Luận án Tiến sĩ Vật lý Kỹ thuật: Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học trên cơ sở công nghệ polyme in phân tử ứng dụng phát hiện một số phân tử nhỏ (protein, kháng nguyên, kháng sinh)

Chia sẻ: Bobietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:188

Thêm vào BST

Báo xấu

47
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là phát triển công nghệ polyme in phân tử (MIP) chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo trên điện cực mực in các bon phủ hạt nano vàng ứng dụng trong cảm biến sinh học phát hiện định lượng phân tử nhỏ. Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa (EIS) sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo MIP phát hiện protein (sarcosine và 17β-estradiol), kháng nguyên Enrofloxacin và kháng sinh trong nước hồ nuôi thủy sản và trong dược phẩm. Phát triển công nghệ vi lưu ly tâm, chế tạo chíp CMF gắn vi mẫu linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM hướng tới tự động hóa quy trình chế tạo cũng như quá trình đo đạc của cảm biến sử dụng đầu thu MIP

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Vật lý Kỹ thuật: Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học trên cơ sở công nghệ polyme in phân tử ứng dụng phát hiện một số phân tử nhỏ (protein, kháng nguyên, kháng sinh)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHÍ VĂN TOÀN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -------------------------------- PHÍCẢM NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO VĂN BIẾN TOÀNSINH HỌC TRÊN CƠ SỞ CÔNG NGHỆ POLYME IN PHÂN TỬ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN MỘT SỐ PHÂN TỬ NHỎ (PROTEIN, KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG SINH) LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ KỸ THUẬT Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHÍ VĂN TOÀN NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ CÔNG NGHỆ POLYME IN PHÂN TỬ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN MỘT SỐ PHÂN TỬ NHỎ (PROTEIN, KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG SINH) Ngành: Vật lý Kỹ thuật Mã số: 9520401 LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS Trương Thị Ngọc Liên 2. PGS.TS Yuzuru TAKAMURA Hà Nội - 2021
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội và Viện Vật lý Kỹ thuật đã tạo điều kiện cho tác giả trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả xin bày tỏ lời cám ơn chân thành và sự kính trọng đối với tập thể hướng dẫn PGS.TS Trương Thị Ngọc Liên trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, GS.TS Yuzuru TAKAMURA, Nhật Bản người đã hướng dẫn tác giả thực hiện bản Luận án này. Thầy cô đã tận tình chỉ bảo, định hướng và hướng dẫn về mặt khoa học để tác giả có thể hoàn thành luận án tiến sĩ. Những kiến thức mà tác giả tiếp nhận được không chỉ là bản Luận án mà trên hết là cách nhìn nhận, đánh giá cũng như phương thức giải quyết các vấn đề khoa học và sự trải nghiệm của cuộc sống. Tác giả xin chân thành cảm ơn các thành viên trong phòng thí nghiệm Cảm biến Sinh học (BioGroup) - Bộ môn Vật liệu Điện tử, phòng thí nghiệm của GS. Yoshiakia Ukita thuộc Đại học Yamanashi Nhật Bản, Công ty Cổ phần KHKT Bách Khoa, Công ty Cổ phần Sáng Tạo Bách Khoa đã giúp đỡ về trang thiết bị phụ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả thực hiện các thí nghiệm trong thời gian nghiên cứu. Đề tài này được thực hiện dưới sự hỗ trợ của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc Gia (NAFOSTED), mã số 103.99-2017.333 Tiếp theo, tác giả cũng xin được cảm ơn tới tập thể các thầy cô, anh chị và bạn bè đồng nghiệp trong Bộ môn Vật liệu điện tử - Viện Vật lý Kỹ thuật - ĐH BKHN, Viện Hóa học - ĐH BKHN, đã hỗ trợ và đóng góp những ý kiến quí báu về mặt chuyên môn trong quá trình thực hiện nhiệm vụ nghiên cứu sinh và hoàn thành bản luận án. Cuối cùng, tác giả muốn dành lời cảm ơn cho những người thân yêu nhất của tôi. Bản Luận án này là món quà quý giá tôi xin được tặng cho gia đình và cha mẹ thân yêu của tôi. Hà Nội, ngày ....... tháng ....... năm 2021 Tác giả Phí Văn Toàn i
LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tác giả thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Trương Thị Ngọc Liên và GS. TS Yuzuru TAKAMURA. Các số liệu và kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả khác công bố trong bất kỳ công trình nào. Tất cả các công trình đã công bố chung với thầy hướng dẫn khoa học và đồng nghiệp đều được sự đồng ý của các tác giả trước khi đưa vào luận án. Hà Nội, ngày…… tháng……năm 2021 TM tập thể hướng dẫn Tác giả luận án PGS.TS Trương Thị Ngọc Liên Phí Văn Toàn ii
MỤC LỤC MỤC LỤC............................................................................................................................iii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT...................................................................vii DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................................xi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ...........................................................................xii ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................7 1.1. Cảm biến sinh học điện hóa ...........................................................................................7 1.1.1. Điện cực điện hóa...........................................................................................7 1.1.2. Cảm biến phổ tổng trở điện hóa.......................................................................9 1.2. Công nghệ polyme in phân tử (MIP) ............................................................................14 1.2.1. Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ MIP .......................................... 