Luận án Tiến sĩ Y học: Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại Bệnh viện Nhi Trung ương, 2009

BÔ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

Bùi Thị Mùi

TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ 3 VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG,2009 - 2010

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2014

BÔ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

Bùi Thị Mùi

TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ 3 VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG,2009 - 2010

Chuyên nghành: Vi sinh y học

Mã số: 62720115

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Nguyễn Thanh Liêm

2. TS. Lê Thị Ánh Hồng

HÀ NỘI - 2014

LLờờii ccảảmm ơơnn

TTrroonngg qquuáá ttrrììnnhh nngghhiiêênn ccứứuu vvàà hhooàànn tthhàànnhh lluuậậnn áánn nnààyy,, ttôôii đđãã nnhhậậnn

đđưượợcc ssựự ggiiúúpp đđỡỡ ttậậnn ttììnnhh ccủủaa ccáácc tthhầầyy ccôô,, ccáácc aannhh cchhịị,, bbạạnn bbèè đđồồnngg nngghhiiệệpp,,

nnhhữữnngg nnggưườờii tthhâânn ttrroonngg ggiiaa đđììnngg vvàà ccáácc ccơơ qquuaann ccóó lliiêênn qquuaann..

TTrrưướớcc hhếếtt,, ttôôii xxiinn bbààyy ttỏỏ llòònngg kkíínnhh ttrrọọnngg vvàà bbiiếếtt ơơnn hhaaii tthhààyy hhưướớnngg ddẫẫnn::

11,, GGSS..TTSS.. NNgguuyyễễnn TThhaannhh LLiiêêmm,, GGiiáámm đđốốcc bbệệnnhh vviiệệnn NNhhii TTrruunngg ưươơnngg,,

nnggưườờii tthhầầyy đđãã ttậậnn ttììnnhh hhưướớnngg ddẫẫnn,, đđộộnngg vviiêênn vvàà ttạạoo đđiiềềuu kkiiệệnn ttốốtt nnhhấấtt cchhoo ttôôii

hhọọcc ttậậpp vvàà nngghhiiêênn ccứứuu ttừừ đđầầuu kkhhooáá hhọọcc đđếếnn nnaayy..

22,, TTSS.. LLêê TThhịị ÁÁnnhh HHồồnngg,, TTrrưưởởnngg kkhhooaa vvii ssiinnhh BBệệnnhh vviiệệnn đđaa kkhhooaa ssaaiinntt--

ppaauull.. CCôô đđãã ttậậnn ttììnnhh hhưướớnngg ddẫẫnn,, cchhỉỉ bbảảoo,, đđộộnngg vviiêênn ttôôii ttrroonngg ssuuốốtt qquuáá ttrrììnnhh hhọọcc

ttậậpp ccũũnngg nnhhưư ttrroonngg qquuáá ttrrììnnhh vviiếếtt lluuậậnn vvăănn..

TTôôii xxiinn cchhâânn ttrrọọnngg ccảảmm ơơnn ggiiááoo ssưư VVàà ttậậpp tthhểể kkhhooaa vvii ssiinnhh,, pphhòònngg nngghhiiêênn

ccứứuu kkhháánngg tthhuuốốcc ccủủaa vvii kkhhuuẩẩnn-- pphhòònngg xxéétt nngghhiiệệmm llââmm xxàànngg-- bbệệnnhh vviiệệnn sseevveerraall

tthhuuộộcc đđạạii hhọọcc ttổổnngg hhợợpp yyoonnsseeii-- HHàànn QQuuốốcc đđãã ttậậnn ttììnnhh ggúúpp đđỡỡ ttôôii ccơơ ssởở tthhựựcc hhàànnhh,,

cchhỉỉ bbảảoo ttôôii hhọọcc,, tthhựựcc hhàànnhh vvàà llààmm nngghhiiêênn ccứứuu pphhụụcc vvụụ cchhoo đđềề ttààii ccủủaa ttôôii..

TTôôii vvôô ccùùnngg bbiiếếtt ơơnn ccáácc nnhhàà kkhhooaa hhọọcc ccủủaa hhộộii đđồồnngg cchhấấmm tthhii đđềề ccưươơnngg,,

hhộộii đđồồnngg cchhấấmm cchhuuyyêênn đđềề đđãã ggiiúúpp đđỡỡ vvàà cchhoo ttôôii nnhhữữnngg ýý kkiiếếnn qquuýý ggiiáá đđểể hhooàànn

tthhàànnhh lluuậậnn vvăănn nnààyy..

TTôôii xxiinn ttrrâânn ttrrọọnngg ccảảmm ơơnn bbaann GGiiáámm đđốốcc,, PPhhòònngg ssaauu đđạạii hhọọcc,, KKhhooaa vvii

kkhhuuẩẩnn-- VViiệệnn VVệệ ssiinnhh ddịịcchh ttễễ TTrruunngg ưươơnngg đđãã ttạạoo mmọọii đđiiềềuu kkiiệệnn tthhuuậậnn llợợii vvàà ggiiúúpp

đđỡỡ ttôôii ttrroonngg ssuuốốtt qquuáá ttrrììnnhh hhọọcc ttậậpp,, nngghhiiêênn ccứứuu ccũũnngg nnhhưư hhooàànn tthhàànnhh lluuậậnn áánn..

TTôôii xxiinn ttrrâânn ttrrọọnngg ccảảmm ơơnn ĐĐảảnngg uuỷỷ,, bbaann ggiiáámm đđốốcc,, pphhòònngg ttổổ cchhứứcc ccáánn

bbộộ,, pphhòònngg yy vvụụ,, llããnnhh đđạạoo vvàà ttậậpp tthhểể kkhhooaa vvii ssiinnhh bbệệnnhh vviiệệnn NNhhii TTrruunngg ưươơnngg đđãã

cchhoo ttôôii ccơơ hhộộii vvàà ttạạoo đđiiềềuu kkiiệệnn ggiiúúpp đđỡỡ ttôôii ttrroonngg qquuáá ttrrììnnhh hhọọcc ttậậpp vvàà ccôônngg ttáácc

đđểể ttôôii hhooàànn tthhàànnhh đđềề ttààii nngghhiiêênn ccứứuu..

TTôôii xxiinn bbààyy ttỏỏ ssựự bbiiếếtt ơơnn đđếếnn nnhhữữnngg nnggưườờii tthhâânn yyêêuu ttrroonngg ggiiaa đđììnnhh đđãã

đđộộnngg vviiêênn ggiiúúpp đđỡỡ ttôôii vvềề ttiinnhh tthhầầnn vvàà vvậậtt cchhấấtt đđểể ttôôii hhooàànn tthhàànnhh lluuậậnn áánn nnààyy..

TTôôii xxiinn ggửửii llờờii ccảảmm ơơnn ttớớii ccáácc bbạạnn bbèè,, đđồồnngg nngghhiiệệpp ggầầnn xxaa đđặặcc bbiiệệtt llàà

ccáácc aannhh cchhịị nngghhiiêênn ccứứuu ssiinnhh ccùùnngg kkhhooáá,, nnhhữữnngg nnggưườờii đđãã đđộộnngg vviiêênn,, kkhhíícchh llệệ

vvàà ggiiúúpp đđỡỡ ttôôii vvềề mmọọii mmặặtt đđểể ttôôii hhooàànn tthhàànnhh nnhhiiệệmm vvụụ ccủủaa mmììnnhh..

LLờờii ssaauu ccùùnngg ttôôii ggửửii ttớớii ggiiaa đđììnnhh,, đđặặcc bbiiệệtt llàà ccáácc ccoonn ggááii ttôôii,, nnggưườờii lluuôônn

ggiiàànnhh cchhoo ttôôii ttììnnhh ccảảmm yyêêuu tthhưươơnngg cchhâânn tthhàànnhh nnhhấấtt,, nnggưườờii lluuôônn ssáátt ccáánnhh,, đđộộnngg

vviiêênn,, cchhiiaa ssẻẻ vvàà ggiiúúpp ttôôii ccóó đđủủ nngghhịị llựựcc vvưượợtt qquuaa mmọọii kkhhóó kkhhăănn ttrroonngg ccuuộộcc

ssốốnngg đđểể llààmm vviiệệcc,, hhọọcc ttậậpp,, nngghhiiêênn ccứứuu vvàà hhooàànn tthhàànnhh lluuậậnn áánn nnààyy..//..

CCHHỮỮ VVIIẾẾTT TTẮẮTT

::DDeeooxxyyrriibboonnuucclleeiicc aacciidd

AADDNN

:: AAmmeerriiccaann TTyyppee ccuullttuurree ccoolllleeccttiioonn

AATTCCCC

:: CClliinniiccaall aanndd llaabboorraattoorryy ssttaannddaarrddss IInnssttiittuuttee

CCLLSSII

:: EEtthhyylleenneeddiiaammiinneetteettrraa aacceettiicc aacciidd

EEDDTTAA

:: MMiinniimmaall IInnhhiibbiittoorryy ccoonncceennttrraattiioonn

MMIICC

NNKKHHHHCCTT

:: nnhhiiễễmm kkhhuuẩẩnn hhôô hhấấpp ccấấpp ttíínnhh

:: NNhhiiễễmm ssắắcc tthhểể

NNSSTT

:: ppoollyymmeerraassee cchhaaiinn rreeaaccttiioonn

PPCCRR

:: ppuullsseedd ffiieelldd GGeell EElleeccttrroopphhoorreessiiss

PPFFGGEE

:: wwoorrlldd hheeaalltthh oorrggaanniizzaattiioonn

WWHHOO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giống Klebsiella là một trong các hệ vi khuẩn có ở đường tiêu hóa, hô hấp của

người. Nó có thể sống trong tự nhiên. Các loài Klebsiella spp. (K. pneumoniae, K.

ozane,...) là căn nguyên của một số bệnh nhiễm khuẩn ở người (nhiễm khuẩn hô hấp,

tiết niệu, nhiễm trùng huyết,...), gây bệnh chủ yếu ở trẻ nhỏ. Đặc biệt, Klebsiella spp

là một trong những vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Vi khuẩn này có

khả năng kháng kháng sinh ngày một gia tăng, nhất là những chủng sinh men β-

lactamase phổ rộng hoặc cephalosporinase [3], [40].

Trên thế giới loài Klebsiella spp là một trong những căn nguyên quan trọng

gây nhiễm khuẩn ở bệnh nhi nằm điều trị tại bệnh viện đặc biệt là những trẻ sơ sinh

non yếu và trẻ nhỏ. Có sự xuất hiện những chủng đa kháng kháng sinh và là nguyên

nhân tử vong của nhiều bệnh nhân. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella ở trong bệnh

viện đặc biệt là những đơn vị hồi sức cấp cứu rất khác nhau giữa các nước từ 10,2%-

26,2% [3], [68]. Tình trạng kháng với hầu hết các kháng sinh đang là một mối đe doạ

lớn đối với thầy thuốc và người bệnh. Với kháng sinh thông thường như Ampicillin,

Cephazolin, Klebsiella spp. đã kháng cao 60%-100% [3]. Phát hiện gen kháng kháng

sinh nhóm quinolon lan truyền qua plasmid là mốc quan trọng trong nghiên cứu về

gen kháng kháng sinh của vi khuẩn này[78]. Xuất phát từ tình trạng trên đã có nhiều

nghiên cứu về cơ chế kháng kháng sinh được tiến hành với mục đích tìm căn nguyên

của sự gia tăng tính kháng kháng sinh của Klesiella, trong đó cơ chế kháng

cephalosporin thế hệ 3 và quinolon được nghiên cứu ở nhiều nước.

Ở Việt Nam, Klebsiella là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn hô hấp

phân lập được chủ yếu ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ nằm điều trị tại bệnh viện, chủ yếu

tại các đơn vị hồi sức cấp cứu. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. thay đổi theo

các yếu tố khác nhau: đối tượng nhiễm bệnh, lứa tuổi bệnh nhân…Thêm vào đó, tỷ

lệ chủng Klebsiella spp. kháng và đa kháng kháng sinh cao với ampicillin và

cephalotin kháng 97,8% và 91,7% ở trẻ em [1], [4], [15], [16]. Những nghiên cứu

tìm hiểu về tình trạng mang gen mã hóa sinh men β-lactamase phổ rộng gây kháng

cephalosporin thế hệ 3 và quinolon lan truyền qua plasmid chưa được thực hiện nhiều

ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu:

1- Xác định tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của các

bệnh nhi 0 đến 6 tuổi tại Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2009-2010.

2- Xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập

được.

3- Xác định tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của

các chủng Klebsiella phân lập được.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Các đặc điểm về giải phẫu, sinh lý và miễn dịch hệ hô hấp [14]

1.1.1. Các đặc điểm về giải phẫu

Bộ máy hô hấp bao gồm từ mũi họng đến thanh quản, khí quản, phế quản,

tiểu phế quản, phổi, màng phổi. Dựa vào vị trí các đoạn của bộ máy hô hấp, người

ta phân chia ra đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới. Ranh giới phân chia là nắp

thanh quản (đoạn trên nắp thanh quản là đường hô hấp trên, đoạn dưới nắp thanh

quản là đường hô hấp dưới).

- Viêm đường hô hấp trên bao gồm: viêm mũi, viêm họng, viêm amidal.

- Viêm đường hô hấp dưới bao gồm: viêm thanh quản, khí quản, viêm phế

quản, viêm tiểu phế quản, viêm phổi.

1.1.2. Đặc điểm sinh lý

- Bộ máy hô hấp trẻ em chưa hoàn chỉnh những năm đầu đời.

- Các đường dẫn khí ngắn, nhiễm trùng đường hô hấp trên dễ lan xuống

đường hô hấp dưới. Do đó, bệnh lý hô hấp ở trẻ nhỏ ít khi khu trú ở đường hô hấp

trên, mà dễ đưa tới viêm phổi.

- Sức cản đường hô hấp rất lớn, sự giãn nở của lồng ngực kém, công thực

hiện hô hấp lớn. Trong bệnh lý đường hô hấp, do niêm mạc có nhiều mạch máu nên

dễ bị xung huyết, phù nề, xuất tiết càng làm hẹp đường thở sức cản tăng lên, gây rối

loạn thông khí.

- Thành phế quản mềm, tổ chức liên kết lỏng lẻo dễ bị biến dạng, chèn ép.

- Do diện tích phế nang ít, mạng lưới mạch máu nhiều để bão hòa oxy trong

máu nên trẻ dễ bị suy hô hấp khi nhu mô phổi bị tổn thương.

Ở trẻ em, do đặc điểm cấu tạo của bộ máy hô hấp, việc thực hiện hô hấp có

nhiều cản trở, trong khi nhu cầu về chuyển hóa rất cao, nên bình thường trẻ phải cố

gắng để thở. Khi bị bệnh, khả năng hô hấp duy trì kém, lực cản trở tăng cao, làm

cho trẻ dễ bị suy hô hấp. Thêm vào đó, các tổ chức lympho chưa phát triển, việc sản

xuất kháng thể tại chỗ và toàn thân kém, chưa có hệ thống miễn dịch đặc hiệu làm

cho trẻ dễ bị mắc nhiễm trùng đường hô hấp.

1.1.3. Cơ chế miễn dịch bảo vệ đường hô hấp

Vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp, chúng gặp phải

hệ thống bảo vệ đường hô hấp gồm:

1.1.3.1. Hàng rào niêm mạc:

Lớp màng nhầy của niêm mạc đường hô hấp ngăn cản vi sinh vật bám và

xâm nhập.

Các vi nhung mao đường hô hấp luôn luôn rung động, tạo ra những lớp sóng

từ dưới lên trên, đẩy vi sinh vật ra ngoài nhờ phản xạ ho và hắt hơi, ngăn cản một

phần vi sinh vật xâm nhập vào đường hô hấp dưới.

Sự cạnh tranh giữa các vi sinh vật sống cộng sinh ở đường hô hấp trên và các

vi sinh vật gây bệnh xâm nhập. Vi sinh vật sống cộng sinh, chiếm mất vị trí bám

(receptor) của vi sinh vật gây bệnh, nên vi sinh vật gây bệnh không bám được vào

các receptor đặc hiệu.

IgA có ở niêm mạc của đường hô hấp trên, sẽ kết hợp đặc hiệu với các kháng

nguyên của vi sinh vật gây bệnh, làm cho chúng không xâm nhập được vào tế bào

đường hô hấp để nhân lên và gây bệnh.

1.1.3.2. Các tế bào thực bào:

Đại thực bào, hệ thống võng nội mô bắt và tiêu diệt các vi sinh vật xâm nhập

vào cơ thể qua con đường hô hấp.

Tế bào NK (natural killer) là tế bào lympho ngoại vi, có tác dụng tiêu diệt

các tế bào đích.

Các tế bào lympho TC có tác dụng tiêu diệt tế bào đích như tế bào nhiễm virut,

TCD8 ức chế hoạt động của các tế bào lympho khác ở dạng biệt hóa.

Ngoài ra, các tế bào lympho khác như T hỗ trợ hay TCD4 với chức năng điều hòa miễn dịch, nên có vai trò rất quan trọng trong cơ thể chống lại các bệnh nhiễm

trùng.

1.1.3.3. Các yếu tố thể dịch:

Kháng thể tham gia bảo vệ, chống lại vi sinh vật gây bệnh, xâm nhập vào cơ

thể qua con đường hô hấp, theo cơ chế bảo vệ đặc hiệu.

Bổ thể được hoạt hóa theo con đường cổ điển (phức hợp miễn dịch) hoặc

theo con đường tắt (không cần phức hợp miễn dịch), có tác dụng chống lại các bệnh

nhiễm trùng.

Interferon "IFN" là yếu tố chống nhiễm trùng không đặc hiệu; có tác dụng

ngăn cản sự nhân lên của virut như IFN alpha và beta.

Khi nắp thanh quản đóng lại là ranh giới giữa đường hô hấp trên và đường hô

hấp dưới.

1.2. Các căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em [8],[2].

1.2.1. Các căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em

Căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em có tới 300 loài vi

khuẩn,virus khác nhau có khả năng gây bệnh.

* Tác nhân virus: Đa số các trường hợpnhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em là

do virus (60-70%) vì: Phần lớn các virus có ái lực với đường hô hấp, khả năng lây

lan của virus dễ dàng, tỉ lệ người lành mang virus cao, khả năng miễn dịch của trẻ

với virus có thể chưa có hoặc yếu.

