Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu một số đa hình đơn gen PDCD1 và CD274 ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:186

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu một số đa hình đơn gen PDCD1 và CD274 ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính" được hoàn thành với mục tiêu nhằm xác định sự phân bố kiểu gen và alen của một số đa hình đơn gen PDCD1 và CD274 ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính và người khỏe mạnh; Khảo sát mối liên quan giữa một số đa hình đơn gen PDCD1, CD274 và nồng độ protein huyết tương PD-1, PD-L1 với một số thể bệnh lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu một số đa hình đơn gen PDCD1 và CD274 ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ MINH HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐA HÌNH ĐƠN GEN PDCD1 VÀ CD274 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B MẠN TÍNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ======== PHẠM THỊ MINH HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐA HÌNH ĐƠN GEN PDCD1 VÀ CD274 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B MẠN TÍNH Chuyên ngành : Hóa sinh y học Mã số : 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung 2.TS. Nghiêm Xuân Hoàn HÀ NỘI - 2022
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của lãnh đạo các cơ quan, thầy cô, đồng nghiệp, các bệnh nhân và gia đình thân yêu của mình. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung- Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội và TS. Nghiêm Xuân Hoàn- Phó chủ nhiệm khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, góp ý và sửa chữa luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến quý thầy cô, đồng nghiệp, những người đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án này: Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại Học- trường Đại học Y Hà Nội. Toàn thể quý thầy cô, cán bộ trong Bộ môn Hóa Sinh- trường Đại học Y Hà Nội. Ban giám đốc bệnh viện TWQĐ 108. Toàn thể quý thầy cô, cán bộ, sinh viên của Trung tâm nghiên cứu y học Việt Đức- Bệnh viện TWQĐ 108. Toàn thể các bác sỹ, dược sỹ, kỹ sư, kỹ thuật viên của Trung tâm xét nghiệm- Bệnh viện TWQĐ 108. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các bệnh nhân và gia đình của họ đã giúp tôi có được số liệu trong luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quỹ Phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (Nafosted) đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này. Kết quả nghiên cứu là một phần kết quả trong đề tài: “Nghiên cứu vai trò các phân tử ức chế điểm kiểm soát tín hiệu miễn dịch của con đường PD-1/PD-L1 và IDO/TDO-Kyn-AhR đối với hậu quả lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính”.
Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Đào Phương Giang- Trung tâm tư vấn di truyền và sàng lọc ung thư- Bệnh viện TWQĐ 108, BSNT Bùi Đình Tùng, BSNT Ngọ Thị Uyên- Bộ môn Hóa Sinh trường Đại học Y Hà Nội, CN Bùi Thùy Linh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ, tình yêu thương của bố mẹ hai bên cùng sự ủng hộ, động viên của chồng tôi và của hai con và các anh chị em trong gia đình, những người đã luôn ở bên, là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Phạm Thị Minh Huyền
LỜI CAM ĐOAN Tôi là Phạm Thị Minh Huyền, nghiên cứu sinh khóa 38 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của cô PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung và thầy TS. Nghiêm Xuân Hoàn. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Người viết cam đoan Phạm Thị Minh Huyền
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 3 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B ................................. 3 1.1.1. Virus viêm gan B ........................................................................... 4 1.1.2. Sinh lý bệnh trong nhiễm virus viêm gan B ................................... 5 1.1.3. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm virus viêm gan B ......................... 7 1.1.4. Chẩn đoán và điều trị nhiễm virus viêm gan B ............................ 14 1.2. CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU PD-1/PD-L1................................................ 17 1.2.1. Tín hiệu thông qua con đường PD-1/ PD-L1 ............................... 18 1.2.2. Vai trò của con đường PD-1/PD-L1 trong nhiễm virus viêm gan B mạn tính ........................................................................................ 