15 1.2.2. Nguyên lý đánh dấu phân tử ................................................................................ 17 1.2.3. Thành phần của MIPs...................................................................................19 1.2.3.1. Khuôn................................................................................................19 1.2.3.2. Các monome chức năng.......................................................................20 1.2.3.3. Các liên kết chéo.................................................................................21 1.2.3.4. Tác nhân Porogen (tạo xốp).................................................................22 1.2.3.5. Chất khơi mào.....................................................................................23 1.2.4. Ưu điểm của công nghệ MIP.........................................................................24 1.2.5. Ứng dụng.....................................................................................................24 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................26 2.1. Hóa chất và thiết bị .......................................................................................................26 2.1.1. Hóa chất......................................................................................................26 2.1.2. Vật tư, thiết bị..............................................................................................27 2.2. Quy trình công nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo MIP ......................................27 2.2.1. Chuẩn bị điện cực in carbon biến tính hạt vàng (AuNPs-SPCE).......................28 2.2.2. Tạo lớp màng SAM (p-ATP) trên điện cực AuNPs-SPCE................................29 2.2.3. Gắn các phân tử chất in vào màng SAM.........................................................30 2.2.4. Tạo màng polyme MIP.................................................................................30 2.2.4.1. Cảm biến ENRO-MIP..........................................................................31 iii
2.2.4.2. Cảm biến Chloramphenicol (CAP)-MIP................................................33 2.2.4.3. Cảm biến Norfloxacin (NOR)-MIP.......................................................33 2.2.4.4. Cảm biến Ciprofloxacin (CF)-MIP.......................................................34 2.2.5. Loại bỏ các phân tử chất in ra khỏi màng polyme MIP....................................37 2.3. Quy trình phân tích dư lượng và hàm lượng kháng sinh Norfloxacin .........................37 2.3.1. Phân tích dư lượng kháng sinh NOR trong nước hồ nuôi thủy sản....................37 2.3.2. Phân tích hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong dược phẩm........................39 2.4. Các thông số đánh giá hoạt động của cảm biến ...........................................................41 2.4.1. Độ nhạy của cảm biến...................................................................................41 2.4.2. Khoảng tuyến tính của cảm biến....................................................................41 2.4.3. Độ lặp lại của cảm biến.................................................................................42 2.4.4. Giới hạn phát hiện của cảm biến....................................................................42 2.4.5. Độ chọn lọc của cảm biến.............................................................................42 2.5. Các phương pháp nghiên cứu .......................................................................................42 2.5.1. Phương pháp phân tích phổ Raman................................................................42 2.5.2. Phương pháp phân tích phổ UV-VIS..............................................................43 2.5.3. Phương pháp phân tích HPLC.......................................................................45 2.5.4. Phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa...........................................................47 CHƯƠNG 3. CẢM BIẾN MIP/EIS PHÁT HIỆN PROTEIN PHÂN TỬ NHỎ SARCOSINE VÀ 17-ESTRADIOL.................................................................50 3.1. Cảm biến Sarcosine-MIP/EIS ......................................................................................51 3.1.1. Ảnh hưởng của vật liệu đế lên sự hình thành màng polyme MIP......................51 3.1.2. Phân tích đặc tính điện hóa của cảm biến qua các bước trong quy trình công nghệ ........................................................................................................................ 54 3.1.3. Khảo sát hoạt động của cảm biến sarcosine-MIP/SPAuE.................................57 3.1.4. Đánh giá hoạt động của cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE.......................59 3.1.4.1. Ảnh hưởng của số vòng quét tạohạt vàng trên điện cực SPCE.................60 3.1.4.2. Ảnh hưởng của số vòng quét tổng hợp polyme MIP................................61 3.1.5. Xây dựng đường đặc trưng chuẩn của cảm biến sarcosine-MIP (NIP)/AuNPs- SPCE...............................................................................................................63 3.1.6. Khảo sát độ lặp lại và độ ổn định của cảm biến...............................................65 3.1.7. Tính chọn lọc của cảm biến...........................................................................66 iv