Các tác nhân virus thường gặp là: Cúm A, cúm B, Virus hô hấp hợp bào

(RSV- Respiratory syncytial virus), các Adenovirus....

vào địa dư, lứa tuổi, trình độ văn hóa và kinh tế.

+ Các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng cộng đồng:

Heamophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moracellacatarrhalis,

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae.

+ Các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng bệnh viện: S.

aureus, P. aeruginosa, Các trực khuẩn Gram âm dễ mọc khác, Klebsiella

pneumoniae, các Enterobacteriaceae khác.

* Tác nhân vi khuẩn: nhiễm trùng hô hấp cấp tính do vi khuẩn phụ thuộc

1.2.2. Klebsiella trong NKHHCT

Chi Klebsiella thuộc bộ Klebsiellae, là thành viên của họ vi khuẩn đường

ruột Enterobacteriaceae do nhà vi sinh học người Đức - Edwin Klebs tìm ra năm

1980. Chi Klebsiella gồm các loài: K. pneumoniae, K. oytoca, K. oaenae, K.

panticola, K.onithicrocytica, K.rhinosclersmatis, K.terrigena

K. pneumoniae là loài quan trọng thường gặp trong nhiễm khuẩn bệnh viện.

Là loài vi khuẩn thường gặp nhất gây bệnh ở những bệnh nhân nằm viện kéo

dài, là căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới ở những bệnh

nhân nằm viện có thiếu hụt miễn dịch như trẻ nhỏ, người có tuổi, những người bị

bệnh đường hô hấp. Nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. trong cộng đồng thường liên

quan tới những người miễn dịch kém gặp trong nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính

(NKHHCT), nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết… Những báo cáo về bùng

phát nhiễm khuẩn bệnh viện do nhiễm khuẩn Klebsiella spp. kháng với nhiều kháng

sinh ở trẻ nhỏ và là nguyên nhân lan truyền kháng thuốc qua plasmid

[7],[40],[64],[118].

 Đặc điểm sinh học

- Hình thể: Klebsiella spp. là trực khuẩn gram âm to, hoặc cầu trực khuẩn, dài 1 -

2 m, rộng 0,5 - 1,5 m có thể bắt màu đậm hai đầu, có vỏ, không di động. Ở dạng

khuẩn lạc R, có thể có hình trực khuẩn to, dài từ 3 - 5 m.

- Nuôi cấy: Klebsiella spp. mọc dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông

thường, lên men các loại đường, không tạo Indol không hủy gelatin, phân hủy urê

chậm, tạo hơi và không tạo H2S.

- Đề kháng: giống như các vi khuẩn đường ruột khác, chúng dễ bị các hoá chất

khử trùng diệt nhưng có khả năng tồn tại lâu ở ngoại cảnh (nước, đất).

- Kháng nguyên và phân loại: Klebsiella spp. ngoài kháng nguyên O còn có

kháng nguyên K. Tính đặc hiệu kháng nguyên vỏ này do bản chất polisacarit của vỏ

quyết định. Kháng nguyên K mang tính chất đặc hiệu týp (77 týp). Týp 1 và 2 hay

gặp nhất, kháng nguyên O có 9 týp và ít được dùng để phân loại.

 Khả năng gây bệnh:

Klebsiella spp. có thể gây tổn thương ở hầu hết các cơ quan của cơ thể : viêm

xoang ,viêm họng , viêm màng não, viêm phúc mạc,...đáng chú ý là trẻ em có thể bị

viêm ruột do loài vi khuẩn này. Nó là căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn hô

hấp, nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn mô mềm ở nhiễm

khuẩn bệnh viện. Klebsiella spp. lan rộng và nhanh trong môi trường bệnh viện qua

tay nhân viên y tế và đường tiêu hoá [19], [30],[ 92],[101].

 Dịch tễ học [30],[96]

Klebsiella spp. tồn tại trong tự nhiên và trong cơ thể người như hầu họng,

đường tiêu hóa, các mô mềm..., gây bệnh khi có cơ hội (gây bệnh ở những người

suy giảm miễn dịch, có can thiệp thủ thuật y tế như đặt nội khí quản thở máy hay

dùng kháng sinh kéo dài)

Nhiễm khuẩn do K.pneumoniae và K. oxytoka thường gặp nhất ở người.

Chúng thường lan truyền qua chăm sóc y tế và qua đường tiêu hóa, có thể lan truyền

nhanh chóng và gây bùng phát dịch trong bệnh viện.

Nhiễm khuẩn hô hấp do Klebsiella gây viêm, hoại tử và xuất huyết trong

nhu mô. Thường gặp ở những người nghiện rượu, tiểu đường, bệnh phổi mãn tính

và đặc biệt là trẻ sơ sinh và sơ sinh non yếu.

Sử dụng kháng sinh rộng rãi trong các bệnh nhân nằm viện đã dẫn đến khả

năng gia tăng các chủng Klebsiella mang gen kháng kháng sinh đặc biệt là các

chủng có men β-lactamase phổ rộng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh. Hầu

hết dịch bùng phát do lan truyền gen kháng ở những chủng Klebsiella gây nhiễm

khuẩn hô hấp, tiết niệu và mô mềm, ngoài ra các can thiệp thủ thuật và chăm sóc ở

các khoa hồi sức cấp cứu làm gia tăng và lây lan các chủng Klebsiella kháng thuốc

[115], [117].

-Tần xuất gây bệnh: Klebsiella có vai trò lớn trong nhiễm trùng ở trẻ em. Chiếm

8% các nhiễm trùng của bệnh viện. 14% nhiễm khuẩn huyết nguyên phát do

Klebsiella là nguyên nhân đứng thứ 2 sau E.coli. Nhiễm trùng đường hô hấp và tiết

niệu chiếm ưu thế.

Trong số 145 báo cáo bùng phát nhiễm trùng bệnh viện từ 1983- 1991 có

13 báo cáo được quy kết là do Klesiella. Các trung tâm kiểm soát dịch bệnh và

phòng chống chủng Klesiella cho thấy có 3% nguyên nhân bùng phát dịch bệnh do

Klesiella.

Một cuộc điều tra Klesiella pneumoniae carbamenemase (KPC) ở những

bệnh nhân nhiễm khuẩn đường ruột trong năm 2011 thấy sự lan truyền rộng rãi

KPC trong 4 huyện liền kề ở Ấn Độ trong 1 năm. Hướng dẫn kiểm soát chăm sóc

trong bệnh viện và giáo dục vô khuẩn trong các thiết bị chăm sóc sức khỏe là rất

quan trọng trong kiểm soát KPC [30], [42].

+ Ở quốc tế:

Bùng phát nhiễm khuẩn huyết ở trẻ sơ sinh trên khắp thế giới, nhiễm trùng

khác do Klesiella. cũng gặp trên toàn thế giới. Thường gặp ở các khu vực Đông Âu,

Nam Á, Trung Phi và châu Mỹ la tinh.

- Tuổi:+ Nhiễm khuẩn Klesiella. mắc phải ở cộng đồng là người già, trung niên

với bệnh mãn tính, người nghiện rượu.

+ Nhiễm khuẩn bệnh viện với cả trẻ em và người lớn, xuất hiện nhiều hơn

ở trẻ đẻ non và những bệnh sơ sinh nằm hồi sức cấp cứu, bệnh nhân suy giảm miễn

dịch....

1.3. Phương pháp chẩn đoán vi sinh trong nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính

1.3.1. Phương pháp thông thường[ 2]

 Bệnh phẩm : đờm, dịch nội khí quản,dịch rửa phế quản, dịch hút đờm trên

khí quản qua đường mũi

 Xác định căn nguyên vi khuẩn:

Tính chất đại thể

Điểm

Mẫu đờm

10 - 25 bạch cầu

> 25 bạch cầu

nhầy, mủ, mủ nhầy

10 - 25 tế bào vẩy

-1

Bảng 1.1. Thang điểm bartlett dùng đánh giá mẫu bệnh phẩm đường hô hấp

-2

> 25 tế bào vẩy

Mẫu đờm hút qua mũi, nội soi phế quản

10 - 25 bạch cầu

> 25 bạch cầu

tế bào trụ

-1

10 - 25 tế bào vẩy

-2

> 25 tế bào vẩy

Ly tâm lấy cặn từ dịch nội khí quản,dịch rửa phế quản, dịch hút đờm trên khí quản qua đường mũi

Đờm không rửa nếu không có nước bọt

Nhuộm Gram

Điểm bartlett≥0

Quan sát Kính hiển vi x 100 đánh giá mẫu = thang điểm Bartllett

Điểm bartlett=1

Yêu cầu lấy lại mẫu không nuôi cấy

Định danh sơ bộ

Cấy tăng sinh (18- 24) giờ

Kháng sinh đồ

Định danh

Kết quả trung cuộc

Rửa đờm lẫn nhiều nước bọt với 5ml nước muối sinh lý Đờm D0 Điểm bartlett>2 Cấy: thạch máu, sôcôla, Maconkey và môi trường chọn lọc nếu có Chọn vi khuẩn đích trên môi trường cấy D1 D2

*Sơ đồ 1.1. Sơ đồ nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn theo

phương pháp thông thường

1.3.2. Phương pháp cấy đếm

 Bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm để xác định căn nguyên gây NTHHCT ở trẻ em được lấy là bệnh phẩm họng hoặc dịch tỵ hầu cho đường hô hấp trên; Là đờm, dịch phế quản cho đường hô hấp dưới. Cách lấy và vận chuyển mẫu bệnh phẩm được thực hiện theo thường quy của Tổ chức Y tế thế giới (WHO).

 Xác định căn nguyên vi khuẩn  Nuôi cấy, phân lập, xác định căn nguyên vi khuẩn:

Thực hiện theo thường quy của WHO và Viện Y học Nhiệt đới thuộc đại học Nagasaki- Nhật Bản[7], [17], [59], [79], [93], [116].

* Sơ đồ nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn theo phương pháp

cấy đếm.

1.4. Một số kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn gây bệnh với kháng

sinh

1.4.1. Kháng sinh và cơ chế kháng kháng sinh

1.4.1.1. Kháng sinh

 Định nghĩa

Kháng sinh là những chất do vi nấm hoặc vi khuẩn tạo ra, hoặc do bán tổng

hợp, có khi là chất hóa học tổng hợp, mà ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức

chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách đặc hiệu nhưng ít độc hoặc không độc cho cơ

thể [18],[31], [72], [99].

Mỗi thuốc kháng sinh chỉ gây rối loạn một phản ứng sinh học nhất định trong

tế bào vi khuẩn. Nhìn vào sơ đồ cấu tạo tế bào vi khuẩn, thuốc kháng sinh có thể tác

động vào các vị trí sau: vách, màng nguyên tương, ribosom trong nguyên tương và

bộ máy di truyền (hình 1).

Hình 1.1. Vị trí tác động của thuốc kháng sinh lên tế bào vi khuẩn [18]

1. Vách; 2. Màng tế bào vi khuẩn; 3. Ribosom trong nguyên tương;

4. Bộ máy di truyền.

1.4.1.2. Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh lên tế bào vi khuẩn [18]

 Kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách

Các kháng sinh với cơ chế tác động này có thể làm gẫy các cầu ngang peptid

của khung glycopeptid, hoặc tác động vào giai đoạn đầu hay giai đoạn cuối của quá

trình sinh tổng hợp khung glycopeptid, làm cho vi khuẩn không có vách do đó dễ bị

hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt. Các kháng sinh với cơ chế tác động này

thuộc nhóm -lactam và các kháng sinh fosfomycin, vancomycin, teicoplanin cũng

tác động vào giai đoạn cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp khung glycopetid.

 Kháng sinh tác động trên màng nguyên tương

Kháng sinh có tác dụng gây rối loạn tính thấm của màng nguyên tương làm

thoát các thành phần trong tế bào ra ngoài, hoặc tác động lên các phân tử cấu tạo

màng nguyên tương, làm cho tế bào vi khuẩn không thể tiếp tục nhân lên được nữa.

Kháng sinh polimyxin, gramicidin, tyrocidin có cơ chế tác động này.

 Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

Kháng sinh có tác dụng gây rối loạn sự tổng hợp protein do gắn với các

ribosom ở các tiểu đơn vị 30 S hoặc 50 S dẫn đến cản trở sự kéo dài của chuỗi acid

amin trong quá trình tổng hợp protein. Kháng sinh tác động theo cơ chế này có các

Kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, cloramphenicol, macrolid, lincosamid,

streptogramin, Tetracyclin.

 Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp acid nucleic

Kháng sinh có tác dụng gây rối loạn sự tổng hợp ARN hoặc ADN của tế bào

vi khuẩn như rifamycin, kháng sinh thuộc nhóm quinolon, novobiocin .

 Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp acid folic

Cơ chế tác động: acid folic là một coenzym đóng vai trò chủ đạo trong nhiều

phản ứng chuyển hóa tạo acid amin, các purin và pyrimidin. Trong quá trình tổng

hợp acid folic, tế bào vi khuẩn cần phải có acid para - aminobenzoic, acid glutamic

và nhiều enzym trong đó có: dihydropteroat synthetase, dihydrofolat reductase. Một

số thuốc kháng sinh đã tác động vào quá trình này làm cho các acid folic không

được tạo ra, vì vậy nó đã tác động gián tiếp đến quá trình sinh tổng hợp các acid

nucleic và protein của tế bào vi khuẩn như sulfamid, trimethoprim.

1.4.2.Cơ chế đề kháng kháng sinh

1.4.2.1. Định nghĩa

Trong mối quan hệ giữa vi khuẩn và kháng sinh thì sự đề kháng được hiểu là

khả năng chống đối của vi khuẩn đối với kháng sinh và hóa chất điều trị.

1.4.2.2. Các yếu tố làm cho vi khuẩn không chịu tác dụng của thuốc

kháng sinh

 Thuốc

- Liều lượng điều trị quá thấp hoặc thời gian điều trị quá ngắn

- Chọn sai thuốc: Do thầy thuốc chọn kháng sinh điều trị không phù hợp với

ổ nhiễm trùng. Cho kháng sinh điều trị không dựa trên kết quả kháng sinh đồ.

- Thuốc hỏng: do mua phải thuốc hết hạn sử dụng, hoặc còn hạn nhưng bảo

quản không tốt, hay chất lượng không bảo đảm nên hoạt tính kháng sinh không có.

- Kết quả kháng sinh đồ được xác định trên một chủng mà nó không phải là

căn nguyên chính gây nhiễm trùng.

- Phối hợp hai kháng sinh có tính đối kháng nhau nên nó làm mất tác dụng

của nhau.

 Người bệnh

- Do cơ địa của người bệnh: trong một số trường hợp như giảm bạch cầu hạt,

thiếu hụt globulin miễn dịch, suy giảm miễn dịch... Mặc dù kháng sinh được chọn là

thích hợp và đến được ổ nhiễm khuẩn nhưng bệnh vẫn còn vì kháng sinh chỉ có tác

dụng ức chế vi khuẩn nếu bệnh nhân có tình trạng miễn dịch kém sẽ không diệt

được vi khuẩn.

- Tuổi tác của bệnh nhân: với những bệnh nhân còn quá non (trẻ sơ sinh)

hoặc quá lớn tuổi do khả năng hấp thu thuốc kém và khả năng gắn thuốc vào protein

huyết tương kém nên nồng độ kháng sinh ở trong máu và trong tổ chức rất thấp sẽ

làm ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị [9], [16].

1.4.2.3.Vi khuẩn đề kháng kháng sinh

Theo như định nghĩa trên thì sự đề kháng ở đây được hiểu là khả năng chống

đối của vi khuẩn đối với kháng sinh và hóa chất điều trị. Khả năng đề kháng của vi

khuẩn bao gồm khả năng tự nhiên (đề kháng tự nhiên) và khả năng thu được (đề

kháng thu được) [70] .

 Đề kháng tự nhiên

- Định nghĩa: đề kháng tự nhiên là khả năng đề kháng một số kháng sinh nhất định của

một loài vi khuẩn nào đó mang đặc tính di truyền bình thường của loài.

- Ví dụ: Escherichia coli không chịu tác dụng của erythromycin, tụ cầu

không chịu tác dụng của colistin và nalidixic acid, Pseudomonas aeruginosa bền

vững với penicillin G.

 Đề kháng thu được

- Định nghĩa: đề kháng thu được là khả năng đề kháng một hay nhiều kháng sinh do

biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng.

- Những đề kháng thu được có thể là do:

. Đột biến trên NST: qua các thử nghiệm sao chép đĩa của Lederberg (1952)

có thể giải thích được vi khuẩn đề kháng thuốc là do đột biến.

. Nhận được gen đề kháng qua các hình thức vận chuyển di truyền như: tiếp

hợp khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau, biến nạp khi vi khuẩn bị ly giải và

giải phóng ra ADN tự do hoặc tải nạp nhờ phagiơ hoặc do một thành phần di truyền

di động (transposons).

1.4.2.4. Cơ chế hóa sinh và di truyền học của đề kháng thu được ở vi

khuẩn

 Cơ chế sinh hóa của sự đề kháng thu được [18], [50]

- Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương

- Làm thay đổi đích tác động

- Làm cho kháng sinh thoát ra ngoài màng tế bào vi khuẩn quá mức

- Tạo ra các enzym ức chế tác động của kháng sinh:

 Cơ sở di truyền học của sự đề kháng thu được

 Đề kháng thu được do đột biến trên NST

Đột biến thường xảy ra ở giai đoạn sao chép các bazơ purin và pyrimidin

trong quá trình tổng hợp của ADN, các ADN mới được tổng hợp sẽ không còn

giống với phiên bản của ADN thế hệ trước [48].

 Đề kháng thu được do nhận được gen đề kháng qua các hình thức

vận chuyển di truyền[12].

 Biến nạp

Là hiện tượng một phần nhỏ ADN tự do của vi khuẩn cho vào được tế bào vi

khuẩn nhận, gắn vào bộ gen của vi khuẩn nhận, quyết định tính chất mới của vi

khuẩn này và tính chất này có thể di truyền.

 Tải nạp

Tải nạp là hiện tượng chuyển gen từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua

một phagiơ ôn hòa làm trung gian, phagiơ này gọi là phagiơ tải nạp.