19 1.2.3. Vai trò của con đường PD-1/PD-L1 trong ung thư gan ............... 22 1.2.4. Ứng dụng con đường PD-1/ PD-L1 trong điều trị hiện nay ......... 23 1.3. ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID CỦA GEN PDCD1, CD274 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN HUYẾT TƯƠNG CỦA GEN PD-1, PD-L1 ............. 25 1.3.1. Khái niệm về đa hình đơn nucleotid ............................................ 25 1.3.2. Đa hình đơn nucleotid của gen PDCD1 ...................................... 28 1.3.3. Đa hình đơn nucleotid của gen CD274 ......................................... 31 1.3.4. Protein sPD-1, sPD-L1 ................................................................. 33 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 36 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 36 2.1.1. Nhóm người khỏe mạnh ............................................................... 36 2.1.2. Bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính............................... 36 2.1.3. Cỡ mẫu nghiên cứu ....................................................................... 40 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................... 42 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu và sơ đồ nghiên cứu ..................................... 42
2.2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................... 43 2.2.3. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu................................ 46 2.2.4. Kỹ thuật phân tích đa hình đơn nucleotid gen PDCD1 và CD274 ... 48 2.2.5. Kỹ thuật định lượng protein sPD-1 và sPD-L1 ............................ 52 2.3. XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU ...................................................... 52 2.4. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ................................................................... 53 2.5. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ....................................... 53 2.6. CÁC BIỆN PHÁP KHỐNG CHẾ SAI SỐ TRONG NGHIÊN CỨU...... 54 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 55 3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .................. 55 3.1.1. Đặc điểm phân bố về tuổi của đối tượng nghiên cứu ................... 55 3.1.2. Đặc điểm về giới của đối tượng nghiên cứu ................................. 56 3.1.3. Đặc điểm cận lâm sàng ở nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn ...... 56 3.2. PHÂN BỐ KIỂU GEN VÀ ALEN CỦA CÁC BIẾN THỂ PD-1.1, PD-1.5, PD-1.9 VÀ rs2297136, rs4143815 Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU ........ 57 3.2.1. Đa hình PD-1.1 ............................................................................. 57 3.2.2. Đa hình PD-1.5 ............................................................................. 61 3.2.3. Đa hình PD-1.9 ............................................................................. 64 3.2.4. Đa hình rs2297136 ....................................................................... 67 3.2.5. Đa hình rs4143815 ....................................................................... 70 3.3. PHÂN BỐ HAPLOTYPE Ở CÁC NHÓM NGHIÊN CỨU ................. 73 3.3.1. Phân bố haplotype của 2 SNP trên exon 5 của gen PD-1 ở các nhóm nghiên cứu........................................................................... 73 3.3.2. Phân bố haplotype của gen PD-1 ở các nhóm nghiên cứu ........... 75 3.3.3. Phân bố haplotype của gen PD-L1 ở các nhóm nghiên cứu ......... 78 3.4. NỒNG ĐỘ PROTEIN sPD-1 và sPD-L1 .............................................. 79 3.4.1. Nồng độ protein sPD-1 ................................................................. 79 3.4.2. Nồng độ protein sPD-L1 ............................................................... 81