3.2. Cảm biến 17-estradiol (E2) ........................................................................................68 3.2.1. Khảo sát hình thái màng E2-MIP bằng phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM)..............................................................................................................68 3.2.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến E2-MIP/EIS................................................68 3.2.3. Khảo sát đặc tính chọn lọc của cảm biến E2-MIP............................................70 CHƯƠNG 4. CẢM BIẾN MIP/EIS PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN ENROFLOXACIN .............................................................................................................................72 4.1. Khảo sát hoạt động của cảm biến miễn dịch sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên .........73 4.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến xác định kháng nguyên ENRO sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP ...........................................................................................76 4.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của độ dày màng polyme đến độ nhạy của cảm biến.....76 4.2.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến xác định kháng nguyên ENRO sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP............................................................................77 4.2.3. Đặc trưng quang phổ Raman.........................................................................79 4.3. Cảm biến điện hóa enzyme HRP-SAM và HRP-MIP ..................................................82 4.3.1. Cảm biến enzyme HRP-SAM/AuNPs/SPCE xác định H2O2.............................83 4.3.2. Cảm biến enzyme HRP-MIP/AuNPs/SPCE nhận biết enzyme HRP.................85 CHƯƠNG 5. CẢM BIẾN MIP/EIS PHÁT HIỆN KHÁNG SINH TRONG NƯỚC HỒ NUÔI THUỶ SẢN, DƯỢC PHẨM....................................................................88 5.1. Cảm biến CAP-MIP/EIS ..............................................................................................89 5.1.1. Đặc trưng của cảm biến CAP-MIP.................................................................89 5.1.2. Hoạt động của cảm biến................................................................................91 5.1.3. Độ chọn lọc của cảm biến.............................................................................91 5.2. Cảm biến NOR-MIP/EIS ..............................................................................................92 5.2.1 Đặc trưng của cảm biến NOR-MIP/EIS...........................................................92 5.2.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến NOR-MIP/EIS............................................97 5.2.3. Độ lặp lại của cảm biến...............................................................................100 5.2.4. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến...........................................................102 5.2.5. Độ chọn lọc của cảm biến...........................................................................104 5.3. Xác định dư lượng kháng sinh Norfloxacin trong nước hồ nuôi thủy sản .................105 5.3.1. Kết quả phân tích sử dụng cảm biến NOR-MIP/EIS......................................105 5.3.2. Kết quả phân tích sử dụng phương pháp HPLC.............................................107 5.4. Xác định hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong dược phẩm ................................108 v
5.4.1. Kết quả phân tích sử dụng cảm biến NOR-MIP/EIS......................................108 5.4.2. Kết quả phân tích sử dụng quang phổ UV-VIS..............................................110 5.5. Cảm biến CF-MIP ......................................................................................................112 5.5.1. Khảo sát hình thái bề mặt điện cực cảm biến.................................................112 5.5.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến với đầu thu CF-MIP chế tạo theo phương pháp 1.................................................................................................................... 113 5.5.2.1. Đặc trưng phổ tán xạ Raman..............................................................113 5.6.2.2. Xây dựng đường chuẩn của cảm biến sử dụng đầu thu CF-MIP bằng phương pháp phổ tổng trở điện hóa.....................................................114 5.5.3. Khảo sát hoạt động của cảm biến với đầu thu CF-MIP chế tạo theo phương pháp 2.................................................................................................................... 120 5.5.3.1. Xây dựng đường chuẩn của cảm biến CF-MIP/EIS..............................120 5.5.3.2. Xác định dư lượng kháng sinh CF trong mẫu nước hồ nuôi thủy sản.....122 5.6. Công nghệ vi lưu kết hợp quay ly tâm gắn vi mẫu lên điện cực cảm biến ................124 5.6.1. Đặt vấn đề.................................................................................................124 5.6.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của dòng dung dịch trong buồng phản ứng CMF.........127 5.6.4. Khảo sát hoạt động của cảm biến MIP-QCM sử dụng CMF trong quy trình chế tạo..................................................................................................................130 KẾT LUẬN........................................................................................................................137 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................138 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN.............................150 PHỤ LỤC...............................................................................................................................a PHỤ LỤC C5.1.......................................................................................................a PHỤ LỤC