 Tiếp hợp

Tiếp hợp là hiện tượng chuyển gen từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác khi có sự

tiếp xúc trực tiếp của vi khuẩn cho (được gọi là vi khuẩn đực) và vi khuẩn nhận (được

gọi là vi khuẩn cái). Để có thể tiếp hợp được vi khuẩn cho phải có pili giới tính và toàn

bộ hay một phần vật liệu di truyền sẽ được chuyển từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận

qua cầu nối pili đó.

Hình 1.2. Sự lan truyền gen kháng thuốc

bằng hình thức thông qua các R-plasmid [109]

 Thành phần di truyền di động (transposons - gen nhảy)

Là một thành phần của một đơn vị sao chép hoặc là plasmid, nhiễm sắc thể

hoặc là phagiơ nhờ hai chuỗi tận cùng ở hai đầu để chuyển vị trí từ một phân tử

ADN này sang một phân tử ADN khác không cần có sự đồng dạng của hai phân tử

ADN (nó có thể chuyển từ plasmid này sang plasmid khác, hay từ plasmid vào NST

hoặc genom của một phagiơ tải nạp) [69].

Hình 1.3. Đề kháng thu được do nhận được gene nằm trên Integron [109 ]

 Cơ chế lan truyền gen đề kháng

Theo Wiedemann (1983) [121], gen đề kháng lan truyền trên bốn phương

diện:

- Trong tế bào (intracellular): qua các sự kiện tái tổ hợp kinh điển hay tái tổ

hợp bất hợp pháp tức là chuyển vị trí nhờ transposon.

- Giữa các tế bào (intercellular): qua các hình thức vận chuyển di truyền như: tiếp

hợp, dẫn truyền, biến nạp, tải nạp. Tuy là hiện tượng ít gặp nhưng là tiền đề cho những

hậu quả tiếp theo có ý nghĩa quan trọng về mặt số lượng.

- Trong quần thể vi khuẩn (microbiotop): thông qua sự chọn lọc và giữ lại

những cá thể đề kháng trong vi hệ đường ruột hay trên da hoặc niêm mạc của bệnh

nhân khi người này dùng kháng sinh.

- Trong quần thể đại sinh vật (macrobiotop): có thể thành dịch do lây lan từ

người này sang người khác qua các dụng cụ thăm khám, dụng cụ phẫu thuật, thức

ăn, không khí... bị nhiễm vi khuẩn đề kháng. Đây là điểm đặc biệt cần quan tâm ở

các bệnh viện, nhằm phòng ngừa nhiễm khuẩn bệnh viện.

Hình 1.4. Giới thiệu các cơ chế khác nhau của sự lan truyền ngang các gene mã

hóa sự kháng thuốc của vi khuẩn [109]

1.4.2.5. Các cơ chế đề kháng kháng sinh họ vi khuẩn đường ruột với kháng

sinh nhóm beta - lactam

 Đề kháng tự nhiên

Một số chủng thuộc họ vi khuẩn đường ruột có khả năng đề kháng tự nhiên với

kháng sinh nhóm -lactam, nó mang đặc tính di truyền bình thường của loài.

Nghiên cứu trên những chủng vi khuẩn họ đường ruột với các kháng sinh khác nhau

trong nhóm -lactam đã cho phép người ta xác định được những kiểu cách đề

kháng tự nhiên khác nhau của chúng [112].

 Đề kháng tự nhiên do sinh ra enzym -lactamase

 Đề kháng tự nhiên không do sinh ra enzym -lactamase

Một số vi khuẩn đường ruột đề kháng tự nhiên với kháng sinh thuộc nhóm -

lactam là do thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn đối với kháng sinh thuộc

nhóm này [63], [82].

 Đề kháng thu được

Các chủng vi khuẩn họ đường ruột có thể đề kháng với kháng sinh nhóm -

lactam theo cơ chế đề kháng thu được (do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ

không có trở thành có gen đề kháng). Sự đề kháng này làm thay đổi các kiểu cách

đề kháng tự nhiên của chúng. Những gen đề kháng thu được này có thể làm cho vi

khuẩn sinh ra enzym -lactamaza, làm thay đổi tính thấm của màng tế bào hoặc làm

thay đổi đích bám của kháng sinh lên màng tế bào vi khuẩn (làm thay đổi đích bám

PBP).

 Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra enzym -lactamase

 Vi khuẩn sinh ra enzym penicillinase do nhận được gen đề kháng

nằm trên plasmid

- Sinh ra penicillinase ở mức độ cao: những vi khuẩn họ đường ruột khi nhận

được gen đề kháng nằm trên plasmid nó có thể sinh ra enzym penicillinase ở mức

độ cao, những enzym này đã được xác định là các -lactamase phổ rộng ( TEM-1,

TEM-2, SHV-1...) [72]. Những chủng này sẽ kháng lại các kháng sinh: penicillin,

cephalosporin thế hệ I và II (trừ cephoxitin). Các kháng sinh cephalosporin thế hệ

III, các monobactam và các carbapenem thì không bị phá hủy bởi enzym này. Các

enzym này bị ức chế bởi các chất ức chế -lactamase.

- Sinh ra -lactamase phổ mở rộng(ESBL): một số vi khuẩn họ đường ruột

khi có khả năng sinh ra các -lactamase phổ rộng và nhờ đột biến nên đã mở rộng

tác dụng của các enzym này tới kháng sinh cephalosporin thế hệ III (trừ các kháng

sinh: cephamycin, cefoxitin, cefotetan, lactamoxef và carbapenem là không bị phá

hủy bởi enzym này) như: enzym CTX-1/ TEM-3, TEM-4, CAZ-1/TEM-5, SHV-2,

SHV-3... [106], [95]. Các enzym -lactamaza phổ mở rộng này thường gặp ở loài

Klebsiella pneumoniae và chúng bị ức chế bởi các chất ức chế -lactamase. Ở một

số loài như E. coli, E. cloacae... sinh ra enzym này nhờ có gen mã hóa nằm trên

plasmid [83], [86], [94].

- Sinh ra -lactamase kháng lại chất ức chế -lactamase: một số chủng

đường ruột có những bước đột biến sinh ra các enzym mới đề kháng với chất ức chế

-lactamase, đã tìm thấy ở E. coli theo Vedel (1992) [111].

Những chủng đường ruột sinh ra enzym penicillinase do nhận được gen đề

kháng nằm trên plasmid thường cũng kháng với các kháng sinh thuộc nhóm

aminosid, chloramphenicol, trimethoprim và sulfamid do những gen mã hóa sự đề

kháng với các nhóm kháng sinh này cùng nằm trên một plasmid [100].

 Vi khuẩn tăng cường sản xuất ra enzym penicillinase do gen đề

kháng nằm trên nhiễm sắc thể

Tăng cường sản xuất enzym penicillinaza ở K. oxytoca: những chủng của

loài K. oxytoca kháng kháng sinh thuộc nhóm -lactam ở mức cao vì có sự tăng

cường sản xuất enzym penicillinase nhờ gen mã hóa nằm trên NST theo tác giả

Lambia và cộng sự năm 1986 [73].

 Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra enzym

cephalosporinase do gen mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể

Sinh ra enzym cephalosporinase nhờ gen mã hóa nằm trên NST thường gặp ở

loài E. cloacae, S. marcescens, E. coli trong họ vi khuẩn đường ruột:

- Tăng cường sản xuất enzym cephalosporinase: những loài này bình thường

chúng kháng kháng sinh nhóm -lactam theo cơ chế đề kháng tự nhiên, do sinh ra

enzym cephalosporinase cảm ứng và khi có sự đột biến ở gen điều hoà trong quá

trình sinh tổng hợp enzym, nên đã tăng cường sản xuất enzym này. Cơ chế này

được mô tả bởi hai tác giả Nicolas (1987) và Cole (1988) [37], [90].

- Tăng cường sản xuất enzym cephalosporinase ở loài E. coli là do hậu quả

của sự khuếch đại gen hoặc do có sự thiết lập những gen điều hòa mới theo

Normark (1977) và Cole (1988) [88], [37].

Những chủng đường ruột đề kháng kháng sinh nhóm -lactam do tăng cường

sản xuất ra enzym -lactamase (penicillinase hoặc cephalosporinase) do gen đề

kháng nằm trên nhiễm sắc thể thường nhạy cảm với các kháng sinh thuộc nhóm

khác.

 Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra các enzym -lactamase khác

- Năm 1989-1990, hai tác giả Bauernfeind và Papanicolaou đã tìm thấy ở

loài K. pneumoniae sinh ra enzym -lactamase kháng lại kháng sinh cephamycin

(CMY-1, MIR-1), gen mã hóa nằm trên plasmid [91].

- Enzym immipenemase cũng đã được tìm thấy ở các loài S. marcescens và

E. cloacae bởi các tác giả Yang (1990), Lee và Raimondi (1991) [74], [97].

- Các Beta Lactamase mới [6]

* TEM-TYPE ESBLs (Lớp A): việc thay thế amino acid ở nhiều vị trí ở

TEM-1 beta-lactamase có thể được tạo ra ở phòng thí nghiệm mà không mất hoạt

tính. Sự thay đổi vị trí này của ESBLs làm thay đổi hình dạng vị trí hoạt hóa của

men, cho phép thâm nhập oxyimino-beta-lactam. Việc mở vị trí hoạt hóa của enzym

với beta-lactam làm gia tăng tính nhạy cảm của enzymvới beta-lactamase inhibitor

(vd: clavulanic acid). Sự thay đổi amino acid của men có thể gây ra các dạng

ESBLs có thể đề kháng với chất ức chế, tuy nhiên sự kết hợp giữa đề kháng và hoạt

tính phổ rộng của enzym có vẻ như không tương thích (ngoại lệ hiếm gặp). Trên

130 men TEM đã được tìm thấy, và sự đa dạng của chúng có lợi cho việc theo dõi

sự lan tràn của các gene đề kháng. TEM-10, TEM-12, TEM-16 thường gặp nhất ở

Bắc Mỹ và Nam Mỹ.

* SHV-TYPE ESBLs (lớp A): SHV-1 chia 68% các amino acid của nó với

TEM-1 và có cấu trúc tương tự. Cũng như TEM, SHV-type ESBLs có một hoặc

nhiều sự thay thế các amino acid xung quanh vị trí hoạt hóa. Hơn 50 dạng khác

nhau của SHV đã được biết. SHV-type ESBLs gặp nhiều trong các giám sát về phân

lập tính đề kháng lâm sàng ở Châu Âu và Mỹ. SHV-5 và SHV-12 là 2 thành viên

thường gặp nhất của họ này.

* CTX-TYPE ESBLs (lớp A): được nhấn mạnh về hoạt tính của nó chống

lại cefotaxime lớn hơn ceftazidime. Hiện nay, có hơn 40 CTX-M đã được biết. Một

vài CTX-M thủy phân ceftazidime nhanh hơn cả thủy phân cefotaxime. CTX-M-14,

CTX-M-3, CTX-M-2 là thường gặp nhất.

* NHỮNG ESBLs LỚP A KHÁC: Những ESBLs lớp A khác không thường

gặp và được tìm thấy chủ yếu ở Pseudomonas aeruginosa và ở một số ít nơi: PER-1

được phân lập ở Thổ Nhĩ Kỳ, Pháp, và Ý; VEB-1 và VEB-2 tìm thấy ở Đông Nam

Á; GES-1, GES-2 và IBC-2 được phân lập ở Nam Phi, Pháp và Hy Lạp. PER-1

cũng thường gặp ở dòng acinetobacter ở Hàn Quốc và Thổ Nhĩ Kỳ. Một số các men

này cũng được tìm thấy ở Enterobacteriaceae, ngược lại các ESBLs ít gặp (như

BES-1, IBC-1, SFO-1 và TLA-1) chỉ được tìm thấy ở Enterobacteriaceae.

* OXA-TYPE ESBLs (lớp D): 12 ESBLs bắt nguồn từ OXA-10, OXA-1,

hay OXA-2 bằng cách thay thế các amino acid. Các men này được tìm thấy chủ yếu

ở P.aeruginosa ở Thổ Nhĩ Kỳ và Pháp. Hầu hết các OXA-type ESBLs có đề kháng

tương đối với tính ức chế của clavulanic acid. Một số men cho thấy chủ yếu đề

kháng với ceftazidime, nhưng OXA-17 cho thấy đề kháng nhiều hơn với cefotaxime

và cefepime hơn là đề kháng với ceftazidime.

* MEN PLASMID-MEDIATED AmpC (lớp C): AmpC beta-lactamases,

sinh ra do beta-lactam, được mã hóa ở các gene trên nhiễm sắc thể ở nhiều trực

khuẩn gram âm. Các đột biến làm gia tăng tình trạng đề kháng cephalosporin phổ

rộng ở Enterobacter cloacae. Men AmpC ở E.coli được biểu hiện nghèo nàn và

gene AmpC mất đi ở nhiễm sắc thể của Klebsiella và Salmonella, nhưng men

plasmid-mediated AmpC có thể làm cho các vi khuẩn này có tính đề kháng giống

nhau như các enterobacter kháng beta-lactam. Hơn 20 AmpC beta-lactamase được

tìm thấy truyền qua trung gian plasmid. AmpC beta-lactamase có đặc trưng làm cho

đề kháng với cephamycin cũng như với oxyimino-beta-lactam và đề kháng với chất

ức chế (clavulanic acid).

* CARBAPENEMASES (LỚP A, B VÀ D): carbapenemases là một nhóm

khác, hiện nay ít gặp tuy nhiên rất được quan tâm, vì chúng có hoạt tính không những

chỉ chống lại oxyimino-cephalosporin và cephamycin mà còn với carbapenem.

Plasmid-mediated IMP-type carbapenemases (hiện nay đã biết được 17 loại), được

tìm thấy ở Nhật (1990s), ở cả gram âm đường ruột, pseudomonas và acinetobacter

sp. Men IMP lan truyền chậm đến các quốc gia khác ở vùng Đông Nam Á; được báo

cáo ở Châu Âu năm 1997, và đã được tìm thấy ở Canada và Brazil. Họ thứ 2 của

carbapenemases đang phát triển là họ VIM, được báo cáo ở Ý năm 1999 và đến nay

gồm 10 thành viên, phân bố rộng rãi ở Châu Âu, Nam Mỹ, và Đông Nam Á và hiện

nay đã tìm thấy ở Mỹ. Một vài men lớp A, đặc biệt là men plasmid-mediated KPC,

cũng có tác dụng như carbapenemases. Sau cùng, vài OXA-type beta-lactamases có

hoạt tính carbapenemases, bằng cơ chế đề kháng thêm vào như thay đổi tính thấm

hay bơm đẩy kháng sinh ra ngoài.

 Đề kháng thu được không do sinh ra enzym -lactamase[45], [56]

[62] [58],[120].

- Do làm thay đổi tính thấm qua màng tế bào: trường hợp này ít gặp, một chủng

đường ruột có thể trở nên kháng với kháng sinh nhóm -lactam do đột biến trên NST

làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, đề kháng kiểu này đã được Gutmann (1984),

Jarlier (1986) và Ingahm (1990) mô tả.

- Do làm thay đổi đích bám của kháng sinh: rất hiếm gặp ở các chủng đường

ruột, cũng do đột biến trên NST đã làm thay đổi đích bám của kháng sinh penicillin

(PBP) hoặc làm thay đổi đích bám của các -lactam khác. Năm 1979, Aono đã tìm thấy

ở chủng E. coli đề kháng mecilliam theo cơ chế này [29].

- Có thể có những vi khuẩn mang một kiểu đề kháng phức tạp do có sự phối

hợp nhiều cơ chế đề kháng trên cùng một chủng:

. Sinh ra enzym -lactamase phổ mở rộng + đột biến làm thay đổi tính thấm

của màng tế bào.

. Tăng cường sản xuất enzym cephalosporinase do đột biến gen điều hòa +

sinh ra enzym penicillinase do nhận được gen đề kháng nằm trên plasmid.

. Tăng cường sản xuất enzym cephalosporinase do sự khuếch đại gen hoặc

do có sự thiết lập những gen điều hòa mới + đột biến làm thay đổi tính thấm của

Kênh porin bị đột biến ngăn cản thuốc vào VK

Hệ thống bơm đẩy kháng sinh ra ngoài

Efflux System Exit Portal

(OprM)

Outer

Membrane

Porin

màng tế bào.

Men Betalactamase

Linker Lipoprotein

(Mex A)

Cytoplasmic

Membrane

Hệ thống bơm đẩy kháng sinh

Periplasm

Hình 1.5. Đề kháng thu được không do sinh ra enzym -lactamase

1.4.2.6. Đề kháng với kháng sinh Quinolon

Sự đề kháng với nhóm kháng sinh này cho đến nay vẫn được hiểu là do đột

biến trên NST. Sự đột biến này làm thay đổi đặc tính của enzym tác động vào quá

trình sinh tổng hợp ADN (enzym ADN - gyrase) làm cho kháng sinh không tác

động vào được nữa. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự [78] lần đầu tiên

mô tả chủng K. pneumoniae mang gen kháng quinolon nằm trên plasmid, đồng thời

các gen này còn gắn trên các Integron khác nhau. Hơn nữa, các plasmid này cũng

đồng thời mang gen mã hóa enzym -lactamase phổ rộng hoặc enzyme

cephalosporinase. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn, bởi nó nói lên rằng gen

kháng quinolon có thể được lan truyền ngang giữa các vi khuẩn.

1.4.2.7. Ý nghĩa sinh học

Những hiểu biết về cơ chế sinh hóa và di truyền học của sự đề kháng kháng

sinh ở vi khuẩn đã giúp ích được rất nhiều cho các thầy thuốc lâm sàng trong công

tác điều trị.

 Đề kháng tự nhiên

Những hiểu biết về sự đề kháng tự nhiên sẽ giúp các thầy thuốc lâm sàng

tránh được những chỉ định không hợp lý như: không nên sử dụng erythromycin để

điều trị nhiễm trùng do E. coli, hoặc không nên sử dụng colistin và nalidixic acid để

điều trị nhiễm trùng do tụ cầu hoặc nhiễm trùng do trực khuẩn mủ xanh không nên

dùng penicillin G để điều trị, cần thận trọng khi lựa chọn kháng sinh nhóm -lactam

để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn họ đường ruột gây nên.