3.4.3. Tương quan giữa nồng độ sPD-1 và sPD-L1 ............................... 84 3.5. MỐI LIÊN QUAN GIỮA KIỂU GEN VÀ NỒNG ĐỘ sPD-1, sPD-L1 ... 85 3.5.1. Mối liên quan giữa kiểu gen PD-1 và nồng độ protein sPD-1 ..... 85 3.5.2. Mối liên quan giữa kiểu gen PD-L1 với nồng độ protein sPD-L1 .... 86 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 87 4.1. PHÂN BỐ KIỂU GEN VÀ ALEN CỦA MỘT SỐ ĐA HÌNH ĐƠN GEN PDCD1 VÀ CD274 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B MẠN TÍNH VÀ NGƯỜI KHỎE MẠNH ................................. 92 4.2. MỐI LIÊN QUAN GIỮA MỘT SỐ ĐA HÌNH ĐƠN GEN PDCD1, CD274 VÀ NỒNG ĐỘ PROTEIN HUYẾT TƯƠNG sPD-1, sPD-L1 VỚI MỘT SỐ THỂ BỆNH LÂM SÀNG Ở BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B MẠN TÍNH ....................................................... 96 KẾT LUẬN .................................................................................................. 118 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ..................................................... 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt a.a Amino acid Acid amin AHB Acute hepatitis B virus Viêm gan virus B cấp ALT Alanine transaminase APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên AST Aspartate transaminase cccDNA Covalently closed circular DNA dạng vòng DNA DC Dendritic cell Tế bào gai HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B HCC Hepatocellular cancer Ung thư biểu mô tế bào gan HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C INR International normalized ratio ITIM Immunoreceptor tyrosine- Motif ức chế phụ thuộc thụ thể based inhibitory motif tyrosine ITSM Immunoreceptor tyrosine- Motif chuyển phụ thuộc thụ thể based switch motif tyrosine LC Liver cirrhosis Xơ gan LCMV Lymphocytic chriomeningitis Virus gây viêm màng não virus lympho MHC Major Histocompatibility Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu Complex mPD-1 membrane PD-1 Protein PD-1 dạng gắn màng mPD-L1 membrane PD-L1 Protein PD-L1 dạng gắn màng NA Nucleos(t)ide analogue Hoạt chất tương tự Nuclos(t)ide
Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt NK Natural killer cell Tế bào giết tự nhiên NKT Natural killer T cell Tế bào T giết tự nhiên SNP Single nucleotide Đa hình đơn nucleotid polymorphism sPD-1 Soluble PD-1 Protein PD-1 dạng hòa tan sPD-L1 Soluble PD-L1 Protein PD-L1 dạng hòa tan VGMT Viêm gan mạn tính XG Xơ gan
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Đánh giá chức năng gan theo Child - Pugh .................................... 44 Bảng 2.2. Phân chia giai đoạn HCC theo BCLC ............................................ 44 Bảng 2.3. Trình tự mồi của phản ứng PCR ..................................................... 47 Bảng 3.1. Phân bố về tuổi ở các nhóm nghiên cứu ......................................... 55 Bảng 3.2. Phân bố giới tính của các nhóm nghiên cứu................................... 56 Bảng 3.3. Đặc điểm cận lâm sàng ở nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn ....... 56 Bảng 3.4. Đa hình PD-1.1 ở nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính và người khỏe mạnh ................................................................ 59 Bảng 3.5. Đa hình PD-1.1 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn...... 60 Bảng 3.6. Đa hình PD-1.5 ở nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn và người khỏe mạnh ....................................................................................... 62 Bảng 3.7. Đa hình PD-1.5 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn.... 63 Bảng 3.8. Đa hình PD-1.9 ở nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính và người khỏe mạn .................................................................. 65 Bảng 3.9. Đa hình PD-1.9 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính........................................................................................... 66 Bảng 3.10. Đa hình rs2297136 ở nhóm bệnh nhân và người khỏe mạnh....... 68 Bảng 3.11. Đa hình rs2297136 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn .............................................................................................. 69 Bảng 3.12. Đa hình rs4143815 ở nhóm bệnh nhân và người khỏe mạnh....... 71 Bảng 3.13. Đa hình rs4143815 ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn .............................................................................................. 72 Bảng 3.14. Phân bố haplotype ở nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn và nhóm người khỏe mạnh............................................................................. 73 Bảng 3.15. Mối liên quan giữa các haplotype PD-1.5/1.9 với các thể bệnh của bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính .................................................... 74