C5.2.......................................................................................................c PHỤ LỤC C5.3.......................................................................................................d PHỤ LỤC C5.4.......................................................................................................e PHỤ LỤC C5.5.......................................................................................................g PHỤ LỤC C5.6.......................................................................................................h PHỤ LỤC C5.7........................................................................................................i PHỤ LỤC C5.8........................................................................................................j PHỤ LỤC C5.9.......................................................................................................k vi
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Ab Antibody Kháng thể AE Auxiliary electrode Điện cực phụ trợ AFP Alpha-fetoprotein Alpha-fetoprotein Ag Antigen Kháng nguyên ATTP Food safety An toàn thực phẩm AuNPs Gold nano-particles Hạt nano vàng BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò CA Chronoamperometry Kỹ thuật dòng – thời gian CAP Chloramphenicol Chloramphenicol CE Courter electrode Điện cực đối CF Ciprofloxacin Ciprofloxacin Cơ quan thanh tra thực phẩm CFIA Canadian Food Inspection Agency Canada CMF Chip Microfluidic Centrifugation Chíp vi lưu kết hợp quay ly tâm CV Cyclic voltammetry Kỹ thuật quét điện thế tuần hoàn Australian Department of Agriculture, Bộ nông lâm ngư nghiệp DAFF Forestry and Fisheries Australia DNA Deoxyribo nucleic acid Axít deoxyribonucleic DPV Different pulse voltammetry Kỹ thuật dòng-thế xung vi phân Da Dalton Dalton 1-ethyl-3-(3- 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) EDC dimethylaminopropyl) carbodimide carbodimide EDS Energy dispertive spectroscopy (EDS) Phổ tán xạ năng lượng vii
Electrochemical impedance spectroscopy EIS Phổ tổng trở điện hóa (EIS) ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Xét nghiệm ELISA ENRO Enrofloxacin Enrofloxacin EST Estradiol Estradiol FAD Flavin adenine dinucleotide Flavin adenine dinucleotide FDA Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thực phẩm Japan Food Chemical Research Tổ chức nghiên cứu hóa chất JFCRF Organization thực phẩm Nhật bản GCE Glassy carbon electrode Điện cực các bon thủy tinh GDH Glucose dehydrogenase Enzyme glucose dehydrogenase GMC Graphitized mesoporous carbon Các bon lỗ xốp trung bình GOx Glucose oxidase Enzyme glucose oxidase hCG Human chorionic gonadotropin Human chorionic gonadotropin HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao Xét nghiệm sắc ký miễn dịch sử IGCA Immunogold chromatographic assay dụng hạt vàng Internatonal union of pure and applied Hiệp hội Quốc tế về hóa học và IUPAC chemistry hóa học ứng dụng Liquid chromatography mass LCMS Sắc ký lỏng khối phổ spectrometry LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện mAb monoclonal antibody Kháng thể đơn dòng MHDA 16-Mercaptohexadecanoic acid Axít 16-mercaptohexadecanoic MIP Molercularly imprinted polyme Polyme in phân tử Asymmetric stationary phase molecular Polyme in phân tử pha tĩnh bất MIP-CSP printing polymes đối viii
MUA 11-Mercaptoundecanoic acid Axít 11-mercaptoundecanoic MRL Maximum residue limit Giới hạn dư lượng tối đa Quality Management Department of Cục quản lý chất lượng Nông NAFIQAD Agro-Forestry and Fisheries lâm sản và Thủy sản NHS N-Hydroxysuccinimide N-Hydroxysuccinimide MIP Molecularly imprinted polymes Polyme in phân tử NIP Molecularly non-imprinted polyme Polyme không in phân tử NOR Nofloxacin Nofloxacin ODN Oligo deoxyribo nucleotide Oligo deoxyribo nucleotide Pa Pyrrole-2-cacboxylic acid Axit pyrole-2-cacboxylic p-ATP Para-aminothiophenol Para-aminothiophenol PBS Phosphate buffered saline Đệm chứa muối phosphat PCR Polymease chain reaction Phản ứng chuỗi polymease PEGDGE Poly(ethylene glycol)diglycidyl Poly (ethylene glycol) diglycidyl PL Photoluminescence Kỹ thuật phổ huỳnh quang PPa Polypyrrole cacboxylic acid Axit cacboxylic polypyrrole ppb Parts Per Billion Nồng độ phần tỷ ppm Parts Per Million Nồng độ phần triệu PPy Polypyrrole Polypyrrole Điện cực mực in biến tính hạt SPAuE Gold particle modified ink electrode vàng SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn SPCE Carbon ink electrode Điện cực mực in các bon PSA Prostate specific antigen Prostate specific antigen Py Pyrrole Pyrrole ix
QCM Quartz crystal microbalance Vi cân tinh thể thạch anh RE Reference electrode Điện cực so sánh RNA Ribo nucleic acid Axít ribo nucleic Màng đơn lớp phân tử tự lắp SAM Self assembled monolayer ghép Sự tiến hóa có hệ thống của phối Systematic evolution of ligands by SELEX tử bằng cách làm giàu theo cấp exponential enrichment số nhân SEM Scanning electron microscopy Hiển vi điện tử quét SPAuE Screen-printed gold electrode Điện cực in lưới mực in vàng SPCE Screen-printed carbon electrode Điện cực in lưới mực in các bon Kỹ thuật cộng hưởng plasmon SPR Surface plasmon resonance bề mặt STDEV Standard deviation Độ lệch chuẩn SWSV Square wave stripping voltammetry Kỹ thuật xung vuông quét nhanh UTTLT Prostate cancer Ung thư tiền liệt tuyến Fourier transform infrared-attenuated total Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR-ATR reflectance phản xạ WE Working electrode Điện cực làm việc x