 Đề kháng thu được

- Sự đề kháng do đột biến trên NST đã làm xuất hiện những chủng vi khuẩn

kháng kháng sinh trong chính quần thể vi khuẩn nhạy cảm, sự có mặt của kháng

sinh trở thành một chất xúc tác để chọn lọc những dòng vi khuẩn đề kháng. Việc

điều trị một kháng sinh đơn độc có thể đưa đến sự lựa chọn những chủng kháng đa

kháng sinh, hơn thế nếu điều trị một kháng sinh không còn tác dụng đối với một

chủng đa kháng (điều trị "mù") sẽ là điều kiện để chủng "ngoan cố" này gây thành

dịch. Để phòng ngừa hoặc làm giảm nguy cơ xuất hiện những chủng đột biến kháng

kháng sinh, bằng cách lựa chọn hai kháng sinh thuộc hai nhóm khác nhau (dựa theo

nguyên tắc lựa chọn kháng sinh phối hợp) để điều trị phối hợp. Vì theo lý thuyết,

một trong những đặc điểm của sự đột biến là nó mang tính độc lập, vì vậy khả năng

để một tế bào vi khuẩn xuất hiện đột biến kháng cả hai kháng sinh đồng thời là rất hiếm, tần xuất này chỉ có thể là 10-14 hoặc 10-15. Chính vì thế mà đã từ lâu người ta

áp dụng điều trị phối hợp hai hoặc ba kháng sinh trong điều trị lao.

- Sự đề kháng do nhận được gen đề kháng thông qua các hình thức: tiếp hợp

khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau, biến nạp khi vi khuẩn bị ly giải và giải

phóng ra ADN tự do hoặc tải nạp nhờ phage hoặc do một thành phần di truyền di

động (transposons):

. Transposons có thể là nguyên nhân hàng đầu trong việc lan truyền một số

gen đề kháng nhất định vào nhiều loại vi khuẩn khác nhau [47]. Nhưng riêng khả

năng chuyển vị trí chưa đủ để lan truyền được gen đề kháng mà nó còn phải gắn vào

một đơn vị sao chép nào đó (plasmid, phagiơ hay NST). Khi nằm trên một vector

không tự sao chép của tế bào chủ thì transposons có thể chuyển vị trí mà nhảy vào

một plasmid đang tồn tại trong tế bào hay nhảy vào NST.

. Hình thức tiếp hợp giữ vai trò quan trọng vì R-plasmid (là những plasmid

mang đặc tính đề kháng) được tìm thấy ở rất nhiều tác nhân gây bệnh, khoảng 60-

90% vi khuẩn Gram âm đề kháng là do R-plasmid. Khả năng của một số plasmid kể

cả tự truyền và không tự truyền có thể tồn tại ở nhiều loài vi khuẩn [55] [33], cũng

đóng vai trò quan trọng trong sự bảo tồn và lan truyền gen đề kháng, ví dụ: những

plasmid giống nhau ở nhiều loài thuộc họ Enterobacteriaceae [41]. Sự đề kháng của

vi khuẩn do gen mã hóa nằm trên plasmid gặp ở hầu hết các nhóm kháng sinh khác

nhau. Mà các plasmid luôn duy trì ổn định trong tế bào chủ thông qua sự truyền dọc

cùng với sự phát triển của vi khuẩn và hơn thế nó có thể truyền ngang do lan truyền

từ chủng này sang chủng khác. Vì vậy, tính kháng thuốc có thể được truyền dọc qua

các thế hệ và truyền ngang giữa các chủng, các loài, gây khó khăn cho việc điều trị.

Do nhận được R-plasmid, có những chủng vi khuẩn trở thành kháng lại một hay

nhiều thuốc kháng sinh khác nhau, mặc dù trước đó chúng chưa hề tiếp xúc lần nào

với những kháng sinh đó. Hiện nay chỉ có một số loại kháng sinh mà vi khuẩn đề

kháng theo cơ chế đột biến là: rifamycin, polymycin, nitrofuran, quinolon và

vancomycin.

Chính vì thế mà trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh một cách

bừa bãi và lạm dụng những kháng sinh thế hệ mới của các thầy thuốc lâm sàng

trong các bệnh viện cũng như các thầy thuốc điều trị tư đã làm xuất hiện ngày càng

nhiều chủng vi khuẩn đột biến kháng kháng sinh và ngày càng lựa chọn nhiều

chủng kháng đa kháng sinh. Đặc biệt trong môi trường khép kín của bệnh viện, việc

"giao lưu" của những vi khuẩn đề kháng từ người này sang người khác được thúc

đẩy qua các dụng cụ thăm khám, qua các loại chất tiết khác nhau của bệnh nhân,

nên môi trường bệnh viện là ổ dự trữ lớn vi khuẩn đề kháng.

Như vậy, sử dụng kháng sinh để điều trị phải hết sức thận trọng để hạn chế

việc xuất hiện và lan truyền vi khuẩn đa kháng kháng sinh.

1.5. Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh và các phương pháp xác định gen kháng thuốc của vi khuẩn

1.5.1. Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh

1.5.1.1. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch

Là kỹ thuật xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh với các loại kháng sinh khác nhau.

 Kỹ thuật [2],[84].

 Vi khuẩn đã được định danh, thuần khiết, nuôi cấy 18-24h trên môi trường không có chất ức chế, Đồng nhất vi khuẩn trong canh thang MH hoặc nước muối sinh lý 0,9% so với độ đục chuẩn McFarland 0,5, để có huyền dịch vi khuẩn ban đầu tương ứng với 108 vi khuẩn/1ml. Sau đó tiếp tục pha loãng huyền dịch này 1/100 (hoặc 1/10 tùy theo mỗi loại vi khuẩn) trong canh thang MH hoặc nước muối sinh lý để có huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/1ml (hoặc 107, hoặc 108 vi khuẩn/1ml, tùy theo mỗi loại vi khuẩn).

 Ria hoặc láng huyền dịch vi khuẩn đã đồng nhất ở trên dàn đều vi khuẩn lên bề mặt thạch, sau đó để hộp thạch khô tự nhiên hoặc phơi trong tủ ấm 370C/15-30 phút.

 Đặt khoanh giấy kháng sinh, sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy cách nhau 2cm và cách mép hộp lồng 2cm. Sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, cần để hộp lồng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi cất trong tủ ấm 370C .

 Đọc kết quả :

- Đọc kết quả sau khi đã để tủ ấm 370C/18-24h.

- Dựa vào bảng chuẩn để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của từng

loại vi khuẩn khác nhau.

- Có ba mức độ nhạy cảm được qui định : nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R).

 Có các tiêu chuẩn riêng về môi trường, độ đục huyền dịch vi

khuẩn và khí trường ủ của từng loại chủng vi khuẩn

1.5.1.2. Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration - MIC)

 Kỹ thuật [2],[84]

 Pha kháng sinh

 Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”)

- Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm:

Dựa trên hoạt lực của kháng sinh (được ghi trên các nhãn lọ), cần tính để pha dung dịch “mẹ” theo công thức.

. Dung dịch kháng sinh “mẹ” sau khi pha xong, chia nhỏ ra các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh âm 200C (trừ kháng sinh Acid nalidixic bảo quản ở nhiệt độ phòng). Khi đã lấy ra sử dụng, chỉ dùng trong 24h.

- Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho tiêm truyền tĩnh mạch:

Pha toàn bộ lọ kháng sinh đó với một lượng nước hồi chỉnh hoặc nước cất theo chỉ dẫn (có trên nhãn của lọ kháng sinh), từ đó tính được nồng độ của dung dịch mẹ.

 Pha các nồng độ kháng sinh từ nồng độ của dung dịch mẹ.

* Nồng độ cuối cùng pha loãng 1/10 trong môi trường, được tính theo tỷ lệ trộn 2,5 ml dung dịch trung gian + 22,5 ml thạch MH (MIC bằng phương pháp pha loãng trong thạch), hoặc 0,2 ml dung dịch trung gian + 1,8 ml canh thang MH (MIC bằng phương pháp pha loãng trong canh thang).

 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn

trong môi trường đặc

Ngày 1: Chuẩn bị chủng và môi trường

- Các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế được cấy trong canh thang thường hoặc canh thang MH để có được canh khuẩn non (một số vi khuẩn có thể cấy vi khuẩn trên môi trường thạch)

- Chuẩn bị thạch MH: Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho tan hết thạch, hấp thạch ở 1210C/15’ (Đối với một số chủng cần môi trường có chất dinh dưỡng cao, cần bổ sung thêm các chất dinh dưỡng cần thiết). - Khi thạch đã nguội còn khoảng 40-500C, dùng ống đong khắc vạch đong 22,5 ml thạch cho vào bình nón đã có sẵn 2,5 ml dung dịch kháng sinh theo các nồng độ như trong bảng pha kháng sinh. Mỗi lần làm MIC cần 2 đĩa môi trường MH không có kháng sinh để làm đĩa chứng (cho thêm 2,5 ml PBS hoặc nước cất + 22,5 ml môi trường thạch MH).

Ngày 2: Cấy vi khuẩn trên bề mặt đĩa thạch MH có nồng độ kháng sinh khác

nhau

Dùng pipet Pasteur hút khoảng 0,5 ml huyền dịch (106 vi khuẩn/ml) cho vào mỗi giếng của bàn đinh, theo sơ đồ đã ghi số của các chủng:

2 1 3 4

7 5 6 8 9 10

13 11 12 14 15 16

19 17 18 20 21 22

25 23 24 26 27 28

30 29

Chủng chuẩn* Chủng chuẩn*

* Tùy theo loài vi khuẩn cần xác định MIC để chọn chủng chuẩn sao cho thích hợp

Dùng bộ phiên bản 32 chân đinh chấm vào giếng sau đó đặt lên đĩa thạch MH có các nồng độ kháng sinh khác nhau (nếu không có bộ cấy phiên bản, có thể dùng micropipet nhỏ 2 l/chủng lên mặt đĩa thạch theo sơ đồ).

Sau khi đặt lên các đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (các giọt nước tại các chân đường cấy thấm vào thạch (khoảng 15-20 phút) cất vào tủ ấm 370C/18h, lật úp đĩa thạch. Đối với một số chủng cần thiết phải đặt các đĩa thạch trong điều kiện có C02

Ngày 3: Đọc kết quả

- Trước tiên đọc kết quả ở các đĩa thạch chứng và chủng chứng

- Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc.

- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu .

- Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là: nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó (). Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó ().

- Kết quả MIC của các chủng sẽ được xác định theo ba mức độ nhạy cảm, dựa theo bảng chuẩn: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R).

 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong

môi trường lỏng

Ngày 1: Chuẩn bị chủng( giống như kỹ thuật trong môi trường đặc)

Ngày 2: Cấy vi khuẩn trong môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau

Pha loãng 0,1ml (100l) canh khuẩn non (sau khi để 370C/18h sẽ có huyền dịch vi khuẩn tương đương 108 vi khuẩn/ml) trong 9,9ml canh thang MH (pha loãng 100 lần để có huyền dịch vi khuẩn tương đương 106vi khuẩn/ml), chia 1,8ml vào các ống nghiệm đường kính 12mm. (Nếu nuôi cấy qua đêm bằng môi trường thạch, lấy vi khuẩn thuần khiết từ môi trường thạch thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS hoặc nước muối sinh lý 0,9% để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 108 vi khuẩn/ml, sau đó lại pha loãng 1/100 trong canh thang MH và chia vào các ống nghiệm như trên).

- Thêm 0,2 ml nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng vào 1 ống nghiệm (chứng âm).

- Thêm 0,2 ml kháng sinh đã pha theo bảng pha các đậm độ kháng sinh ở trên (phần 3.2.1.2.) vào mỗi ống nghiệm, phân phối từ nồng độ kháng sinh thấp nhất đến nồng độ cao nhất. Lắc kỹ từng ống nghiệm.

- Đặt vào tủ ấm 370C/18h.

Ngày 3: Đọc kết quả

- Lắc kỹ từng ống nghiệm trước khi đọc kết quả.

- Đọc kết quả ở ống chứng âm trước để kiểm tra xem chủng vi khuẩn có phát triển tốt hay không, nếu vi khuẩn phát triển tốt mới tiếp tục đọc kết quả, nếu không mọc tốt phải làm lại thí nghiệm.

- Đọc kết quả ở các chủng chứng (chủng chuẩn quốc tế), so sánh kết quả MIC của

các chủng này với bảng chuẩn.

- Xác định nồng độ MIC: Đọc kết quả bắt đầu từ ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất. Nồng độ MIC được tính ở ống nghiệm có nồng độ kháng sinh thấp nhất có thể ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (bằng mắt thường nhìn thấy nồng độ vi khuẩn mọc thay đổi rõ từ đục nhiều chuyển sang đục ít)

- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu

- Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả

được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó ().

- Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới để phân biệt 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I), kháng (Resistante – viết tắt R).

 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn bằng

băng giấy Etest [24], [44]

Etest là một kỹ thuật phối hợp của hai kỹ thuật xác định tính nhạy cảm kháng sinh: kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch và kỹ thuật pha loãng kháng sinh trong thạch. Etest là kỹ thuật khuếch tán kháng sinh từ băng giấy trên thạch cho phép xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). Etest cho kết quả nhanh, rất dễ thực hiện. Đặc biệt thuận lợi cho việc xác định nồng độ MIC của những vi khuẩn khó bảo quản và đòi hỏi nhiều yếu tố trong môi trường phát triển như: H. influenzae, S. pneumoniae, Campylobacter…

 Các bước tiến hành

- Chuẩn bị một đĩa thạch MH (đường kính 90mm) đã được láng huyền dịch vi khuẩn giống như các điều kiện trong kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán.

- Đặt băng Etest lên đĩa thạch (sau khi lấy băng Etest từ tủ lạnh, nên để ở nhiệt độ phòng 20 phút), phần nồng độ kháng sinh cao nhất gần sát mép hộp lồng, tối đa 6 băng /hộp lồng 90mm.

- Đặt đĩa thạch trong tủ ấm 370C/18-24h, các điều kiện về CO2 tùy theo loại

vi khuẩn.

- Đọc kết quả nồng độ MIC: dựa vào vòng ức chế vi khuẩn cắt vào băng giấy ở vị trí nào, đó sẽ là điểm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn phát triển.

Hình 1.6. Cách xác định kết quả MIC bằng Etest [108]

Vùng vi khuẩn phát triển

Vòng ức chế hình elip

Kết quả MIC

1.5.2. Các kỹ thuật xác định cơ chế kháng kháng sinh

1.5.2.1. Kỹ thuật tiếp hợp trên mặt thạch

Kỹ thuật này được thực hiện theo tác giả Kratz (1983).

• Mục đích: xác định khả năng lan truyền các R-plasmid có chứa các gen mã

hóa sự kháng kháng sinh qua tiếp xúc trực tiếp.

• Nguyên lý: chủng vi khuẩn hoang dại ban đầu (chủng cho) có chứa các R-

plasmid mang các gen mã hoá sự kháng kháng sinh, cho tiếp xúc với chủng chuẩn (chủng nhận) không chứa plasmid và nhạy cảm với các kháng sinh mà chủng cho đề kháng nhưng chứa gen kháng loại kháng sinh khác nằm trên nhiễm sắc thể mà vi khuẩn cho không có. Nếu có sự lan truyền R-plasmid qua

tiếp hợp sẽ tạo ra các vi khuẩn thể tiếp hợp có đặc tính: chứa R-plasmid có gen mã hóa sự kháng kháng sinh. Những vi khuẩn này sẽ mọc được trên môi trường chọn lọc có hai kháng sinh: một kháng sinh vi khuẩn cho đề kháng và

một kháng sinh vi khuẩn nhận đề kháng. • Phương pháp: . Chủng cho: vi khuẩn hoang dại kháng với các kháng sinh

. Chủng nhận: Là chủng chuẩn đã biết trước không có gen kháng trên Plasmid . Nuôi cấy chủng cho và chủng nhận trong canh thang BHI ở 370C/18h. . Cấy kiểm tra chủng cho và chủng nhận trên môi trường thạch thích hợp có một kháng sinh để kiểm tra kiểu cách kháng kháng sinh

. Trộn 2 ml vi khuẩn cho và 2 ml vi khuẩn nhận (tỷ lệ 1:1).

. Ly tâm 2000 vòng/phút x 15 phút, lấy cặn (0,1 ml) nhỏ lên đĩa thạch nuôi

cấy thích hợp, sao cho không còn dung dịch lỏng trên mặt thạch. . Ủ 370C/5 h. . Hoà lại vi khuẩn trên mặt thạch vào 4 ml dung dịch đệm PBS. Lấy 0,2 ml huyền dịch này cấy lên các đĩa môi trường chọn lọc có hai kháng sinh(một vi

khuẩn cho kháng và một vi khuẩn nhận kháng). . Đọc kết quả: các vi khuẩn thể tiếp hợp mọc trên môi trường chọn lọc có hai kháng sinh sẽ cho khuẩn lạc có mầu đặc chưng của vi khuẩn nhận.

. Kiểm tra kiểu cách đề kháng của vi khuẩn thể tiếp hợp bằng kỹ thuật sao chép. . Kiểm tra tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn thể tiếp hợp trên môi trường sinh vật hóa học (nó phải mang đầy đủ đặc tính sinh vật hóa học của chủng

nhận là E.coli):

Glucose: 

Lactose: + H2S : + Hơi : +

Ure :  Indol: +

Manit: + Di động: +

Simmon citrat:  LDC: 

1.5.2.2. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) [40].

Kỹ thuật PCR được Karl Mullis người Mỹ thực hiện vào năm 1985

 Phương pháp tiến hành: Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp

nhau, mối chu kỳ gồm 3 bước:

- Bước 1: Là giai đoạn biến tính (denaturation). - Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing-Ta). - Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Sau mỗi chu kỳ các chuỗi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng làm khuôn cho sự tổng

hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của sản phẩm PCR là những

đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận 5' của 2 đoạn gen mồi.

Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5-3%, chạy cùng với marker

để so sánh đối chiếu độ lớn của đoạn DNA cần quan tâm.

*PCR đa thành phần (multiplex PCR): là phương pháp PCR sử dụng đồng thời

nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau để nhân các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên

một phân tử DNA hoặc trên các phân tử DNA khác nhau [40], [105].