Bảng 3.16. Phân bố haplotype ở nhóm người khỏe mạnh và nhóm nhiễm HBV mạn ........................................................................................ 75 Bảng 3.17. Phân bố các haplotype điển hình ở các nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính .............................................................. 76 Bảng 3.18. Mối liên quan haplotype PD-1.1, PD1.5 và PD-1.9 với các thể bệnh ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn................................................ 77 Bảng 3.19. Phân bố haplotype gen PD-L1 ở nhóm người khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn............................................ 78
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của virus viêm gan B ............................................ 5 Hình 1.2. Các pha của nhiễm virus viêm gan B mạn tính. ............................... 6 Hình 1.3. Tiến triển lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B. .............. 7 Hình 1.4. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm virus viêm gan B ........................ 11 Hình 1.5. Thuốc điều trị nhiễm HBV mạn tính đã được chấp nhận. .............. 16 Hình 1.6. Tín hiệu PD-1 ức chế sự hoạt hóa của tế bào lympho T. ................ 19 Hình 1.7. Cấu trúc gen PD-1........................................................................... 28 Hình 1.8. Cấu trúc gen, mRNA và protein PD-L1.......................................... 32 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................. 42 Hình 2.2. Nguyên lý phương pháp T- ARMS PCR ........................................ 50 Hình 2.3. Hình ảnh mô phỏng điện di sản phẩm PCR của đa hình rs2297136 sau phản ứng T- ARMS PCR.......................................................... 51 Hình 2.4. Hình ảnh mô phỏng điện di sản phẩm PCR của đa hình rs4143815 sau phản ứng T- ARMS PCR.......................................................... 51 Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR PD-1.1 ........................................ 58 Hình 3.2. Hình ảnh đại diện giải trình tự gen xác định tính đa hình PD-1.1 ........ 58 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR PD-1.5 ........................................ 61 Hình 3.4. Hình ảnh đại diện giải trình tự gen xác định tính đa hình PD-1.5 ....... 61 Hình 3.5. Hình ảnh đại diện giải trình tự gen xác định tính đa hình PD-1.9 ....... 64 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen rs2297136 .... 67 Hình 3.7. Hình ảnh đại diện giải trình gen xác định tính đa hình rs2297136 ........ 67 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đại diện xác định kiểu gen rs4143815 ........................................................................................ 70 Hình 3.9. Hình ảnh đại diện giải trình tự gen xác định tính đa hình rs4143815.... 70 Hình 3.10. Nồng độ sPD-1 ở nhóm bệnh nhân và nhóm người khỏe mạnh, trong nhóm nhiễm HBV mạn tính ................................................. 79
Hình 3.11. Tương quan của nồng độ sPD-1 với chỉ số cận lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính ............................................................. 80 Hình 3.12. Nồng độ protein sPD-1 ở các nhóm APRI và Fib-4 ..................... 81 Hình 3.13. Nồng độ protein sPD-L1 giữa các nhóm nghiên cứu ................... 81 Hình 3.14. Nồng độ protein sPD-L1 ở các nhóm AST, ALT, Bilirubin toàn phần, Bilirubin trực tiếp, tiểu cầu, prothrombin ............................. 82 Hình 3.15. Nồng độ sPD-L1 ở các nhóm theo phân loại Child-Pugh và........ 83 Hình 3.16. Mối tương quan giữa nồng độ sPD-1 và sPD-L1 ......................... 84 Hình 3.17. Mối liên quan giữa đa hình PD-1.1, PD-1.5, PD-1.9 với nồng độ protein sPD-1. ................................................................................. 85 Hình 3.18. Mối liên quan giữa đa hình gen rs2297136 và rs4143815 với nồng độ protein sPD-L1. .......................................................................... 86