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Điện cực điện hóa trong cảm biến sinh học điện hóa............................................7 Bảng 3.1. Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của cảm biến MIP/AuNPs/SPCE sau mỗi bước biến tính.........................................................55 Bảng 3.2. Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của cảm biến MIP/SPAuE và NIP/SPAuE................................................................................56 Bảng 3.3. Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của cảm biến MIP (7 CVs)/SPAuE và MIP (5 CVs)/SPAuE................................................................57 Bảng 3.4. Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của các cảm biến MIP/ AuNPs/SPCE với số vòng quét biến tính hạt vàng khác nhau 10-15-20 CVs.. . .58 Bảng 3.5. Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của các cảm biến MIP/ AuNPs/SPCE với số vòng quét tạo màng khác nhau 7-15-20 CVs....................63 Bảng 3.6. Giá trị các thành phần trong mạch tương đương Randles của cảm biến MIP (15 CVs)/AuNPs/SPCE và NIP (15 CVs)/AuNPs/SPCE..........................................64 Bảng 3.7. Giá trị của các thành phần trong đường đặc trưng chuẩn của 10 cảm biến MIP/AuNPs-SPCE...............................................................................................65 Bảng 4.1. Vạch phổ đặc trưng của một số liên kết trên bề mặt điện cực cảm biến............82 Bảng 5.1. Số sóng đặc trưng trong phổ Raman của phân tử kháng sinh CAP theo lý thuyết và thu được trong thực nghiệm............................................................................89 Bảng 5.2. Vạch phổ Raman đặc trưng của các bon, p-ATP và kháng sinh NOR................96 Bảng 5.3. Giá trị R2 và độ nhạy của 3 loại cảm biến xác định NOR trong 2 dải nồng độ 0,32-3,19 ng/mL và 3,19 - 31,91 ng/mL.............................................................99 Bảng 5.4. Giá trị điện trở truyền điện tích của ba cảm biến NOR-MIP/EIS......................101 Bảng 5.5. Một số các kết quả xác định nồng độ kháng sinh Norfloxacin được công bố trên các tạp chí khoa học trên thế giới......................................................................103 Bảng 5.6. Kết quả phân tích mẫu nước hồ nuôi cá bớp khi thêm chất chuẩn bằng phương pháp điện hóa.....................................................................................................106 Bảng 5.7. Kết quả phân tích HPLC của mẫu chuẩn NOR tại các nồng độ khác nhau.......107 Bảng 5.8. Kết quả phân tích mẫu nước hồ nuôi cá bớp sử dụng phương pháp HPLC......108 Bảng 5.9. Nồng độ kháng sinh NOR sau khi pha loãng được xác định bằng phương pháp phân tích điện hóa..............................................................................................110 Bảng 5.10. Nồng độ kháng sinh NOR tính theo diện tích đỉnh tại bước sóng 277............112 Bảng 5.11. Kết quả phân tích định lượng nồng độ kháng sinh CF trong mẫu thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0,3% bằng cảm biến CF-MIP................................................................117 Bảng 5.12. Bảng tổng hợp các giá trị bước sóng mà tại đó xuất hiện đỉnh phổ khi phân tích phổ hấp thụ UV-VIS của một số kháng sinh nhóm Quinolone pha trong đệm HCl 0.1N [23]....................................................................................................118 Bảng 5.13. Bảng phân tích định lượng nồng độ kháng sinh CF trong mẫu thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0,3%......................................................................................................120 xi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Điện cực các bon thủy tinh (Glassy carbon electrode - GCE) và hệ điện hóa ba điện cực sử dụng điện cực làm việc GCE........................................8 Hình 1.2. Điện cực điện hóa in lưới màng dầy (a) hệ 2 điện cực, (b) hệ 3 điện cực..8 Hình 1.3. Điện cực in lưới mực in cácbon của hãng Dropsen (Tây Ban Nha) (a) 1 điện cực làm việc; (b) 2 điện cực làm việc; (c) 4 điện cực làm việc; (d) 8 điện cực làm việc........................................................................................9 Hình 1.4. Điện cực in lưới màng dày của hãng BioDevice Technology (Nhật Bản) (a) điện cực làm việc mực in các bon; (b) điện cực làm việc mực in vàng. 9 Hình 1.5. Mô hình mạch điện tương đương Randles mô phỏng tính chất điện của hệ điện hóa trong dung dịch điện ly (a) không có cặp chất ôxy hóa - khử, (b) có cặp chất ôxy hóa - khử.........................................................................11 Hình 1.6. Mô hình cấu trúc cảm biến miễn dịch kiểu tụ và mạch điện tương đương .................................................................................................................. 12 Hình 1.7. Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa sử dụng chất dò [Fe(CN) 6]3-/4-; (a) đầu thu kháng thể cố định trên điện cực vàng, (b) đầu thu kháng thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực, (c) mạch tương đương Randles và (d) phổ tổng trở biểu diễn trên mặt phẳng Nyquist của cảm biến trước và sau phản ứng miễn dịch [18]..13 Hình 1.8. Sơ đồ nguyên lý công nghệ MIP.............................................................17 Hình 1.9. Nguyên tắc nhận dạng in phân tử [47], [51]............................................18 Hình 1.10. Ví dụ về thuốc trừ sâu, chất nổ và dược phẩm sử dụng như khuôn mẫu .................................................................................................................. 20 Hình 1.11. Monome sử dụng trong MIPs................................................................21 Hình 1.12. Một số hợp chất liên kết chéo sử dụng trong MIPs...............................22 Hình 1.13. Các chất khơi mào thường sử dụng trong MIPs....................................23 Hình 2.1. Quy trình công nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân tại MIP phát hiện phân tử nhỏ (protein, kháng nguyên và kháng sinh) trên điện cực SPCE. 28 Hình 2.2. Đặc trưng dòng-thế khi hệ điện cực được quét CV 20 vòng trong dung dịch PBS 100 mM chứa 100 µM HAuCl4 với tốc độ quét 50 mV trong dải điện áp từ -600 mV đến +500 mV vs. Ag/AgCl......................................29 Hình 2.3. Cấu trúc hóa học của các chất phân tích lựa chọn trong nghiên cứu.......31 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên kháng thể ENRO và đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP......32 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình thực nghiệm chế tạo Ciprofloxacin-MIP theo phương pháp 1 và phương pháp 2..........................................................................35 xii