1.5.2.3. Phương pháp Real-Time PCR [40], [105]

Ngoài 2 phương pháp như giải trình tự gen và PCR, hiện nay nhiều tác giả đã

sử dụng phương pháp Real-Time PCR để phát hiện các đột biến gen. Trong kỹ thuật

PCR sau khi hoàn tất khuếch đại đoạn DNA đích, phải điện di sản phẩm PCR trên

gel agarose để kiểm tra xem có vạch sản phẩm khuếch đại đúng kích thước hay

không? Còn Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển

thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Do đặc điểm này nên người làm

thí nghiệm không cần phải làm tiếp các bước thí nghiệm khác để xác định có sản

phẩm khuếch đại đích hay không. Như vậy có thể nói Real-time PCR là kỹ thuật

nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và

kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch

đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được. Tuy vậy, kỹ thuật này đòi hỏi

phải có một hệ thống thiết bị máy móc hiện đại, độ tin cậy cao thì kết quả mới chính

xác.

Scort và cs (2006), Mitrofanov và cs (2008), sử dụng phương pháp Real-Time

PCR để phát hiện các đột biến 185delAG; 5382insC trên gen BRCA1 và 6174delT

gen BRCA2 ở người Ashkenazi . Kết quả thể hiện ở hình 1.8

Hình 1.7. Phát hiện các đột biến 158delAG, 5382insC và 6174delT

bằng Real-Time PCR (Scort và cs, 2006).

1, Số chu kỳ của phản ứng PCR; 2, Chu kỳ nhiệt các đột biến và dạng bình thường

1.5.2.4. Kỹ thuật phương pháp lai phân tử [40 ], [105]:

ADN đã khuếch đại bằng PCR được mở vòng xoắn, phân tách thành sợi đơn và cắt

bằng enzym giới hạn nuclease (enzym cắt đặc hiệu cho ADN);i) điện di xung trường

(PFGE) để tách các đoạn ADN đã bị cắt; ii) Các đoạn ADN được chuyển sang màng lai

nitrocellulose; iii) Các đoạn ADN trên màng được lai với mẫu dò đặc hiệu dựa theo

nguyên lý bổ xung ADN; iv) Cố định và phát hiện sự có mặt của phân tử lai ADN- mẫu

dò được đánh dấu bằng biotin với mối liên kết chắc chắn với avadin. Avadin hỗn hợp với

phosphatase kiềm dưới tác dụng của chất nền sinh mầu tạo ra mầu tím của sản phẩm.

Hình 1.8. Kỹ thuật Southern Blot

1.5.2.5. Kỹ thuật giải trình tự gen

Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh

như: Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert)

và giải trình tự gen bằng enzyme hay phương pháp Dideoxy (Frederick Sanger

1977).

Nguyên lý chung của hai phương pháp là đều tạo ra các đoạn oligonucleotide

có chiều dài khác nhau và có xác suất xuất hiện như nhau trong phản ứng. Sau đó

các trình tự này được phân tích bằng điện di trên gel polyacrilamid và kết quả được

đọc trên bản phóng xạ tự ghi hoặc nhờ máy dò tự động.

Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng

dideoxynucleotid (dNTP). Với các máy thế hệ sau này người ta dùng 4 màu huỳnh

quang khác nhau để đánh dấu 4 loại dNTP. Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực

hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên 1 hàng chứ không phải trên 4 hàng

như trước đây. Đối với phương pháp này, mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử

dNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng,

máy sẽ ghi nhận màu sắc và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang,

máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích [17].

Phương pháp này giúp phát hiện chính xác các đột biến xuất hiện ở gen BRCA1 và

BRCA2.

Hình 1.9. Hình ảnh minh hoạ giải trình tự một đoạn DNA

(Nguồn: Sanger cequencing read display.gif)

1.6. Nhiễm khuẩn hô hấp và tình hình kháng kháng sinh do Klebsiella

1.6.1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở nước ngoài

Nhiễm khuẩn hô hấp do Klebsiella spp. ở trong cộng đồng là hiếm gặp,

thường gặp ở những người có miễn dịch kém như trẻ nhỏ, người già, người mắc

bệnh mãn tính ....[29].

Nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. gặp chủ yếu ở trẻ sơ sinh và sơ sinh non

yếu. Tỷ lệ chủng kháng và đa kháng kháng sinh cao, nhất là chủng sinh men β-

lactamase phổ rộng và KPC. Đặc biệt là những chủng Klebsiella spp. mang gen

NDM-1 gây đề kháng các loại kháng sinh hiện có và làm cho Klebsiella spp. trở

thành siêu vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh [112], [113], [114].

Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. khác nhau ở các nước. Tại Châu Âu, tỷ

lệ Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn ở các bệnh viện từ 3% -17%; ở Thổ Nhĩ Kỳ

26,2% [85], [ 98], [119]. Các chủng Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn bệnh viện đề

kháng cao với các kháng sinh ngoại trừ imipenem (IPM) và ciprofloxacin (CIP)

[83], tỉ lệ kháng với các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin và quinolon ở cộng

đồng là 4% và 21%, tỉ lệ này cao gấp hai lần đối với những chủng phân lập được từ

nhiễm trùng bệnh viện. Các chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện đã

kháng 60%-100% đối với ampicillin (AM) và cephazolin, xuất hiện chủng kháng

với nhiều loại kháng sinh, với IPM và CIP kháng 0%-12% [119]. Các chủng sinh

men β-lactamase phổ rộng (ESBLs) là yếu tố lan tràn và bùng phát nhiễm khuẩn

bệnh viện đồng thời tăng tỉ lệ chủng kháng đa kháng kháng sinh. Tỉ lệ chủng có

men ESBLs phân lập ở bệnh nhân viêm phổi nhiễm trùng bệnh viện là 88,9% còn

phân lập từ những bệnh nhân viêm phổi không phải do nhiễm trùng bệnh viện là

11,1% [30].

Những báo cáo mới nhất về cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolon của các

nhà nghiên cứu cho thấy vai trò chủ yếu là do đột biến trên nhiễm sắc thể của vi

khuẩn. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự [75], lần đầu tiên mô tả chủng

Klebsiella pneumoniae kháng nhóm kháng sinh quinolon theo cơ chế lan truyền gen

P.M.G 252 trên plasmid. Sự kháng kháng sinh nhóm quinolon được xác định bởi

gen qnr nằm trên các Integron khác nhau. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn

bởi nó nói lên rằng gen kháng quinolon có thể lan truyền ngang giữa các vi khuẩn

với nhau. Thêm vào đó các integron này đồng thời mang gen kháng kháng sinh

cephalosporin thế hệ thứ ba (do enzym -lactmase phổ rộng hoặc do enzyme

cephalosporinase).

Các kháng sinh nhóm quinolon tác động chính lên protein của tế bào vi

khuẩn là onr (thuộc nhóm nhân 5 cạnh, protein McbG và MfpA các protein này

tham gia tạo dây xoắn AND của vi khuẩn và được gọi là DNA gyrase). Gen mã hóa

cho enzym này chính là qnr. Sự đột biến ở gen này sẽ làm cho vi khuẩn kháng lại

được các kháng sinh nhóm quinolon [52], [61].

Các gen kháng quinolon nằm trên plasdmid- qnrA được phát hiện lần đầu

tiên năm 1998 ở Mỹ, sau đó qnrB, qnrS lần lượt được phát hiện và thấy chúng được

phân bố rộng khắp trên toàn cầu. Trên hình ảnh phân bố gen qnr trên thế giới (hình

1.12) Việt Nam nằm trong khu vực có lưu hành gen qnr chủ yếu là qnrA và qnrS.

Tỷ lệ mang gen kháng qnr khác nhau giữa các nước và các khu vực: từ 4%

đến 55% tập trung cao ở các nước Đông Nam Á, đặc biệt là Hàn Quốc và Trung

Quốc từ 20,3 đến 55%.

Hình 1.10. Sự phân bố gen qnr[Jacob-2009]

Sự kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (C3G) liên quan đến sự kháng

quinolon theo cơ chế plasmid luôn được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm.

Chủng gây bệnh đề kháng với C3G hầu hết tìm thấy ở các bệnh viện [109],[35], [96],

[6], [38]. Cũng giống như quinolon, chủng kháng C3G thay đổi tùy theo vùng địa lý.

Những thay đổi quan trọng được báo cáo ở châu Á - Thái Bình Dương [109], [6]. Ở

Châu Phi số liệu không nhiều, tỷ lệ kháng khoảng 40% [35], [61]. Đa số chủng mang

gen qnr đều kèm theo mang enzym ESBL (SHV-5, SHV-7, CTX-M, Veb-1, Oxa-30)

hoặc một -lactamase plasmid type AmpC (Fox-5) [46], [51], [39], [60],[61],

[102],[107]. Đặc biệt các chủng mang gen kháng CTX-M một gen mã hóa enzym phân

hủy Cefotaxime kháng sinh đang được sử dụng nhiều trong điều trị và có những loại

CTX-M phân hủy ceptazidime nhanh và mạnh hơn Cefotaxime đã xuất hiện khắp các

nước.

Hình 1.11. Hình ảnh phân bố gen CTX-M[109]

1.6.2. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở trong nước:

Nhiễm trùng đường hô hấp là một bệnh chiếm tỷ lệ cao trong các nhóm

bệnh ở trẻ em 53,3% (nghiên cứu cơ cấu bệnh tật trong 3 năm 2005-2008 của bệnh

viện Thanh Nhàn). Nhiễm khuẩn hô hấp cấp ở trẻ em ở các bệnh viện có tỷ lệ cao :

Sain-Paul 36,8%, khoa Nhi - Bệnh viện Bạch Mai 41,35%, Bệnh viện Đaklak

35,5% [22].

Klebsiella là vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn đường hô hấp ở trẻ em

nằm viện, nhất là trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ.

Tỷ lệ nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn tiết niệu trẻ

em ở bệnh viện 27,62% - 42,12% [1], [ 4]. Các chủng Klebsiella spp. thu được ở

bệnh viện nhi kháng lại kháng sinh ngày một tăng cao [5],[11]. Các kháng sinh

thông thường như Ampicilline và Cephalothine kháng 97,8% và 91,7%, nhóm

quinolon (31,9%) và C3G khá cao ở nhiễm khuẩn bệnh viện ở trẻ em (42,4 - 57,2%)

[1]. Những nhiễm khuẩn chung ở người lớn tỷ lệ kháng C3G từ 36,8 - 37,2% và

quinolon 31,8% [16].

Tỷ lệ chủng sinh β-lactamases ở Klebsiella khác nhau tuỳ từng bệnh viện.

Bệnh viện Chợ Rẫy 61%; Bệnh viện Việt Đức là 39,3%; Bệnh viện Nhi Trung ương

22,68% [19]. Tỷ lệ kháng C3G cao (36,8% - 57,2%) và quinolon (31,8% - 31,9%)

[1], [4], [19]. Cho đến nay, ở Việt Nam có nghiên cứu của Cao Thị Bảo Vân và

cộng sự với công bố kết quả nghiên cứu sự phân bố gen kháng β- lactam của các

chủng thuộc họ Enterobacterriacea phân lập ở Việt nam cho thấy tỷ lệ CTX-

M(25,5%); SHV (38,1%) ; TEM (76,3%) [21].

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu:

Tất cả các chủng Klebsiella phân lập được từ bệnh phẩm đường hô hấp của

các bệnh nhi từ 0 đến 6 tuổi nằm điều trị tại khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại,

Sơ sinh và khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 7/2009 đến tháng

7/2010. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này được thu thập từ hai nhóm :

+ Nhóm từ những bệnh nhi được chẩn đoán là nhiễm khuẩn đường hô hấp

cấp tính ngay khi nhập viện (như viêm phế quản phổi, viêm phổi, viêm tiểu phế

quản phổi....) - gọi là nhóm NKHHCT

+ Nhóm thu thập từ những bệnh nhi được chẩn đoán những bệnh khác

ngoài nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính khi nhập viện, mà NKHHCT là bệnh đi

kèm hoặc xuất hiện sau thời gian nằm điều trị - gọi là nhóm NKHHCT kết hợp

+ Nhóm bệnh nhi nặng xin về và nhóm tử vong gọi chung là nhóm tử vong.

- Tiêu chuẩn lựa chọn các chủng Klebsiella vào nghiên cứu gen kháng

C3G và Quinolon: Tất cả các chủng Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng

được xác định theo tiêu chuẩn của CLSI đảm bảo không cùng trên một phòng bệnh

trong cùng một ngày nuôi cấy.

2.2. Thiết kế nghiên cứu:

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang.

2.2.1. Cỡ mẫu: Lượng chủng K. pneumoniae có sinh men β-lactamase phổ rộng

theo công thức sau:

p(1-p) n = Z²(1-α/2) x d²

Trong đó: Z(1-α/2) = 1,96, với độ tin cậy 95%.

p = 2,4. p là tỷ lệ mang gen qnr ở các chủng Klebsiella có sinh men β-

lactamase phổ rộng trong nghiên cứu tại Trung Quốc năm 2008 [28].

d = 0,1: là sai số lựa chọn.

n : số mẫu phân lập được Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng. Theo

công thức tính cỡ mẫu n= 93. Trên thực tế, nghiên cứu đã phân tích trên 107 mẫu

Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng.

2.2.2. Chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện cho đến khi phân lập đủ cỡ mẫu Klebsiella có

sinh men β-lactamase phổ rộng cần nghiên cứu

2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu:

- Tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của đối tượng nghiên

cứu theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp

- Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được theo các

Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp.

- Tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon (CTX- M,

SHV,TEM, qnr) của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới,

theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp.

2.4. Vật liệu và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.1. Địa điểm thực hiện: Các kỹ thuật xét nghiệm được thực hiện tại:

- Khoa Vi sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương

- Phòng nghiên cứu kháng kháng sinh - Khoa vi sinh thuộc labo lâm sàng

bệnh viện Serveral của Đại học tổng hợp Yonsei - Hàn quốc.

2.4.2. Vật liệu nghiên cứu:

 Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng để thu thập bệnh phẩm, nuôi cấy

phân lập, định danh và xác định tính nhạy cảm kháng sinh, nồng độ kháng sinh tối

thiểu ức chế vi khuẩn

 Môi trường vận chuyển bệnh phẩm: Dung dịch NaCl 0,9% vô trùng đóng

sẵn 4,5ml.

 Tăm bông mềm.

 Máy hút dịch hoặc bơm tiêm 10ml.

- Ống nghiệm có nút bông vô khuẩn.

 Nồi cách thủy, tủ sấy khô, nồi hấp ướt.

 Môi trường chocolate, thạch máu, bộ nhuộm gram, thuốc thử oxydase;

card định danh cho máy.

 Cân chính xác đến gram, tủ lạnh 4-80C, tủ đông lạnh - 800C.  Tủ ấm 370C, tủ ấm CO2.

 Card định danh các loại và card định danh trực khuẩn Gram âm GN test

kit code 21341 (Hãng Bio-Merieux).

 Que cấy định lượng 10µl, đèn cồn; ống nghiệm chuyên dùng cho máy

định danh, lam kính;

Các loại khoanh giấy kháng sinh của hãng Biorad: Ampicilline (AM),

Cephalothine(CF), Cefuroxime(CXM), Amoxicilline/Acidclavulanic(AMC),

Cefotaxime (CTX), Ceftazidime (CAZ), cefoxitine (FOX), Cefepime(FEP), Co-

trimoxazone(SXT), Gentamicin(GM), Amikacin(AK), Tobramycin(TM),

Ciprofloxacin(CIP) và Immipenem (IPM).

 Các loại bột kháng sinh: Cefoxitin, Cefoperazon Astreonam Ceftazidime,

Ceftazidime/Acid clavulanic, Cefotaxime, Cefotaxime/Acid clavulanic,

Piperacilline, Piperacillie/Acid clavulanic, Imipenem, Cefepime( của hãng Bioneer)

 Máy voltex, máy đo độ đục chuẩn của vi khuẩn.

 Máy định danh Vitek 2

 Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng để xác định vi khuẩn sinh enzyme

β-lactamase phổ rộng (ESBL)

* Dụng cụ:

- Hộp lồng tròn đường kính 90mm.

- Dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh pince kẹp không có mấu.

- Thước đo vòng ức chế

* Hóa chất và sinh phẩm

+ Môi trường: Thạch Mueller - Hinton (MH).

+ Các chủng vi khuẩn chuẩn quốc tế

- Staphylococcus aureus ATCC 29213

- Escherichia coli ATCC 25922

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

- Các chủng Klebsiella pneumoniae chắc chắn có gen CTX,SHV,TEM

và qnR càn tìm của phòng xét nghiệm nghiên cứu kháng thuốc thuộc bệnh

viện Serveral - Hàn Quốc

 Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ dùng trong kỹ thuật PCR

*Sinh phẩm

- Cặp mồi chẩn đoán gen: TEM, SHV,CTX-M-3, CTX-M-9, qnrA, qnrB,

qnrS (Hãng Bioneer - Hàn Quốc):

Bảng 2.1. Thông tin các mồi dùng cho nghiên cứu

Kích thước Gen nằm trên Mồi Trình tự nucleotide (5'->3') phân tử plasmid PCR (bp)

F ATAAAATTCTTGAAGACGAAA 1078 TEM Nhóm R GACAGTTACCAATGCTTAATC

gen mã F TGGTTATGCGTTATATTCGC 866 SHV hóa sự R GGTTAGCGTTGCCAGTGCT

kháng F CCCATGGTTAAAAAATCACT 889 CTX-M-3 R CCGTTTCCGCTATTACAAAC nhóm

F ATGGTGACAAAGAGAGTGCA C3G 868 CTX-M-9 R CCCTTCGGCGATGATTCTC

F AGAGGATTTCTCACGCCAGG 577 qnr A R TGCCAGGCACAGATCTTGAC

F GGMATHGAAATTCGCCACTG 263 qnr B R TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA

ự s a ó h ã m n e g m ó h N

n o l o n i u Q m ó h n g n á h k

F GCAAGTTCATTGAACAGGGT 425 qurS R TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG

Ghi chú: F- Mồi xuôi; R: Mồi ngược

- PreMix

- Thang ADN chuẩn

* Hóa chất

- Thạch agarose dùng trong điện di gen( tự pha)

- Ethidium bromide dùng để nhuộm gen

- TAE (Tri Acetate EDTA)

* Dụng cụ máy móc phục vụ kỹ thuật PCR

- Máy ly tâm lạnh( Clinispin, Đức)

- Máy điều nhiệt tự động (Eppendorf, Đức)

- Bộ điện di ngang (Fisher scientific,USA)

- Máy chụp ảnh gel (GelDoc-lt imager, USA)

 Sinh phẩm, hóa chất,dụng cụ dùng trong kỹ thuật Southern

Blot

* Sinh phẩm:

- Môi trường TM,CHO hoặc canh thang BHI (tự pha)

- Enzym S1 (Của hãng Sigma)

- Lyzozyme, proteinase K (Của hãng Sigma)

- Dung dịch ly giải vi khuẩn và một số dung dịch khác (Của hãng Sigma)

* Hóa chất:

- Thạch incert agarose (cambrex Biocience, Rockland Inc. USA)

- Thạch gold agarose (cambrex Biocience, Rockland Inc. USA)

- Ethidium bromide dùng để nhuộm các đoạn ADN

- Dung dịch EDTA

- Dung dịch pett IV (tự pha với hóa chất gốc)

- Dung dịch ES(tự pha với hóa chất gốc).

