL) sau 24h điều trị; Nước muối bình thường được dùng như một biện pháp kiểm soát mẫu đối chứng âm; Mỗi giá trị đại diện cho trung bình ± SD; * P
xiv Hình 4.19. Cấu trúc và các tương tác COSY (▬) và HMBC (→) chính của AD02………………………………………………………........... 95 Hình 4.20. Một số tương tác NOESY chính của AD02………………............ 95 Hình 4.21. Cấu trúc và các tương tác COSY (▬) và HMBC (→) chính của AD03………………………………………………………........... 96 Hình 4.22. Một số tương tác NOESY chính của AD03………………….......... 97 Hình 4.23. Đường ECD thực nghiệm và tính toán theo lý thuyết của AD03………………………………………………………........... 97 Hình 4.24. Phổ CD thực nghiệm của AD03……………………...................... 98 Hình 4.25. Cấu trúc hợp chất DN01 và hợp chất chaxine A .........……….......... 99 Hình 4.26. Các tương tác chính COSY (▬) và HMBC (→), NOESY của DN01............................................................................................... 99 Hình 4.27. Phổ CD của hợp chất DN01.............................................................. 100 Hình 4.28. Cấu trúc hóa học của các hợp chất DN02, DN03, DN04, DN05, DN06, DN07, DN08 và DN09 phân lập từ loài D. fumata................ 101 Hình 4.29. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASP06 và ASP08............................. 103 Hình 4.30. Cấu trúc hóa học của hợp chất AD02 và ASP03............................... 105 Hình 4.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất AD01 và AD02................................. 105 Hình 4.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất AD01 và hợp chất acaciicolide A... 106 Hình 4.33. Cấu trúc hóa học của hợp chất DN01 và hợp chất chaxine A......... 108
1 MỞ ĐẦU Xã hội ngày một phát triển thì con người càng quan tâm tới sức khỏe, phòng chống bệnh tật đã trở thành nhu cầu thiết yếu. Loài người đang đối mặt với nhiều căn bệnh nguy hiểm đặc biệt là ung thư. Bởi vậy việc tìm kiếm thuốc đặc trị cũng như thuốc hỗ trợ điều trị và các tác nhân dự phòng hóa học là rất cần thiết và cấp bách. Thống kê từ năm 1946 đến năm 2019 đã có 13,5% thuốc chống ung thư được phê duyệt có nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên và 25,1% các dẫn xuất của sản phẩm tự nhiên [1], điều đó cho thấy vai trò thiết yếu của các sản phẩm tự nhiên trong sản xuất thuốc chống ung thư. Sàng lọc tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng diệt tế bào ung thư từ tự nhiên là bước đi đầu tiên nhưng là bắt buộc đối với quá trình phát triển thuốc mới. Đến cuối năm 2020, có chín loại thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ biển, trong đó có 4 loại thuốc có chứa hợp chất là dẫn xuất từ sên biển đã được đưa ra thị trường và nhiều hợp chất đang được tiến hành nghiên cứu thử nghiệm [2]. Có thể thấy nguồn dược liệu biển trong đó sên biển thực sự chứa đựng những tiềm năng và triển vọng cho việc nghiên cứu đưa ra các sản phẩm phục cộng đồng [3, 4]. Việt Nam có vùng biển rộng lớn 1.000.000.000 km2 và bờ biển dài trên 3.200 km có tiềm năng lớn trong việc khai thác với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú cả về thành phần loài và trữ lượng. Rất nhiều công trình nghiên cứu đã công bố liên quan đến thu nhận, tách chiết, xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất từ nguồn sinh vật biển Việt Nam. Sên biển là một nhóm động vật biển thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới. Cho đến nay đã có nhiều bài báo trên thế giới công bố về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ sên biển. Tuy nhiên ở nước ta với tiềm năng lớn về số lượng sên biển cũng như đa dạng loài trong đó 2 loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendroris fumata có trữ lượng lớn nhưng hiện mới chỉ có một bài báo công bố bước đầu về hợp chất phân lập từ sên biển. Chính vì vậy đề tài luận án “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ hai loài sên biển Aplysia dactylomela và Dendrodoris fumata ở vùng biển miền Trung Việt Nam” được tiến hành nhằm góp phần bổ sung