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Virus viêm gan B (HBV) là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất trên toàn cầu. Theo ước tính của tổ chức y tế thế giới có khoảng 3,5% dân số toàn cầu nhiễm virus viêm gan B.1 Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B cao nhất thế giới với khoảng 10% dân số bị nhiễm HBV dẫn đến tỷ lệ tử vong cao do các biến chứng của bệnh như suy gan cấp trên nền viêm gan mạn tính, xơ gan (XG) và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC).2, 3 Trong cơ chế bệnh sinh của nhiễm HBV, đáp ứng miễn dịch tế bào đóng vai trò quan trọng nhất thông qua hoạt động của tế bào lympho T. Tế bào lympho T đóng vai trò nền tảng trong việc loại bỏ virus.4-8 Sự suy giảm chức năng miễn dịch của tế bào lympho T là cơ chế chính dẫn đến sự tồn tại dai dẳng của HBV trong cơ thể và sự phát triển xơ gan, ung thư gan sau thời gian dài nhiễm HBV. Sự suy giảm chức năng miễn dịch tế bào lympho T gây ra bởi sự biểu hiện quá mức của các phân tử ức chế điểm kiểm soát tín hiệu miễn dịch như: PD-1/PD-L1, 2B4, TIM-3, CTLA-4…9-11 Trong đó, con đường tín hiệu PD-1/PD-L1 (programmed cell death-1/ programmed cell death ligand-1) được cho là có vai trò quan trọng trong cơ chế dẫn đến sự suy giảm chức năng tế bào T trong nhiễm HBV mạn tính.12, 13 PD-1 là một receptor ức chế miễn dịch được biểu hiện trên bề mặt nhiều loại tế bào miễn dịch và một số tế bào ung thư.14 Phối tử PD-L1 của nó là các protein xuyên màng. Khi PD-1 gắn với PD-L1 sẽ tạo ra tín hiệu ức chế sự hoạt hóa tế bào lympho T bằng nhiều quá trình và tín hiệu sinh học nội bào khác nhau.14 Gần đây, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng ngoài dạng gắn màng, protein PD-1 và PD-L1 còn có dạng hòa tan (sPD-1, sPD-L1) cũng có hoạt tính sinh học.15, 16 Nồng độ sPD-1, sPD-L1 có liên quan với mức độ nặng và tiên lượng trong nhiều loại ung thư. 16,17
2 Sự hoạt hóa ức chế miễn dịch của con đường tín hiệu PD-1/PD-L1 dẫn tới sự suy giảm chức năng miễn dịch tế bào lympho T là cơ chế chính quyết định sự tiến triển thành mạn tính và các biến chứng của nhiễm HBV. Các biến thể di truyền có thể làm thay đổi cấu trúc của gen hoặc ảnh hưởng tới việc tương tác với các yếu tố phiên mã do đó làm ảnh hưởng tới số lượng, chức năng của protein do gen mã hóa. Vì vậy, các biến thể di truyền của gen PDCD1 (mã hóa protein PD-1), CD274 (mã hóa protein PD-L1) được cho là có liên quan với tính nhạy cảm và tiến triển của bệnh gan trong nhiễm HBV.18, 19 Trong khi đó trên thế giới có một vài nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa biến thể di truyền gen PDCD1 với tiến triển của bệnh lý gan trong nhiễm virus viêm gan B mạn tính,20, 21 chưa có nghiên cứu nào về vai trò của biến thể gen CD274. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về vai trò của biến thể di truyền gen PDCD1, CD274 cũng như nồng độ protein sPD-1, sPD-L1. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số đa hình đơn gen PDCD1 và CD274 ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính” với 2 mục tiêu: 1. Xác định sự phân bố kiểu gen và alen của một số đa hình đơn gen PDCD1 và CD274 ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính và người khỏe mạnh. 2. Khảo sát mối liên quan giữa một số đa hình đơn gen PDCD1, CD274 và nồng độ protein huyết tương PD-1, PD-L1 với một số thể bệnh lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B mạn tính.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B Mặc dù hàng thập kỷ đã qua từ khi khám phá về virus viêm gan B của Baruch Blumberg-công trình đạt giải Nobel trong lĩnh vực y học năm 1976,22 những hiểu biết hiện nay về nhiều khía cạnh của virus như: vòng đời, cơ chế bệnh sinh vẫn còn chưa rõ. Nhiễm virus viêm gan B vẫn là loại nhiễm virus mạn tính phổ biến nhất trên thế giới.1 Nhiễm virus viêm gan B có thể dẫn đến các biểu hiện lâm sàng khác nhau bao gồm viêm gan cấp, viêm gan mạn tính (VGMT), xơ gan (XG) và ung thư gan (HCC). Nguy cơ tiến triển xơ gan và HCC từ viêm gan B mạn tích lũy theo thời gian. Khoảng 10% đến 20% bệnh nhân VGMT có nguy cơ phát triển thành XG trong vòng 5 năm 23 và hầu hết các trường hợp HCC (70%-80%) xảy ra ở bệnh nhân XG do nhiễm HBV.24 Mặt khác, XG và HCC là nguyên nhân ngày càng gia tăng gánh nặng bệnh tật và tử vong trên toàn thế giới.25 XG và HCC do nhiễm HBV mạn tính đã và đang là một vấn đề y tế rất nghiêm trọng ở các nước châu Á vì tỷ lệ nhiễm HBV rất cao. Khoảng 80% các trường hợp HCC ở những khu vực này là do nhiễm HBV.26 Đáng chú ý là phần lớn trường hợp nhiễm virus từ khi mang thai hoặc giai đoạn sớm của thời thơ ấu, một số bệnh nhân có thể nhiễm tiếp virus khác ở giai đoạn sau của cuộc đời. Các đặc điểm này đều là yếu tố nguy cơ cao dẫn tới hậu quả lâm sàng xấu. Hơn nữa, những nước ở khu vực này hầu hết có thu nhập quốc gia tính trên đầu người ở mức thấp tới trung bình.27 Do đó, chi phí cho việc điều trị nhiễm virus viêm gan B lâu dài thực sự là một gánh nặng đối với nền y tế cũng như với xã hội.