- Dung dịch Tris- HCL 1M (Invitrogen.)

- Dung dịch BSA 1%

- Màng lai nitrocellulose

- Một số hóa chất khác....

* Dụng cụ, máy móc phục vụ cho kỹ thuật Southern Blot - Dàn máy PFGE (CHEF - DRR II (Bio- rad)

- Máy chuyển ADN lên màng lai (Prehybridization)

- Máy Hybridization

2.4.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.3.1. Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập

Mẫu bệnh phẩm để xác định căn nguyên gây NKHHCT trẻ em được lấy từ

dịch tỵ hầu, dịch hút nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản. Cách lấy bệnh phẩm

được thực hiện theo thường quy của Tổ chức Y tế thế giới (WHO).

* Cách lấy bệnh phẩm tỵ hầu:

 Bệnh nhân được bế ngồi trong lòng người lớn ở tư thế khám họng

( mặt nhìn ra phía trước, đầu hơi ngả ra phía sau).

 Dùng loại tăm bông có cán được làm bằng kim loại mềm, không gỉ vào

qua lỗ mũi một đoạn bằng chiều dài 1/2 từ cánh mũi đến dái tai cùng bên.

 Xoay tròn tăm bông vài lần rồi nhẹ nhàng kéo ra đưa vào tuýp có môi

trường vận chuyển .

 Cắt đoạn trên của tăm bông, phần không chạm vào tuýp và đậy chặt nắp.

 Dán nhãn trên tuýp đựng mẫu bệnh phẩm.

 Hoàn thành các mẫu theo yêu cầu của phòng thí nghiệm.

* Cách lấy bệnh phẩm đường hô hấp dưới:

 Bệnh nhân được lấy dịch nội khí quản qua sonde vô trùng sau khi được

đặt nội khí quản hoặc dịch rửa phế quản qua nội soi phế quản.

 Dán nhãn trên ống đựng mẫu bệnh phẩm.

 Hoàn thành các mẫu theo yêu cầu của phòng thí nghiệm.

* Vận chuyển mẫu bệnh phẩm:

 Chuyển đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt để giảm tối đa sự

phát triển của vi khuẩn hội sinh .

2.4.3.2. Nuôi cấy, phân lập, xác định căn nguyên vi khuẩn:

Thực hiện theo thường quy của WHO và Viện Y học Nhiệt đới thuộc đại học

Nagasaki- Nhật Bản [7], [17], [59], [79], [93], [116].

*Xử lý bệnh phẩm:

Bệnh phẩm được đưa vào ống nghiệm vô trùng chứa 1ml canh thang BHI.

Dùng máy lắc trộn đều, rồi loại bỏ tăm bông. Lúc này, dung dịch bệnh phẩm đã

được pha loãng 100 lần (vì bệnh phẩm lấy được bằng tăm bông tương đương 0,01

ml pha trong 1ml canh thang BHI).

* Sơ đồ2.1. Sơ đồ nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn.

*Kỹ thuật cấy đếm: dùng máy lắc trộn đều ống số 1, sau đó lấy 0,5 ml hỗn

dịch trộn với 4,5 ml NaCl 0,9% ở ống số 2. Tiếp tục làm như vậy cho đến ống số 6.

Tại ống số 6, sau khi đã trộn đều hỗn dịch thì bỏ đi 0,5 ml. Như vậy, bệnh phẩm đã được pha loãng thành 6 độ: 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6; 10-7.

 Từ các nồng độ pha loãng trên, dùng que cấy chuẩn lấy 1 ăng đầy

(tương đương 0,01 ml hỗn dịch) cấy lên 1/6 đĩa thạch TM,CHO được đánh số tương

ứng, với lưu ý cấy từ nồng độ loãng nhất đến nồng độ đặc nhất. Chờ se mặt thạch, lật ngược đĩa thạch, để vào tủ ấm 35 - 370C trong khí thường có 5% CO2, sau 24 giờ đọc kết quả.

 Nếu sau 24 giờ, chưa thấy vi khuẩn mọc thì tiếp tục để trong điều kiện

như trên, thêm 24 giờ nữa. Sau 48 giờ nuôi cấy, không thấy vi khuẩn mọc thì bệnh

phẩm đó được kết luận là âm tính.

 Nếu có vi khuẩn mọc thì tiến hành đếm và tính số lượng khuẩn lạc như sau:

o Số lượng khuẩn lạc = n x 102 x nồng độ pha loãng.

o Ví dụ: ở vùng 5 số khuẩn lạc đếm được là 7, thì số lượng khuẩn lạc ở

vùng 5 = 7 x102 x 106.

Ở đây x102 vì: 1 ăng chuẩn tương đương 0,01 ml. Số lượng khuẩn lạc lại

được tính cho 1ml bệnh phẩm.

 Nếu ở một nồng độ lại có 2 hoặc 3 loại khuẩn lạc mọc thì cách tính số

lưọng khuẩn lạc như trên (số lượng khuẩn lạc được tính cho 2 hoặc 3 loại vi

khuẩn/1ml).

 Theo Oishi Nagatake và cộng sự để khẳng định căn nguyên gây

NTHHCT ở trẻ nhỏ có biểu hiện lâm sàng, kết quả nuôi cấy vi khuẩn phải lớn hơn hoặc bằng 106 CFU/1ml. * Đối với bệnh phẩm có lớn hơn hoặc bằng 106 CFU/1ml, tiến hành nhuộm Gram

và thử oxydase (âm tính) => đưa và máy định danh để có chẩn đoán xác định là

Klebsiella pneumoniae.

* Định danh vi khuẩn bằng máy VITEK 2:

Trên thạch dinh dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc vi khuẩn cần định danh đã

được nuôi cấy thuần nhất sau 18 - 24 giờ. Tiến hành nhuộm gram, soi và xác định

hình thể vi khuẩn:

- Nếu là cầu trùng gram dương tiến hành thử nghiệm catalase

+ Catalase dương tính => sử dụng card định danh tụ cầu

+ Catalase âm tính =>làm thử nghiệm optochin

* Optochin dương tính => sử dụng card định danh phế cầu

* Optochin âm tính => sử dụng card định danh liên cầu

- Nếu là nấm => sử dụng card định danh nấm

- Nếu là khuẩn lạc hơi xám, chỉ mọc trên chocolate còn trên thạch máu

không mọc hoặc mọc yếu, nhuộm Gram soi thấy hình ảnh trực khuẩn gram âm đa

hình thái nghĩ tới Heamophilus sử dụng card NH định danh cho Heamophilus.

- Nếu là trực khuẩn gram âm sử dụng card định danh GN test kit code 21341,

dựa trên 54 tính chất sinh vật hóa học cho xác định các trực khuẩn gram âm. 54 tính

APPA

dGLU

BAap

dTAG

NAGA

CMT

ADO

GGT

ProA

dTRE

AGAL

BGUR

PyrA

OFF

LIP

CIT

PHOS

+ O129R

dCEL

BGLU

PLE

+ MNT

GlyA

GGAA

BGAL

dMAL

TyrA

5KG

ODC

IMLTa

H2S

dMAN

URE

ILATk

LDC

ELLM

BNAG

dMNE

dSOR

AGLU

IHISA

ILATa

AGLTp

BXYL

SAC

SUCT

BXYL

IARL

chất sinh vật hóa học sau để khẳng định là chủng vi khuẩn Klebsiella spp.

2.4.3.3. Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán trên thạch

+ Nguyên lý:

Các loại kháng sinh khác nhau đã được tẩm trong các khoanh giấy, sẽ khuếch

tán trong thạch và kìm hãm sự phát triển của chủng vi khuẩn trên bề mặt thạch,

tạo thành các vòng ức chế. Dựa vào đường kính vòng ức chế để đánh giá mức

độ nhạy cảm của chủng vi khuẩn với kháng sinh tương ứng.

+ Mục đích :

Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh với các

loại kháng sinh khác nhau.

* Kỹ thuật [26], [25], [43], [71], [84], [90].

- Chuẩn bị môi trường:

Môi trường MH (có thể cho thêm chất bổ sung tùy loại vi khuẩn) được

chuẩn bị trong hộp lồng với độ dày 4-5mm, lưu ý khi đổ môi trường cần đặt trên

một mặt phẳng, để đảm bảo độ dầy của thạch đồng đều. Môi trường đã được chuẩn

bị có thể bảo quản trong túi nylon kín, giữ ở 4-80C, sử dụng trong 2 tuần. Trước khi sử dụng, nên phơi trong tủ ấm 370C/15phút.

- Chuẩn bị chủng:

Vi khuẩn đã được định danh, thuần khiết, nuôi cấy 18-24h trên môi trường

không có chất ức chế (tùy loại vi khuẩn sẽ cần môi trường thích hợp để phát triển tốt,

xem phần 2.3.), lấy vi khuẩn hòa trong canh thang MH, nước muối sinh lý 0,9% NaCl

hoặc dùng đệm PBS pH 7,2 tùy loại vi khuẩn so với độ đục chuẩn McFarland 0,5 để có huyền dịch vi khuẩn ban đầu tương ứng với 108 vi khuẩn/1ml. Sau đó tiếp tục pha

loãng huyền dịch này 1/100 (hoặc 1/10 tùy theo mỗi loại vi khuẩn) trong canh thang MH hoặc nước muối sinh lý để có huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/1ml (hoặc 107, hoặc 108 vi khuẩn/1ml, tùy theo mỗi loại vi khuẩn). Có thể tạo huyền dịch vi khuẩn bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang MH ở 370C/3-5h có lắc (nồng độ vi khuẩn này tương đương với độ đục chuẩn Mc-Farland 0,5 là 108 vi khuẩn/1ml).

* Tiêu chuẩn để đánh giá một huyền dịch vi khuẩn pha đạt chuẩn được dựa

trên hình ảnh kháng sinh đồ, các khuẩn lạc đứng cạnh nhau, không chồng dày lên

nhau.

- Cấy vi khuẩn: Láng huyền dịch vi khuẩn 106 vi khuẩn/1ml (hoặc 107, hoặc 108 vi

khuẩn/1ml, tùy theo loại vi khuẩn) lên bề mặt thạch, dùng pipette Pasteur loại bỏ

huyền dịch vi khuẩn còn thừa ra khỏi đĩa thạch. Hoặc dùng tăm bông dàn đều vi

khuẩn lên bề mặt thạch, sau đó để hộp thạch khô tự nhiên hoặc phơi trong tủ ấm 35- 370C/15-30 phút.

- Đặt khoanh giấy kháng sinh:

Dùng dụng cụ đặt khoanh giấy hoặc dùng pince kẹp để đặt khoanh giấy

kháng sinh, sao cho khoảng cách giữa các khoanh giấy cách nhau 2cm và cách mép

hộp lồng 2cm, hộp lồng tròn đường kính 90mm đặt tối đa 7 khoanh giấy (6 khoanh

xung quanh và 1 khoanh ở giữa), hộp lồng vuông cạnh 120mm đặt tối đa 16 khoanh

giấy (bốn hàng x 4 khoanh/hàng). Sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, cần để hộp lồng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi cất trong tủ ấm 35-370C (Để lật ngược nắp

hộp lồng xuống dưới, tránh hiện tượng hơi nước tích tụ rơi từ nắp hộp xuống mặt

thạch đã láng vi khuẩn, làm ảnh hưởng đến kết quả).

- Đọc kết quả : - Đọc kết quả sau khi đã để tủ ấm 35-370C/18-24h.

- Dựa vào bảng chuẩn để xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của từng

loại vi khuẩn khác nhau.

- Có ba mức độ nhạy cảm được qui định: nhạy cảm(Susceptible -viết tắtS)

,trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R).

- Các chủng chuẩn được tiến hành song song với các mẫu bệnh phẩm để

kiểm tra chất lượng kỹ thuật

Hình 2.1. Kháng sinh đồ trên hộp lồng vuông cạnh 120mm

2.5.3.4. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch để xác định khả năng sinh

men β-lactamase phổ rộng (ESBL) của vi khuẩn (CLSI)

Mục đích: Xác định xem các chủng Klebsiella spp. phân lập tại Bệnh viện

Nhi trung ương có sinh men β-lactamase phổ rộng không.

Nguyên lý: Nếu các chủng vi khuẩn được thử có sinh ra men β-lactamase

phổ rộng, nó sẽ phân huỷ kháng sinh cefotaxim và ceftazidim, làm cho vòng vô

khuẩn của các kháng sinh này giảm xuống tới mức nhạy cảm vừa (Intermidiated – I)

hoặc kháng (Resistance – R). Kháng sinh augmentin (phối hợp của hai kháng sinh:

amoxicillin và acid clavulanic), có chất ức chế men β-lactamase phổ rộng là axid

clavulanic, nên kháng sinh amoxicillin không bị phá huỷ và có vòng vô khuẩn ở

mức nhạy cảm (Sensitive – S). Đồng thời ở vùng giáp ranh giữa các kháng sinh

augmentin (AMC) với cefotaxim (CTX), augmentin (AMC) với ceftazidim (CAZ),

do men  - lactamase phổ rộng của vi khuẩn ở 2 vùng này bị ức chế bởi chất ức chế

axid clavulanic từ khoanh giấy kháng sinh augmentin nên cefotaxim và ceftazidim

không bị phá huỷ, vi khuẩn bị tiêu diệt, làm xuất hiện sự mở rộng vòng vô khuẩn ở

đây. Được gọi là hình ảnh hiệp đồng (hình ảnh nút chai sâm panh)

Kháng sinh:

4 khoanh giấy kháng sinh được lựa chọn để phát hiện sự sinh men  -

lactamaza phổ rộng của vi khuẩn được thử là:

- Aztreonam (ATM - thuộc họ monobactam).

- Cefotaxim (CTX) và Ceftazidim (CAZ) là hai cephalosporin thế hệ III, bị

phá huỷ bởi men β-lactamase phổ rộng.

- Augmentin (AMC) là một kháng sinh phối hợp giữa amoxicillin với một

chất ức chế  - lactamase là axid clavulanic.

Các bước tiến hành:

Tiến hành các bước tương tự ở phương pháp khoanh giấy khuếch tán. Đầu tiên, pha canh khuẩn có nồng độ 108 vi khuẩn/ml, sau đó pha loãng thành nồng độ 106 vi khuẩn/ml. Láng canh khuẩn này lên bề mặt thạch, hút canh khuẩn thừa bỏ đi,

để khô mặt thạch. Dùng kim tiêm sạch đặt 4 khoanh giấy lên bề mặt thạch theo sơ

ATM

AMC

CTX

CAZ

đồ hình 4

Sơ đồ 2.2. Đặt khoanh giấy kháng sinh xác định men  - lactamase phổ rộng.

Ghi chú: AMC - augmentin,ATM - Aztreonam,

CTX - cefotaxim, CAZ – ceftazidim.

Sau khi để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán đều, cho

vào tủ ấm 35-370C/18 giờ với tư thế đảo ngược đĩa thạch.

Đánh giá kết quả

  - lactamase phổ rộng dương tính (có sinh men β-lactamase phổ

rộng) trong trường hợp chủng vi khuẩn nhạy cảm với AMC nhưng kháng CTX,

CAZ, ATM và có hình ảnh hiệp đồng ở vùng giáp ranh giữa các khoanh giấy

AMC với CTX, AMC với ATM hoặc AMC với CAZ.

Nghĩa là:

- Vi khuẩn sinh men β-lactamase phổ rộng bị ức chế bởi chất ức chế là axid

clavulanic, nên nhạy cảm với AMC.

- Men β-lactamase này có phổ mở rộng nên đã tác động đến các

cephalosporin thế hệ III, vì thế CTX, CAZ và ATM đều bị kháng hoặc giảm tính

nhạy cảm ( R hoặc I).

- Nhưng riêng vùng giáp ranh giữa các khoanh giấy AMC với CTX hoặc

AMC với CAZ hoặc AMC với ATM do có sự ức chế bởi chất ức chế là axid

clavulanic nên men β-lactamase phổ rộng không tác động vào các cephalosporin

thế hệ III, vi khuẩn bị diệt tạo hình ảnh mở rộng của vòng vô khuẩn. Được gọi là

hình ảnh hiệp đồng (hình ảnh nút chai sâm panh)

 Còn lại các trường hợp khác đều đọc là men β-lactamase phổ rộng âm

tính (không sinh men β-lactamase phổ rộng ).

2.4.3.5. Xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum

Inhibitory Concentration - MIC)

- Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ

nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong

môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).

- Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi

đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và bằng

mắt thường đã có thể xác định được điều này.

- Kỹ thuật [43], [77],[84], [87].

+ Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch “mẹ”)

+Nếu sử dụng kháng sinh bột dùng cho phòng thí nghiệm: Dựa

trên hoạt lực của kháng sinh (được ghi trên các nhãn lọ), cần tính để pha dung dịch

“mẹ” theo công thức sau:

Ví dụ: Kháng sinh chloramphenicol có hoạt lực 99,13%, nếu cần pha 10 ml

1600

dung dịch kháng sinh “mẹ” có nồng độ 1600 g/ml, sẽ phải cân Xg kháng sinh:

x ml 99,13

Xg kháng sinh = = 16.140,421 g/ml = 0,016140 g/ ml

Kháng sinh bột sau khi được cân, sẽ pha với dung dịch đệm thích hợp, tùy

mỗi loại kháng sinh khác nhau sẽ có những dung môi và dung dịch đệm khác nhau

(phụ thuộc từng hãng sản xuất loại kháng sinh). Nhiều loại kháng sinh có thể hoà

tan và được pha loãng trong nước cất. Một số khác cần phải hoà tan trong các dung

môi đặc biệt, sau đó mới được pha loãng trong nước cất. Dung dịch kháng sinh “mẹ” sau khi pha xong, chia nhỏ ra các ống nghiệm, bảo quản trong lạnh âm 200C

(trừ kháng sinh Acid nalidixic bảo quản ở nhiệt độ phòng). Khi đã lấy ra sử dụng,

chỉ dùng trong 24h.