2 những dữ liệu khoa học mới và nâng cao khả năng sử dụng nguồn dược liệu sên biển Việt Nam trong nghiên cứu hóa dược. Mục tiêu đề tài luận án Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất của ba mẫu thuộc hai loài sên biển thu tại vùng biển Việt Nam. Phát hiện các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào từ các hợp chất phân lập được và nghiên cứu tác động của hoạt chất đến tế bào ung thư trong điều kiện in vitro. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hai loài sên biển Aplysia dactylomela Rang, 1828 (thu thập tại vùng biển Lăng Cô tỉnh Thừa Thiên Huế và thu thập tại vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa), Dendrodoris fumata Ruppell & Leuckart, 1831 (thu thập tại vùng biển Hòn Mê tỉnh Thanh Hóa). Nội dung luận án 1, Phân lập các hợp chất từ ba mẫu sên biển thuộc hai loài sên biển A. dactylomela và D. fumata bằng phương pháp sắc ký. 2, Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học. 3, Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được. 4, Đánh giá tác động cảm ứng apoptosis trong tế bào của một số hợp chất tiêu biểu trên một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Ung thư và mối liên quan giữa tế bào ung thư với quá trình apoptosis 1.1.1. Khái niệm chung về ung thư Ung thư là một nhóm gồm khoảng 200 loại bệnh có liên quan tới sự phân chia tế bào một cách không có tổ chức và những tế bào này có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô bên cạnh hoặc di chuyển đến mô xa (di căn) [5, 6]. Theo Viện Ung thư Quốc Gia Hoa Kỳ thì các tế bào khối u đều xuất phát từ những tế bào của cơ thể, nhưng chúng không ngừng tăng sinh và lan rộng; có thể do sự mất cân bằng sinh lý, các tế bào già nua, bị lỗi hoặc bị hư tổn vẫn tiếp tục sống khi chúng cần phải chết và trong khi các tế bào mới hình thành khi cơ thể không cần đến chúng. Những sự bất thường này có thể xảy ra ở bất cứ tế bào nào trong hàng tỉ tế bào của cơ thể [7]. Hình 1.1. Phân chia tế bào bình thường và ung thư [8] 1.1.2. Apoptosis và tầm quan trọng của apoptosis Mục đích của hầu hết các loại thuốc hóa trị liệu ung thư hiện đang được sử dụng hỗ trợ hoặc điều trị ung thư là tiêu diệt các tế bào khối u ác tính bằng cách ức chế một số cơ chế liên quan tới quá trình phân chia tế bào. Một trong những cơ chế của thuốc chống ung thư hiện đang được nghiên cứu là tìm hướng tác động kích hoạt quá trình tự chết của tế bào (apoptosis).
4 Apoptosis là quá trình (hay chương trình) tự chết của tế bào ở dạng đã được lập trình từ trước. “Apoptosis” có nghĩa cây rụng lá vào mùa thu trong tiếng Hy Lạp. Sự ức chế apoptosis có thể là nguyên nhân của nhiều loại bệnh như bệnh tự miễn dịch, bệnh do nhiễm virus, bệnh sưng viêm, và ung thư. Ban đầu các khối u được tạo ra là do sự tăng sinh của tế bào, tuy nhiên theo các công bố trước đây cho thấy sự làm giảm tốc độ chết của tế bào cũng được xem xét như nguyên nhân của hiện tượng này. Hay là sự biểu hiện quá mức của protein ức chế apoptosis của tế bào (IAP). Do vậy, định hướng nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay là tìm kiếm các hợp chất có khả năng điều trị theo cơ chế cảm ứng và kích hoạt quá trình apoptosis. Từ thế kỷ XIX apoptosis đã nhận được sự quan tâm của các nhà sinh học. Năm 1842, Carl Vogt người Đức là nhà khoa học đầu tiên mô tả về các nguyên tắc về apoptosis [9]. Năm 1858, Rudolph Virchow đã mô tả một dạng tế bào chết tự nhiên khác biệt với hoại tử (necrosis) và gọi nó là necrobiosis [10]. Việc mô tả chính xác hơn về apoptosis xuất hiện vào năm 1885 bởi Walther Flemming và đặt tên là tế bào chết tự nhiên chromatolysis [9]. Glücksmann (1951) đã mô tả “karyorrhexis” và “karyopyknosis” như các dạng khác nhau của tế bào chết tự nhiên mà hiện nay chúng ta biết đến nó có liên quan đến quá trình apoptosis [11]. Năm 1965, nhà nghiên cứu bệnh học người Úc John F. Kerr đã quan sát thấy một dạng tế bào chết bất thường sau chấn thương thiếu máu cục bộ của mô gan, nơi các thành phần của tế bào dường như vẫn còn nguyên vẹn. Ông đã sử dụng thuật ngữ hoại tử co rút (shrinkage necrosis) để xác định dạng chết tế bào này và đã bắt đầu sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát hình thái sớm của các dạng ngưng tụ của tế bào chất và chất nền nhân. Ông cũng cho rằng những tế bào chết tự nhiên này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo phôi và phát triển của động vật có xương sống [12]. Sau đó đến năm 1972, Kerr và cộng sự lần đầu tiên sử dụng tên apoptosis như một quá trình của sự chết tế bào tự nhiên [13]. Năm 2002, giải Nobel y học đã được trao cho Sydney Brenner, Robert Horvitz và John Suston bởi những đóng góp của họ trong nghiên cứu về apoptosis. Điều này cho thấy tầm quan trọng của những kết quả nghiên cứu trong hai thập kỷ về các quá trình di truyền và sinh hóa liên quan đến quá trình apoptosis và ý nghĩa của nó với nền y học thế giới.