4 1.1.1. Virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) HBV thuộc họ Hepadnaviridae, gồm các virus chứa chuỗi DNA nhỏ, có vỏ, có ái tính với gan, có dải vật chủ hẹp. Họ Hepanaviridae gồm 2 nhánh khác nhau về kiểu gen: avihepadnaviridae và orthohepadnaviridae. Avihepadnavirus lây nhiễm cho vịt (duck HBV hay DHBV), diệc (heron HBV) và chim. Orthohepadviridae nhiễm cho động vật có vú, gồm HBV gây bệnh cho người và WHV (Woodchuck hepatitis virus) gây bệnh cho chuột chũi.22 Do thiếu hoạt tính đọc và sửa bản nháp có thể phiên mã ngược dẫn tới sự đột biến thường xuyên của các kiểu gen của virus, vì vậy tồn tại đồng thời các virus khác biệt về kiểu gen trong các cá thể bị nhiễm, được gọi là quasispecies của virus. Sự tác động lẫn nhau giữa virus, tế bào gan và đáp ứng miễn dịch hoặc thuốc kháng virus tạo ra các đột biến HBV có khả năng lẩn trốn đáp ứng miễn dịch. HBV có ít nhất 8 kiểu gen, được ký hiệu từ A đến H với sự khác biệt về gen trên 8% nhưng dưới 17% giữa mỗi tuyp.28,29 Typ thứ 9 (typ I) có sự khác về kiểu gen khoảng 8% với typ C làm cho việc phân loại nó thành một typ riêng vẫn còn gây tranh cãi. Typ 10 là J được mô tả gần đây và dường như là kết quả từ sự kết hợp giữa kiểu gen C và HBV Gibbon.30 Các typ HBV phân bố khác nhau giữa các quần thể khác nhau, các vùng địa lý khác nhau, có mối liên quan giữa kiểu gen với mức độ nặng của bệnh và đáp ứng điều trị. Ví dụ kiểu gen C phổ biến ở người châu Á, liên quan với bệnh nặng hơn và đáp ứng với điều trị bằng interferon kém hơn.31,32 DNA của HBV có dạng vòng không chặt (relaxed-circular DNA genome), chuỗi đôi một phần, mã hóa cho 4 khung đọc mở chồng lấn. Khung đọc mở lớn nhất mã hóa polymerase của virus, có hoạt tính phiên mã ngược. Khung lớn thứ hai mã hóa 3 protein vỏ của virus: S, M và L là các kháng nguyên bề mặt HBsAg. Một khung đọc mở khác mã hóa cho precore, liên quan với kháng nguyên E của virus (HBeAg) và protein lõi tạo thành vỏ capsid của virus. Cuối cùng, khung nhỏ nhất mã hóa protein X (HBx), một protein điều chỉnh nhỏ cần cho sự nhân lên của virus in vitro và in vivo.33
5 Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của virus viêm gan B 22 (A) Hệ gen của HBV. Chuỗi đôi một phần gắn vào protein polymerase. rcDNA (relaxed circular DNA) (B) Sơ đồ thể hiện bản chất chồng lấn của khung đọc mở của HBV. (C) Virion của virus HBV trưởng thành (mảnh Dane). 1.1.2. Sinh lý bệnh trong nhiễm virus viêm gan B Khi nhiễm HBV, cơ thể có thể có viêm gan hoặc có thể không có triệu chứng. Nhiễm virus viêm gan B ở người trưởng thành 95% có khả năng tự loại bỏ virus trong vòng 6 tháng. Ngược lại, trẻ nhiễm virus trong giai đoạn 1 đến 5 tuổi thì 30 đến 90% chuyển thành nhiễm mạn tính.34 Trong nhiễm virus cấp, đáp ứng của hệ miễn dịch với HBV là hiệu quả và đúng thời điểm. Việc loại bỏ virus liên quan với sự đáp ứng của tế bào T mạnh mẽ tạo ra tác động kháng virus theo cả cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc hủy tế bào. Khi nhiễm cấp tính chuyển thành mạn tính, có sự suy yếu tiến triển về chức năng tế bào T đặc hiệu HBV.35 Nhiễm HBV mạn là một quá trình động học phản ánh sự tương tác giữa sự nhân lên của HBV và đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Diễn biến của nhiễm HBV mạn được chia ra dưới dạng biểu đồ thành 5 pha.
6 Huyết tương Hình 1.2. Các pha của nhiễm virus viêm gan B mạn tính.36 Diễn biến của bệnh nhân nhiễm HBV mạn không nhất thiết theo thứ tự từ pha 1 đến pha 5. Sự hoạt hóa các cơ chế miễn dịch để loại bỏ virus đồng thời gây viêm và hoại tử mô gan. Quá trình này diễn ra không liên tục. Một bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính có thể chuyển đổi giữa các pha có hoạt tính miễn dịch và bất hoạt vài lần trong suốt cuộc đời. Sự lặp lại các giai đoạn hoạt động miễn dịch dẫn tới tổn thương xơ hóa và ung thư biểu mô tế bào gan.37 Nguy cơ tiến triển thành xơ gan và ung thư gan thì rất khác nhau giữa các cá thể và chịu ảnh hưởng phần lớn bởi đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Khoảng 30% bệnh nhân viêm gan B mạn tính sẽ phát triển thành xơ gan. Nguy cơ HCC của bệnh nhân xơ gan là 2-5% mỗi năm, là mối lo ngại chính hiện nay đối với bệnh nhân viêm gan B mạn.38