+ Pha các nồng độ kháng sinh

Độ pha Dung dịch “mẹ”

Dung dịch đệm PBS * (hoặc nước cất) - 2ml 3 ml 3,5 ml 7,5 ml 2 ml 3ml 3,5 ml 7,5 ml - 1/2 1/4 1/8 1/16 1/2 1/4 1/8 1/16 Nồng độ trung gian (g/ml) 1280 640 320 160 80 40 20 10 5 Nồng độ cuối cùng (g/ml)** 128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 2,5 ml (1280 g/ml) 2 ml 1 ml 0,5 ml 0,5 ml 2ml (80 g/ml) 1 ml 0,5 ml 0,5

2 ml 3ml 3,5 ml 7,5 ml 2 ml 3ml 1/2 1/4 1/8 1/16 1/2 1/4 2,5 1,25 0,64 0,32 0,16 0,08 0,25 0,125 0,064 0,032 0,016 0,008 2ml (5 g/ml) 1 ml 0,5 ml 0,5 ml 2ml (0,32 g/ml) 1 ml Ghi chú:

* PBS: Dung dịch đệm phosphat dùng để pha loãng kháng sinh.

** Nồng độ cuối cùng pha loãng 1/10 trong môi trường, được tính theo tỷ lệ

trộn 2,5 ml dung dịch trung gian + 22,5 ml thạch MH.

- Các bước tiến hành

Ngày 1: Chuẩn bị chủng và môi trường

- Các chủng cần thử MIC và các chủng chuẩn quốc tế được cấy trong canh

thang thường hoặc canh thang MH để có được canh khuẩn non, theo tỷ lệ sau: trực

khuẩn Gram âm: cấy 0,1 ml;

- Chuẩn bị thạch MH: Cân thạch theo công thức (ghi trên hộp), đun sôi cho

tan hết thạch, hấp thạch ở 1210C/15’.

- Khi thạch đã nguội còn khoảng 40-500C, dùng ống đong khắc vạch đong

22,5 ml thạch cho vào bình nón đã có sẵn 2,5 ml dung dịch kháng sinh theo các

nồng độ như trong bảng pha kháng sinh, lắc kỹ và đổ vào hộp lồng, khi thạch đã đông cứng, bảo quản trong tủ lạnh 4 - 80C (có thể bảo quản được trong 2 tuần). Mỗi

lần làm MIC cần 2 đĩa môi trường MH không có kháng sinh để làm đĩa chứng (cho

thêm 2,5 ml PBS hoặc nước cất + 22,5 ml môi trường thạch MH).

Ngày 2: Cấy vi khuẩn trên bề mặt đĩa thạch MH có nồng độ kháng sinh

khác nhau

- Cấy vi khuẩn thuần khiết từ canh khuẩn non (canh khuẩn đã cấy qua đêm 18h-tương đương 108 vi khuẩn/ml) hoặc lấy một số khuẩn lạc từ môi trường thạch

thích hợp hoà vào 3 ml dung dịch đệm PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%) để có độ đục bằng độ đục của ống Mc Farland 0,5 – tương đương 108 vi khuẩn/ml. Tiếp tục

pha loãng 1/100 để có nồng độ 106vi khuẩn/ml bằng cách dùng micropipet hút 20 l

cho vào 2 ml đệm PBS (hoặc nước muối sinh lý 0,9%).

- Dùng pipet Pasteur hút khoảng 0,5 ml huyền dịch (106 vi khuẩn/ml) cho

vào mỗi giếng của bàn đinh, theo sơ đồ đã ghi số của các chủng:

1 2 3 4

5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16

17 18 19 20 21 22

23 24 25 26 27 28

29 30 Chủng Chủng

chuẩn* chuẩn*

* Chủng chuẩn là E.coli ATCC 25922.

- Dùng bộ phiên bản 32 chân đinh chấm vào giếng sau đó đặt lên đĩa thạch MH có

các nồng độ kháng sinh khác nhau.

Sau khi đặt lên các đĩa thạch, chờ cho đĩa thạch khô (các giọt nước tại các chân đường cấy thấm vào thạch (khoảng 15-20 phút) cất vào tủ ấm 35-370C/18h, lật

úp đĩa thạch.

Ngày 3: Đọc kết quả

- Trước tiên đọc kết quả ở các đĩa thạch chứng không có kháng sinh để kiểm

tra sự thuần khiết của chủng vi khuẩn và đảm bảo vi khuẩn không bị chết trước và

trong khi tiến hành, nếu các chủng đảm bảo thuần khiết và phát triển tốt mới đọc

tiếp.

- Đọc kết quả ở các chủng chứng (chủng chuẩn quốc tế), so sánh kết quả MIC của

các chủng này với bảng chuẩn (Theo Viện chuẩn thức vi sinh lâm sàng Mỹ-CLSI ), nếu

những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một

bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện của thí nghiệm đã đạt được chuẩn thức

- Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất.

Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát

triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc mọc.

- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu.

- Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là: nhỏ

hơn hoặc bằng nồng độ đó (). Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi

khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó ().

- Kết quả MIC của các chủng sẽ được xác định theo ba mức độ nhạy cảm, dựa

theo bảng chuẩn (CLSI): nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian

(Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R).

2.4.3.6. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR được Karl Mullis người Mỹ thực hiện vào năm 1985 [104].

Từ đó đến nay kỹ thuật này được sử dụng rất phổ biến và ứng dụng rất nhiều trong

các thí nghiệm về sinh học phân tử.

- Nguyên tắc của phản ứng PCR.

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của

DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase chịu

nhiệt (Taq-polymerase) với nguyên liệu là 4 loại deoxyribonucleotide (dATP,

dTTP, dGTP, dCTP). Enzym DNA - polymerase xúc tác tổng hợp một mạch DNA

mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi

ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.

Taq-polymerase là một loại DNA - polymerase (tách chiết từ vi khuẩn chịu

nhiệt Thermus aquaticus), còn mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có khả năng

bắt cặp với một đầu của mạch khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình

thành đoạn mới. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng để làm khuôn cho

các phản ứng tiếp theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng phân tử DNA tăng gấp đôi, vậy sau n chu kỳ số lượng sản phẩm PCR là 2n, đủ số lượng để tách ra, giải mã hoặc

tách dòng.

- Các bước tiến hành

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mối chu kỳ gồm 3 bước:

- Bước 1: Là giai đoạn biến tính (denaturation). Thành phần phản ứng PCR nói

chung gồm những thành phần cơ bản sau: Dung dịch đệm PCR, dNTP, mồi xuôi và ngược,

Taq-polymerase và DNA khuôn. Trong giai đoạn này DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 940C-950C với thời gian 30-60 giây.

- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing-Ta). Nhiệt độ lúc này phải hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này trong khoảng 40-700C tuỳ thuộc nhiệt độ

tối ưu cho bắt cặp của các mồi sử dụng và được kéo dài 30-60 giây.

- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extended). Nhiệt độ được tăng lên 720C để các enzym polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tuỳ thuộc vào độ dài

của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 phút đến nhiều phút .

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi DNA mới tạo thành tiếp tục được dùng làm khuôn

cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối của sản phẩm

PCR là những đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn

gen mồi và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận 5' của 2 đoạn

gen mồi.

Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,2% chạy cùng với marker để

so sánh đối chiếu độ lớn của đoạn DNA cần quan tâm.

Bước 1: Biến tính 940C trong 1 phút

Bước 2: Bắt cặp 540C trong 45 giây

Mồi xuôi và mồi ngược

30 - 40 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước.

Bước 3: Kéo dài 720C trong 2 phút

(Nguồn: Vierrstraete, 1999

)

Hình 2.2. Hình ảnh các bước phản ứng PCR

- Các bước tiến hành PCR với các gen nghiên cứu trong đề tài

 Tách ADN từ vi khuẩn bằng nhiệt: một khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi cấy sau 24 giờ làm đồng nhất với 200 µl nước cất và ủ 1000C trong 5 phút, ly tâm 1200

vòng trong 5 phút, phần dịch trong chứa ADN vi khuẩn được dùng làm khuôn cho

phản ứng PCR.

 Thành phần PCR: Sử dụng PCR PreMix (Bioneer, Hàn Quốc) bao gồm

1pmol mồi mỗi loại, ADN vi khuẩn 1,5 µl, thêm H2O đến thể tích 20 µl.

 PCR được tiến hành trên máy điều nhiệt Thermalcycler (Eppendorf, Đức) với các bước sau: biến tính toàn bộ 950C trong 5 phút; phản ứng lặp lại 30 chu kỳ các bước biến tính cục bộ 950C trong 30 giây, bám mồi 500C (đối với gen kháng kháng sinh nhóm Quinolon và CTX-M) hoặc 560C (đối với gen SHV; TEM) trong 45 giây; tổng hợp ở 720C trong 1 phút; hoàn thành phản ứng tổng hợp ở 720C trong 10 phút và giữ mẫu ở 15oC. Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di gel agarose

1,2% với chất nhuộm Ethidium bromide và soi dưới ánh sáng tử ngoại.

 Thông tin các mồi dùng để xác định sự có mặt của gen kháng kháng sinh

nhóm Quinolon và β-lactamase phổ rộng nằm trên plasmid (Bảng 1).

 ADN chuẩn của hãng Bioneer Hàn Quốc.

 Chủng chứng dương Klebsiella đã chắc chắn có gen qnr, CTX-M, SHV,

TEM .

2.4.3.7. Kỹ thuật Southern Blot [121]: ADN đã khuếch đại bằng PCR được

mở vòng xoắn, phân tách thành sợi đơn và cắt bằng enzym giới hạn nuclease

S1(enzym cắt đặc hiệu cho ADN plasmid); điện di xung trường (PFGE) để tách các

đoạn ADN đã bị cắt; ii) Các đoạn ADN được chuyển sang màng lai nitrocellulose;

iii) Các đoạn ADN trên màng được lai với mẫu dò đặc hiệu dựa theo nguyên lý bổ

xung ADN; iv) Cố định và phát hiện sự có mặt của phân tử lai ADN- mẫu dò được

đánh dấu bằng biotin với mối liên kết chắc chắn với avadin. Avadin hỗn hợp với

phosphatase kiềm dưới tác dụng của chất nền sinh mầu tạo ra mầu tím của sản

phẩm.

Hình 2.3. Kỹ thuật Southern Blot

- Các số liệu thu thập được sẽ được các nghiên cứu viên kiểm tra để phát

2.5. Phân tích và xử lý số liệu:

- Số liệu sau khi được xử lý thô được mã hóa và nhập vào máy tính bằng

hiện những sai sót và làm sạch (xử lý thô).

phần mềm Epidata 3.1. Chương trình nhập số liệu được xây dựng riêng cho nghiên

- Số liệu nghiên cứu và kết quả được xử lý bằng phần mềm SPSS. Thống kê

cứu này bao gồm tệp CHECK nhằm hạn chế tối đa những sai số.

phân tích được thực hiện thông qua các test như khi bình phương so sánh các tỷ lệ,

Mann-Whitney test đối với so sánh 2 nhóm và Kruska Wallis test đối với so sánh 3

nhóm về các đặc điểm của nhóm NKHHCT và nhóm NKHHCT kết hợp. Mức

p<0,05 được sử dụng nhằm xác định ý nghĩa thống kê.

2.6. Đạo đức trong nghiên cứu:

- Nghiên cứu đã được thông qua hội đồng y đức bệnh viện và hội đồng xét

duyệt đề cương nghiên cứu sinh chấp thuận về mặt y đức.

- Các kỹ thuật thực hiện trong nghiên cứu không gây tổn hại đến sức khỏe

của đối tượng nghiên cứu.

- Nghiên cứu được thực hiện với mong muốn góp phần phát hiện căn nguyên

tình trạng kháng kháng sinh ở bệnh nhi NKHHCT tại Bệnh viện nhi Trung ương mà

không nhằm bất cứ mục đích hưởng lợi nào gây tổn hại đến đối tượng nghiên cứu,

cộng đồng và xã hội.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Tỷ lệ và sự phân bố tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập từ bệnh nhi NKHHCT

0 đến 6 tuổi với một số yếu tố liên quan

3.1.1. Sự phân bố mẫu bệnh phẩm nhiễm khuẩn hô hấp theo nhóm bệnh và

theo khoa lâm sàng

Từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010, có tổng số 3.567 mẫu bệnh phẩm

đường hô hấp được nuôi cấy xác định tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp

tính ở các khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp đã được

đưa vào nghiên cứu. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này thu thập từ bệnh nhi

0 đến 6 tuổi được phân tích chung và xem xét ở hai nhóm: NKHHCT và NKHHCT

kết hợp.

Bảng 3.1: Sự phân bố của các mẫu bệnh phẩm

theo Khoa và theo nhóm bệnh

TT Khoa Tổng số chung Số mẫu bệnh phẩm thuộc nhóm NKHHCT Số mẫu bệnh phẩm thuộc nhóm NKHHCT kết hợp

1 Hô hấp 936 0 936

2 Sơ sinh 570 223 793

3 Hồi sức cấp cứu 403 570 973

4 Hồi sức ngoại 0 865 865

Tổng 1.909 1.658 3.567

Như vậy, trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đã có 1.909 mẫu bệnh phẩm thu thập được ở

nhóm NKHHCT và 1.658 mẫu bệnh phẩm thu thập được ở nhóm NKHHCT kết

hợp từ bệnh nhi 0 đến 6 tuổi được thử nghiệm và phân tích trong nghiên cứu này.

3.1.2. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính

Từ tháng 7/2009 - 7/2010 có 1.181 mẫu bệnh phẩm phân lập được vi khuẩn

trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp ở bệnh nhi sơ sinh đến 6 tuổi, tại các

khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung

ương, cho thấy tỷ lệ nuôi cấy dương tính với các vi khuẩn gây bệnh là 33,1%.

Trong đó, 87 mẫu có 2 loài chiếm 7,4%.

Biểu đồ 3.1.Tỷ lệ nuôi cấy dương tính (n=3.567)

3.1.3. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp

phân bố ở các khoa

Với 1909 mẫu bệnh phẩm nhóm NKHHCT và 1658 mẫubệnh phẩm NKHHCT kết

hợp đã nuôi cấy tìm căn nguyên vi khuẩn gây bệnh. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính và sự

phân bố theo các khoa được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2: Tỷ lệ nuôi cấy dương tính ở hai nhóm bệnh

Khoa p P

% n % n

Tỷ lệ nuôi cấy dương tính thuộc nhóm NKHHCT Mẫu (+) tính Tỷ lệ nuôi cấy dương tính thuộc NKHHCT kết hợp Mẫu (+) tính

936 351 0 - - 37,5

570 278 223 122 48,8 54,7

p1- 2<0,001 p1- 3<0,001 p2- 3<0,001 403 85 21,1 570 127 22,2 p2- 3<0,001 p2- 4<0,001

p4-3>0,05

0 - - 865 218 25,2

1.909 714 1.658 467 Hô hấp(1) Sơ sinh(2) Hồi sức cấp cứu(3) Hồi sức ngoại(4) Tổng 37,4 28,1

Qua bảng 3.2. ta thấy, tỷ lệ nuôi cấy dương tính chung là 37,4% ở nhóm

NKHHCT và 28,1 % ở nhóm NKHHCT kết hợp. Cao nhất ở khoa sơ sinh (48,8%

và 54,7%), sau đó là khoa hô hấp (37,5%) và thấp nhất là khoa HSCC (21,1% và

22,2%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,001.

3.1.4. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được

Trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp nuôi cấy đã có 1.181 mẫu bệnh phẩm

tìm thấy vi khuẩn và nấm gây bệnh, sự phân bố của các loài vi khuẩn này đã được

phân tích như sau:

Bảng 3.3. Phân bố các loài vi khuẩn phân lập được (n=1181)

Loài VK Tỷ lệ %

Klebsiella pneumoniae Số lượng 267 22,61

Acinetobacter. spp 235 19,90

P. aeruginosa 217 18,37

E. coli 95 8,04

Enterobacter spp 41 3,47

H. influenzae 63 5,33

S.aureus 90 7,62

S. pneumoniae 60 5,08

Streptococcus spp. 52 4,40

Candida 76 6,44

63 5,33 Các chủng khác

Nhận xét: Qua bảng ta thấy đứng đầu là Klebsiella pneumoniae (22,6%) sau

đó là Acinetobacter spp. (19,9%), P. aeruginosa(18,4%). Các căn nguyên thường

gặp ở cộng đồng không cao là S. pneumoniae (5,1%), H. influenzae (5,3%).

3.1.5. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được theo nhóm bệnh

Sự phân bố của các loài vi khuẩn này theo các nhóm bệnh đã được phân tích như

Bảng 3.4. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được

ở hai nhóm bệnh

Nhóm NKHHCT (n=714) Nhóm NKHHCT kết hợp (n=467) TT Loài vi khuẩn

n Tỷ lệ % n Tỷ lệ %

1 Klebsiella pneumoniae 172 95 >0,05 24,1 20,3

2 Acinetobacter. spp 96 13,4 139 <0,001 29,8

3 P. aeruginosa 124 93 >0,05 17,4 19,9

4 E. coli 65 9,1 30 6,4 >0,05

5 Enterobacter spp 17 2,4 24 5,1 <0,02

6 H. influenzae 53 7,4 10 2,1 <0,001

7 S.aureus 56 7,8 34 7,3 >0,05

8 S. pneumoniae 48 6,7 12 2,6 <0,02

9 Streptococcus spp. 36 5,0 16 3,4 >0,05

10 Candida 56 7,8 20 4,3 <0,02

11 Các chủng khác 37 5,2 26 5,6 >0,05

Tỷ lệ phân lập được Klebsiella pneumoniae là cao nhất (24,1%) ở nhóm

NKHHCT và Acinetobacter spp.(29,8%) ở nhóm NKHHCT kết hợp, sau đó là P.

aeruginosa (17,4%) ở nhóm NKHHCT và Klebsiella pneumonia (20,3%) ở nhóm

NKHHCT kết hợp. Các cầu trùng gram dương có tỷ lệ từ 5,0% đến 7,8%.