Hình 2.6. Đặc trưng dòng-thế của quá trình trùng hợp tạo Polyme-MIP ngày trên màng SAM (p-ATP) của điện cực AuNPs-SPCE......................................36 Hình 2.7. Quy trình phân tích xác định hàm lượng kháng sinh Norfloxacin của mẫu nước hồ nuôi thủy sản theo 2 phương pháp EIS và HPLC.......................38 Hình 2.8. Thuốc kháng sinh Norfloxacin 400 mg...................................................39 Hình 2.9. Quy trình xác định nồng độ kháng sinh Norfloxacin trong thuốc kháng sinh Norfloxacin 400 mg theo phương pháp điện hóa và phương pháp UV- VIS...........................................................................................................40 Hình 2.10. Mô hình tán xạ Rayleigh, Stoke và anti-Stoke......................................43 Hình 2.11. Cường độ sáng của chùm sáng giảm khi đi qua môi trường vật chất.. . .44 Hình 2.12. Mô tả định luật Lambert........................................................................44 Hình 2.13. Đường chuẩn sự phụ thuộc của độ hấp thụ A vào nồng độ C và cách xác định nồng độ Cx từ Ax của mẫu cần phân tích...........................................45 Hình 2.14. Sơ đồ cấu tạo của một hệ sắc kí lỏng hiệu năng cao..............................46 Hình 2.15. Sơ đồ thể hiện sự ảnh hưởng của các lực rửa giải.................................47 Hình 2.16. Quá trình rửa giải và tách píc của chất A và chất B..............................47 Hình 2.17. Sơ đồ mạch điện tương đương Randles của hệ điện hóa.......................48 Hình 2.18. Đường cong Nyquist của đặc trưng phổ EIS của cảm biến faradaic.....49 Hình 3.1. a) Ảnh SEM của điện cực SPAuE sau khi biến tính màng MIP; b) Ảnh SEM của điện cực SPCE sau khi biến tính màng MIP; c) Đặc trưng dòng- thế của quá trình polyme hóa trên điện cực SPAuE; d) Đặc trưng dòng-thế của quá trình polyme hóa trên điện cực SPCE..........................................51 Hình 3.2. Phổ EIS của cảm biến MIP/AuNPs-SPCE sau các bước biến tính..........54 Hình 3.3. a) Phổ EIS ứng với các nồng độ khác nhau của cảm biến sarcosine-MIP (15 CVs)/SPAuE sau các bước biến tính; b) Đường đặc trưng chuẩn của các cảm biến sarcosine-MIP/SPAuE và NIP/SPAuE................................57 Hình 3.4. Phổ EIS ứng với các nồng độ khác nhau của cảm biến a) sarcosine-MIP (7 CVs)/SPAuE và b) sarcosine-MIP (5 CVs)/SPAuE.............................59 Hình 3.5. Ảnh SEM của các điện cực SPCE được biến tính AuNPs sử dụng phương pháp quét CV với số vòng khác nhau 5 CVs-10 CVs-15 CVs-20 CVs.. . .60 Hình 3.6. Phổ EIS ứng số vòng quét tạo hạt vàng khác nhau của cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE...................................................................61 Hình 3.7. Phổ EIS ứng số vòng quét tạo màng MIP khác nhau của cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE...................................................................62 Hình 3.8. a) Phổ EIS ứng với các nồng độ khác nhau của cảm biến sarcosine-MIP (15 CVs)/AuNPs-SPCE sau các bước biến tính; b) Đường đặc trưng chuẩn của các cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE và NIP/AuNPs-SPCE....63 xiii
Hình 3.9. Độ ổn định của cảm biến sau 1, 2 và 7 ngày trong điều kiện bảo quản: dung dịch PBS 100nM và 4oC..................................................................66 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của các phân tử sarcosine, alanine, lysine và cysteamine................................................................................................66 Hình 3.11. Độ chọn lọc của cảm biến sarcosine-MIP/AuNPs-SPCE với các chất phân tích khác nhau có cấu trúc và tính chất gần như Sarcosine..............67 Hình 3.12. Ảnh SEM của E2-MIPs tạo thành trên SPAuE và AuNPs-SPCE, cũng như màng NIP tạo thành AuNPs-SPCE....................................................68 Hình 3.13. Biểu đồ Nyquist cho các phép đo trở kháng faradaic tương ứng với E2 (ở các nồng độ khác nhau từ 1 fM đến 100 nM) đối với a) E2-MIP/AuNPs-SPCE, b) E2-(MIP-Au)composite/AuNPs-SPCE, c) Đường cong đáp ứng (NIP-Au)composite/AuNPs-SPCE và (d) thu được bằng cách vẽ biểu đồ ΔRCT theo hàm logarit của nồng độ E2 cho cảm biến sinh học dựa trên E2-MIP được chế tạo...................................................69 Hình 3.14. Tính chọn lọc của cảm biến sinh học dựa trên MIP được chế tạo cho các chất phân tích khác nhau..........................................................................70 Hình 4.1. Đặc trưng phổ EIS của cảm biến miễn dịch sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên cố định trên màng SAM của a) p-ATP và b) Cysteamine...............74 Hình 4.2. Đường đặc trưng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của ΔRCT vào nồng độ kháng nguyên ENRO của hai cảm biến sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên. .................................................................................................................. 74 Hình 4.3. Độ chọn lọc của cảm biến kháng thể ENRO/SAM (Cysteamine)/AuNPs/SPCE trong các môi trường chứa các chất khác nhau: ENRO, LEVO, CF..........................................................................75 Hình 4.4. Đặc trưng phổ EIS ghi nhận tại các nồng độ ENRO khác nhau của cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP/AuNPs/SPCE với số vòng quét tạo màng polyme MIP là 25,28, 30 và 32................................76 Hình 4.5. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến ENRO-MIP/AuNPs-SPCE thể hiện sự phụ thuộc của ΔRCT vào nồng độ ENRO với số vòng quét tạo màng polyme khác nhau.....................................................................................77 Hình 4.6. Đặc trưng phổ EIS của: a) cảm biến kháng thể ENRO/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE; b) cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo ENRO-MIP/AuNPs-SPCE và c) cảm biến NIP/AuNPs-SPCE vào nồng độ kháng nguyên ENRO...........................................................................78 Hình 4.7. Đường đặc trưng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của ΔRCT vào nồng độ kháng nguyên ENRO của cảm biến kháng thể ENRO-SAM/AuNPs-SPCE, ENRO-MIP/AuNPs-SPCE và NIP/AuNPs-SPCE....................................79 Hình 4.8. Quang phổ Raman của phân tử ENRO....................................................80 Hình 4.9. Phổ tán xạ Raman cảm biến ENRO-MIP/AuNPs-SPCE qua từng bước công nghệ chế tạo và tái liên kết kháng nguyên ENRO............................80 xiv
Hình 4.10. Chu kì phản ứng khử của enzyme HRP với H2O2 và quá trình tự hồi phục [23]..................................................................................................83 Hình 4.11. Mô hình nguyên lý hoạt động của cảm biến enzyme a, HRP-SAM và b, HRP-MIP trên AuNPs-SPCE khi tiếp xúc với môi trường có chứa H2O2.83 Hình 4.12. Đường đặc trưng dòng thế của cảm biến enzyme HRP-SAM/AuNPs- SPCE tại các nồng độ H2O2 khác nhau.....................................................84 Hình 4.13. Ảnh hưởng của tốc độ quét đến khả năng hoạt động điện hóa của cảm biến enzyme HRP/SAM/AuNPs-SPCE tại nồng độ H2O2 là 1 mM..........85 Hình 4.14. Đường đặc trưng dòng thế của cảm biến enzyme HRP-MIP/AuNPs- SPCE với các nồng độ enzyme HRP khác nhau đo trong H 2O2 1 mM (trong PBS pH 6,0)...................................................................................85 Hình 5.1. Ảnh chụp SEM của bề mặt điện cực cảm biến CAP-MIP/AuNPs-SPCE và NIP/AuNPs-SPCE cũng như phổ EDS ghi nhận được của màng CAP- MIP...........................................................................................................89 Hình 5.2. Đặc trưng quang phổ Raman của bề mặt điện cực CAP-MIP và NIP tại bước sóng kích thích là 633 nm trong 30 giây với công suất 25 mW và độ phân giải nhỏ hơn 2 cm-1..........................................................................90 Hình 5.3. a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến tại các nồng độ CAP từ 0 ng/mL đến 16,6 µM (đường đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu, đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương Randles; b) Đường chuẩn của cảm biến CAP-MIP/AuNPs-SPCE và cảm biến đối chứng NIP...................................................................................91 Hình 5.4. Tín hiệu của cảm biến CAP-MIP/AuNPs-SPCE có pha tạp AuNPs vào màng polyme trong môi trường chứa kháng sinh CAP nồng độ 66 µM và 66 µM của kháng sinh thử Thiophenicol và Ciprofloxacin......................92 Hình 5.5. a) Đặc trưng dòng-thế của quá trình in phân tử NOR vào màng poly(aminothiophenol) theo phương pháp quét thế tuần hoàn (20 vòng quét, tốc độ 50 mV/s) và b) Ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) màng in phân tử NOR trên điện cực in các bon biến tính hạt vàng........................93 Hình 5.6. Đường đặc trưng điện hóa của cảm biến sau từng bước chế tạo a) điện cực in các bon (SPCE), b) điện cực in các bon biến tính hạt vàng (AuNPs- SPCE), c) mạng polyme in phân tử Norfloxacin (NOR-MIP/AuNPs- SPCE), d) loại bỏ phân tử NOR khỏi mạng polyme.................................94 Hình 5.7. Đặc trưng quang phổ Raman của điện cực in các bon, của điện cực sau khi polyme hóa, điện cực sau khi tách NOR ra khỏi mạng polyme, điện cực sau khi cho NOR tái liên kết vào mạng polyme và mẫu đối chứng không in phân tử NOR.............................................................................95 Hình 5.8. Đặc trưng phổ EIS ghi nhận tại các nồng độ Norfloxacin của cảm biến NOR-MIP/EIS và phổ EIS của mẫu đối chứng không in phân tử Norfloxacin..............................................................................................97 xv
Hình 5.9. Đặc trưng phổ EIS ghi nhận tại các nồng độ Norfloxacin của cảm biến được chế tạo theo a) cách 1(trộn HAuCl 4 vào dung dịch polyme) và b) cách 2(trộn hạt keo vàng 10 nm vào dung dịch polyme) tại các nồng độ NOR xác định từ 0,32 ng/mL đến 31,91 ng/mL.......................................98 Hình 5.10. Đường đặc trưng chuẩn của 3 loại cảm biến NOR-MIP/EIS.................99 Hình 5.11. Đặc trưng phổ EIS ghi nhận tại các nồng độ NOR của 03 cảm biến NOR-MIP/EIS được chế tạo với cùng điều kiện công nghệ...................100 Hình 5.12. Đặc trưng phổ EIS của mẫu đối chứng không in Norfloxacin ghi nhận tại các nồng độ Norfloxacin khác nhau...................................................102 Hình 5.13. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến NOR-MIP/EIS xác định kháng sinh Norfloxacin và mẫu đối chứng không in phân tử MIP trong dải nồng độ của Norfloxacin từ 0,32 ng/mL (1 nM) đến 31,91 ng/mL (100 nM)..103 Hình 5.14. So sánh giá trị điện trở truyền điện tích của cảm biến NOR-MIP/EIS a) ghi nhận trong môi trường NOR và môi trường kháng sinh khác (CF, LEVO, CAP) b) ghi nhận trong môi trường NOR và môi trường trộn NOR với các kháng sinh khác (CF, LEVO, CAP) tại 3 nồng độ 3,19, 12,76, 19,14 ng/mL...........................................................................................104 Hình 5.15. Đặc trưng phổ EIS của cảm biến sử dụng đầu thu sinh học nhân tạo xác định kháng sinh Norfloxacin khi phân tích nước hồ nuôi.......................106 Hình 5.16. Đường đặc trưng chuẩn của phương pháp HPLC phân tích kháng sinh Norfloxacin trong dải nồng độ từ 10 đến 200 ppb..................................107 Hình 5.17. Thuốc kháng sinh Norfloxacin 400 mg, và thuốc sau khi đã được xử lý theo quy trình trình bày trong chương 2.................................................109 Hình 5.18. Đặc trưng phổ EIS của cảm biến NOR-MIP/EIS xác định hàm lượng kháng sinh Norfloxacin trong thuốc kháng sinh Norfloxacin 400mg.....109 Hình 5.19. Phổ hấp thụ UV-VIS khi phân tích kháng sinh Norfloxacin (a) và đường chuẩn (b) trong dải nồng độ từ 1 µg/mL đến 40 µg/mL.........................111 Hình 5.20. Đặc trưng quang phổ UV-VIS khi phân tích thuốc kháng sinh Norfloxacin 400 mg được pha loãng xuống 20.000, 40.000 và 200.000 lần. ................................................................................................................ 111 Hình 5.21. Ảnh SEM hình thái bề mặt điện cực cảm biến chế tạo theo phương pháp 1 và phương pháp 2................................................................................113 Hình 5.22. Đặc trưng phổ tán xạ Raman của bề mặt cảm biến sau bước in phân tử CF vào mạng polyme (polyme-MIP/AuNPs-SPCE), sau bước loại bỏ phân tử CF ra khỏi mạng poly(aminothiphenol) hình thành đầu thu CF-MIP và sau bước tái liên kết các phân tử CF với đầu thu CF-MIP của chúng (Tái liên kết của CF 1µM)..............................................................................114 Hình 5.23. Phổ tổng trở điện hóa cảm biến A) CF-MIP và B) Cảm biến NIP.......115 xvi
Hình 5.24. Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến CF-MIP với RCT (k) là hàm của nồng độ CF (ng/mL). Tất cả các điểm đo trên đồ thị là giá trị trung bình của 03 cảm biến được chế tạo độc lập sử dụng cùng quy trình và thanh sai số chính là giá trị độ lệch chuẩn (cỡ 5 %)..............................................115 Hình 5.25. Thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0,3% của hãng Atco Laboratories., Ltd – Pakistan..................................................................................................116 Hình 5.26. Đặc trưng EIS phân tích mẫu thuốc nhỏ mắt Prolaxi 0.3% tại các nồng độ khác nhau của (A) Cảm biến CF-MIP và (B) Cảm biến NIP.............117 Hình 5.27. Phổ hấp thụ UV-vis của Ciprofloxacin ở các nồng độ khác nhau.......118 Hình 5.28. Đường đặc trưng chuẩn xác định nồng độ kháng sinh Ciprofloxacin bằng phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ UV-VIS......................119 Hình 5.29. Quang phổ hấp thụ UV-viscủa mẫu thuốc nhỏ mắtkhi pha loãng xuống các nồng độ khác nhau...........................................................................120 Hình 5.30. Phổ tổng trở điện hóa cảm biến A) CF-MIP và B) NIP.......................121 Hình 5.31. Đường đặc trưng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của ∆RCT vào nồng độ CF của cảm biến...........................................................................................121 Hình 5.32. Phổ EIS của các mẫu nước khi pha loãng 10 lần trong đệm là dung dịch HCl 0.1 N với (A) mẫu nước hồ nuôi tôm sú và (B) mẫu nước hồ nuôi ngao........................................................................................................122 Hình 5.33. Đường đặc trưng chuẩn được xây dựng theo sự phụ thuộc của diện tích píc rửa giải vào nồng độ kháng sinh CF.................................................123 Hình 5.34. Vị trí và thứ tự của từng thành phần linh kiện trên đĩa quay ly tâm....125 Hình 5.35. Các kiểu thiết kế khác nhau của chíp vi lưu (A)-Overflow; (B)-Siphon. ................................................................................................................ 126 Hình 5.36. Ảnh hiển vi quang học của vi kênh với độ rộng khoảng 200 µm và hình ảnh khuôn chíp CMF..............................................................................126 Hình 5.37. Hệ CMF-QCM sử dụng bơm định lượng với xilanh...........................127 Hình 5.38. Ảnh chụp dòng dung dịch trong buồng phản ứng của chíp overflow hệ CMF-QCM sử dụng bơm định lượng với xilanh....................................127 Hình 5.39. Máy quay ly tâm khảo sát một chíp CMF-QCM.................................128 Hình 5.40. Ảnh chụp dòng dung dịch trong buồng phản ứng của chíp siphon hệ CMF-QCM sử dụng bơm định lượng với xilanh....................................129 Hình 5.41. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện QCM. ................................................................................................................ 130 Hình 5.42. Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến MIP-QCM sử dụng chíp CMF. ................................................................................................................ 131 Hình 5.43. Hệ đo Mass-sensitive system biosensor thực hiện việc đo đáp ứng tần số của điện cực cảm biến MIP-QCM sau mỗi bước chế tạo trong môi trường dung dịch PBS 10mM............................................................................132 xvii
Hình 5.44. Sự thay đổi tần số theo thời gian của các bước chế tạo và hoạt động của cảm biến MIP-QCM xác định kháng sinh NOR.....................................133 xviii