Biểu đồ 3.2. Sự phân bố của các loài vi khuẩn phân lập được ở hai nhóm

(n=1.181)

Biểu đồ 3.2. cho thấy, tỷ lệ phân lập được các trực khuẩn gram âm là nổi trội

ở cả 2 nhóm. Tỷ lệ Klebsiella pneumonia ở nhóm NKHHCT cao hơn nhóm

NKHHCT kết hợp. Tỷ lệ P.aeruginosa và Acinetobacter ở NKHHCT kết hợp cao

hơn nhóm NKHHCT đặc biệt Acinetobacter là cao hơn hẳn.

3.1.6. Tỷ lệ phần trăm mẫu bệnh phẩm nuôi cấy dương tính với 2 loài vi

khuẩn gây bệnh

Bằng kỹ thuật cấy đếm xác định căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn

đường hô hấp cấp đã cho phép tính được tổng số vi khuẩn của mỗi loài trong 1ml bệnh phẩm và nếu số lượng vi khuẩn có ≥ 105 vi khuẩn trong 1 ml bệnh phẩm được

xem xét là căn nguyên gây bệnh. Vì vậy, trong nghiên cứu này đã tìm thấy một tỷ lệ

không nhỏ các mẫu bệnh phẩm phân lập được hai loại vi khuẩn gây bệnh đều có số lượng vi khuẩn ≥ 105 vi khuẩn.

Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ nuôi cấy dương tính 2 loài vi khuẩn/ 1 bệnh

phẩm(n=1.181)

Không có sự khác biệt về tỷ lệ nuôi cấy dương tính 2 loài/ 1 bệnh phẩm thu

được ở bệnh nhân NKHHCT và NKHHCT kết hợp với p>0,05

3.1.7. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn gram âm và gram dương

Biểu đồ 3.4. Phân bố tỷ lệ các vi khuẩn gram âm và gram dương(n=1181)

Nghiên cứu cho thấy chủ yếu các căn nguyên vi khuẩn phân lập được là trực

khuẩn gram âm chiếm 80,8%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, với p< 0,5.

3.1.8. Tỷ lệ phân bố vi khuẩn gram âm và gram dương trong hai nhóm bệnh

Kết quả nghiên cứu phân tích theo hướng phân lập được vi khuẩn Gram dương và âm như sau:

Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ phân lập vi khuẩn gram âm và gram dương ở 2 nhóm

(n=1.181) Qua biểu đồ ta thấy trực khuẩn gram âm chiếm đa số ở cả 2 nhóm (77,5 ở

nhóm NKHHCT và 84,9% ở nhóm NKHHCT kết hợp), trong đó nhóm NKHHCT

kết hợp cao hơn nhóm NKHHCT. Tỷ lệ cầu khuẩn Gram dương ở nhóm NKHHCT

cao hơn nhóm NKHHCT kết hợp. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,01.

Có 1,1 và 1,6% là song cầu gram âm ở 2 nhóm. Sự khác biệt này không có ý nghĩa

thống kê, với p>0,05

3.1.9. Tỷ lệ phân lập được các chủng K. pneumoniae

3.1.9.1. Tỷ lệ phân lập được các chủng K. pneumoniae theo tuổi nhóm NKHHCT Với 714 mẫu bệnh phẩm NKHHCT nuôi cấy dương tính từ các bệnh nhi 0

đến 6 tuổi ở các khoa Sơ sinh, HSCC, HSN và HH đã có 172 chủng K. pneumoniae

phân lập được. Sự phân bố các chủng K.pneumoniae theo độ tuổi ở nhóm

NKHHCT được thể hiện ở bảng 3.5

Bảng 3.5. Sự phân bố K. pneumoniae theo tuổi ở nhóm NKHHCT

Lứa tuổi Tỉ lệ % p n K. pneumoniae(+)

Sơ sinh (1) 286 76 26,6

Dưới 1 tuổi (2) 409 93 22,7

1 đến 6 tuổi (3) 19 3 15,8 p1-2>0,05 p1-3>0,05 p2-3>0,05

Tổng số 714 172 24,1

Tại kết quả bảng 3.5, tỷ lệ nhiễm K. pneumoniae của trẻ trong độ tuổi sơ

sinh ở nhóm NKHHCT là 26,6%; Của trẻ dưới 1 tuổi là 22,7% và trẻ 1 đến 6 tuổi là

15,8%. Các tỷ lệ này không có sự khác biệt với p>0,05

3.1.9.2. Tỷ lệ phân lập được các chủng K. pneumoniae theo nhóm tuổi

Trong 467 mẫu bệnh phẩm nhóm NKHHCT kết hợp nuôi cấy dương tính từ

các bệnh nhi 0 đến 6 tuổi ở các khoa Sơ sinh, HSCC, HSN và HH đã có 95 chủng

K. pneumoniae được phân lập. Sự phân bố các chủng K. pneumoniae theo độ tuổi

ở nhóm NKHHCT kết hợp được thể hiện ở bảng 3.6

Bảng 3.6. Sự phân bố K. pneumoniae ở nhóm NKHHCT kết hợp theo tuổi

Lứa tuổi n Tỉ lệ % p K. pneumoniae(+)

Sơ sinh (1) 236 51 21,6

207 42 20,3 Dưới 1 tuổi (2) p1-2>0,05 p1-3>0,05 p2-3>0,05 24 2 8,3 1 đến 6 tuổi (3)

467 95 20,3

Tổng số Qua bảng ta thấy, tỷ lệ nhiễm K. pneumoniae của trẻ trong độ tuổi Sơ sinh ở

nhóm NKHHCT kết hợp là 21,6%; trẻ dưới 1 tuổi là 20,3% và trẻ 1 đến 6 tuổi là

8,3%. Các tỷ lệ này không có sự khác biệt với p>0,05

3.1.9.3. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae theo giới tính

Trong 1.181 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp nuôi cấy dương tính từ các bệnh

nhi dưới 6 tuổi ở các khoa Sơ sinh, HSCC, HSN và HH đã có 267 chủng K.

pneumoniae phân lập được. Sự phân bố các chủng K.pneumoniae nhiễm khuẩn hô

hấp được thể hiện ở bảng 3.7

Bảng 3.7. Phân bố các chủng K. pneumoniae của cả hai nhóm bệnh theo

giới tính

% p Giới tính Kleb (+) Số lượng (n)

Nam 2.152 172 8,0 p>0,05 Nữ 1.415 6,7 95

Tổng số 3.567 267 7,4

Bảng trên cho thấy tỷ lệ phân lập được chủng vi khuẩn K. peumoniae ở trẻ

em nam và trẻ em nữ không có sự khác biệt, với p> 0,05.

3.1.9.4. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae theo giới tính ở nhóm NKHHCT Bảng 3.8. Tỷ lệ phân lập K. pneumoniae theo giới tính

ở nhóm NKHHCT

Giới p n K. pneumoniae(+) Tỉ lệ %

23,9 107 Nam 448

24,4 p>0,05 65 Nữ 266

24,1 172 Tổng số 714

Theo bảng trên ta thấy tỷ lệ phân lập được K. pneumoniae ở nam và nữ thuộc

nhóm NKHHCT không có sự khác biệt với p>0,05.

3.1.9.5. Tỷ lệ phân lập K. pneumoniae theo giới ở nhóm NKHHCT kết hợp

Với 467 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp nuôi cấy dương tính từ các bệnh nhi

0 đến 6 tuổi ở các khoa Sơ sinh, HSCC, HSN đã có 95 chủng K. pneumoniae phân

lập được. Sự phân bố các chủng K.pneumoniae theo giới tính ở nhóm NKHHCT kết

hợp được thể hiện ở bảng 3.9

Bảng 3.9. Tỷ lệ phân lập K. pneumoniae theo giới tính

ở nhóm NKHHCT kết hợp

K. Gioi n Tỉ lệ % p pneumoniae(+)

Nam 291 65 22,3

Nữ 176 30 17,0 p>0,05

Tổng số 467 95 20,3

Theo bảng trên ta thấy tỷ lệ phân lập được K. pneumoniae ở nam và nữ thuộc

nhóm bệnh NKHHCT kết hợp không có sự khác biệt với p>0,05.

3.1.9.6. Tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae theo các khoa lâm sàng

Trong 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp được chỉ định nuôi cấy ở bệnh

nhi 0 đến 6 tuổi từ các khoa Sơ sinh, Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại và Hô hấp để

chẩn đoán căn nguyên NKHHCT, chúng tôi đã phân lập được 267 chủng K.

pneumoniae gây bệnh bằng phương pháp cấy đếm. Tình trạng nhiễm K.

pneumoniae ở các khoa trên được trình bày theo tỷ lệ tổng số phân lập và tỷ lệ phân

lập theo hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp

Bảng 3.10. Phân bố chủng K.pneumoniae phân lập được theo Khoa

Số lượng % p Khoa Kleb (+) (n)

793 Sơ sinh(1) 106 13,7 p (1-2)<0,001

Hồi sức cấp 4,0 p (1-3)<0,001 973 41 cứu(2) p (1-4)<0,01

865 Hồi sức ngoại(3) 39 3,9 p (2-3)> 0,05

p (2-4)< 0,001 936 Hô hấp(4) 81 9,0

p (3-4)< 0,001 Tổng số 7,4 3.567 267

Như vậy tỷ lệ các chủng phân lập được ở khoa sơ sinh là cao nhất chiếm

13,7%, tiếp đến khoa hô hấp 9,0% và thấp nhất là khoa hồi sức ngoại 3,9%. Sự khác

biệt này có ý nghĩa thống kê, với p< 0,05.

3.1.9.7. Tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae theo các khoa lâm sàng và

theo nhóm NKHHCT

Bảng 3.11. Tỷ lệ chủng K. pneumoniae phân lập được

theo Khoa và theo nhóm NKHHCT

K. Tổng số mẫu Tỷ lệ % p Khoa bệnh phẩm (n) pneumoniae(+)

74 Sơ sinh (1) 570 13,0

Hồi sức cấp 4,2 17 403 cứu (2)

81 Hô hấp(3) 936 8,7 p 1-2<0,001 p 1-3<0,01 p 2-3<0,01

172 Tổng số 1.909 9,0

Như vậy, trong nhóm NKHHCT tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae

ở khoa Sơ sinh là cao nhất chiếm 13,0%, tiếp đến khoa Hô hấp 8,7% và thấp nhất là

khoa Hồi sức cấp cứu 4,2%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, với p< 0,01.

3.1.9.8. Tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae theo các khoa lâm sàng và

theo nhóm NKHHCT kết hợp

Bảng 3.12. Tỷ lệ chủng K.pneumoniae phân lập được

theo Khoa và theo nhóm NKHHCT kết hợp

Tổng số Tỷ lệ K. p Khoa mẫu bệnh pneumoniae(+) % phẩm (n)

Sơ sinh(1) 223 32 14,3

Hồi sức cấp cứu (2) 570 24 4,2

Hồi sức ngoại(3) 865 39 4,5

p1-2<0,001 p1-3<0,01 p2-3>0,05 Tổng số 1.658 95 5,7

Như vậy, trong nhóm NKHHCT kết hợp tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae ở khoa Sơ sinh là cao nhất chiếm 14,3%, tiếp đến khoa Hồi sức cấp cứu 4,2% và khoa Hồi sức ngoại 4,5%. Sự khác biệt giữa khoa sơ sinh và các khoa Hồi sức cấp cứu là có ý nghĩa thống kê, với p< 0,01. Sự khác biệt giữa khoa Hồi sức

cấp cứu và Hồi sức ngoại không có ý nghĩa thống kê, với p>0,05.

3.1.9.9. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được chung ở các nhóm tuổi theo mùa

Bảng 3.13. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được

Lứa tuổi

Xuân (tháng 1-3)

Hạ (tháng 4-6)

Thu (tháng 7-9)

Đông (tháng 10-12)

ở các nhóm tuổi theo mùa

n % n % n % n %

Sơ sinh 16 36,36 23 54,76 45 52,33 26 39,39 >0,05 >1 tháng 28 63,64 19 45,24 41 47,67 40 60,61

Tổng số 44 100 42 100 86 100 66 100

Qua bảng ta thấy tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được ở bệnh nhi sơ sinh cao nhất vào mùa hạ (54,76%), mùa thu (52,33%), mùa đông (39,39%) và

mùa xuân (36,36%). Ở bệnh nhi lớn hơn độ tuổi sơ sinh tỷ lệ này cao nhất vào mùa xuân (63,64%), sau đó là mùa đông (60,61%), mùa thu (47,67%) và mùa hạ (45,24%). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

3.1.9.10. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae ở nhóm NKHHCT phân lập được

theo các nhóm tuổi và theo mùa

Bảng 3.14. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae ở nhóm NKHHCT phân lập

được theo các nhóm tuổi và theo mùa

Lứa tuổi p

Xuân (tháng 1-3) Hạ (tháng 4-6) Thu (tháng 7-9) Đông (tháng 10-12)

n % n % n % n %

Sơ sinh 11 33,3 23 54,8 20 40,0 22 46,8 >0,05 >1 tháng 22 66,6 19 45,3 30 60,0 25 53,2

Tổng số 33 100 42 100 50 100 47 100

Qua bảng trên, ta thấy tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được ở bệnh nhi sơ sinh cao nhất vào mùa hạ (54,8%), mùa đông (46,8%), mùa thu (40%) và

mùa xuân (33,3%). Ở bệnh nhi trên 1 tháng tuổi, tỷ lệ này cao nhất vào mùa xuân (66,6%), sau đó là mùa thu (60%), mùa đông (53,2%) và mùa hạ (45,3%). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p>0,05. 3.1.9.11. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae ở nhóm NKHHCT kết hợp phân lập

được theo các nhóm tuổi và theo mùa

Bảng 3.15. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae ở nhóm NKHHCT kết hợp

phân lập được theo các nhóm tuổi và theo mùa

Xuân Hạ Thu Đông Lứa p

(tháng 1-3) (tháng4-6) (tháng 7-9) (tháng 10-12) tuổi

n % n % n % n %

Sơ sinh 5 45,5 17 58,6 25 69,4 4 21,1 p<0,01

>1 tháng 6 54,5 12 41,4 11 30,6 15 79,0

Tổng số 11 100 29 100 36 100 19 100

Qua bảng ta thấy tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được ở bệnh nhi

sơ sinh cao nhất vào mùa thu (69,4%), mùa hạ (58,6%), mùa xuân (45,5%) và mùa

đông (21,1%). Ở bệnh nhi trên 1 tháng tuổi, tỷ lệ này cao nhất vào mùa đông (79%),

sau đó là mùa xuân (54,5%), mùa hạ (41,4%) và mùa thu (30,6%). Sự khác biệt này

có ý nghĩa thống kê với p<0,01

Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae ở 2 nhóm bệnh phân lập được

theo các nhóm tuổi và theo mùa

Qua biểu đồ 3.6., ta thấy, tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được

theo các nhóm tuổi và theo mùa ở nhóm tuổi sơ sinh cao nhất vào mùa thu, sau đó

là mùa hạ rồi đến mùa xuân và mùa đông; Ở độ tuổi trên 1 tháng tuổi cao nhất vào

mùa đông sau đó là mùa xuân rồi đến mùa hạ và mùa thu.

3.1.10. Tỷ lệ nhiễm một số loài vi khuẩn thường gặp trên bệnh nhi xin về và tử

vong

3.1.10.1.Tỷ lệ nhiễm một số loài vi khuẩn thường gặp trên bệnh nhi xin về và tử vong

Trong số 1.181 tổng số mẫu phân lập được vi khuẩn có 869 mẫu bệnh phẩm

của bệnh nhi xin về và tử vong

Biểu đồ 3.7.Tỷ lệ nhiễm một số loài vi khuẩn thường gặp

trên bệnh nhi xin về và tử vong

Tỷ lệ K. pnemoniae và các vi khuẩn thường gặp trên bệnh nhi xin về và tử

vong không có sự khác biệt, với p>0,05

3.1.10.2. Tỷ lệ nhiễm một số loài vi khuẩn thường gặp ở bệnh nhi xin về và tử

vong của hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp

Bảng 3.16. Tỷ lệ nhiễm một số loài vi khuẩn thường gặp ở bệnh nhi xin về

và tử vong của hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp

NKHHCT NKHHCT kết hợp p

Các loài vi khuẩn n (+) % n (+) %

17,9

K. pneumoniae 172 14 8,1 17

Acinetobacter 96 139 10 36 10,4 25,9 <0,05 9 7,3 P. aeruginosa 124 93 19 20,4

5 S. aureus 56 94 9 9,0 26,5

421

19,2

Tổng số 448 38 81 8,5

Biểu đồ 3.8: Tỷ lệ nhiễm một số loài vi khuẩn thường gặp ở bệnh nhi xin

về và tử vong của hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp

Trong cả hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp, tỷ lệ các chủng

Acinetobacter và S. aureus ở bệnh nhi xin về và tử vong nổi lên hàng thứ nhất và

thứ hai. Trong hai nhóm, nhóm NKHHCT kết hợp có cả 4 loài vi khuẩn

K.pneumoniae, Acinetobacter, P. aeruginosa, S. aureus cao hơn nhóm NKHHCT,

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, với p <0,05.

3.2. Xác định tính nhạy cảm kháng sinh và khả năng sinh enzym β-lactamase

phổ rộng (ESBLs) của chủng Klebsiella pneumoniae

3.2.1. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng kỹ

thuật định tính:

Trong số 267 chủng K. peumoniae spp. phân lập được thử nghiệmt ính nhạy

cảm kháng sinh với 13 loại kháng sinh khác nhau bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch

tán trên thạch, chúng tôi đã lựa chọn được 243 chủng đảm bảo chất lượng để đưa

vào phân tích.

3.2.1.1. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng

kỹ thuật định tính

Bảng 3.17. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác

định bằng kỹ thuật định tính (n=243)

Kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S)

n n % n % %

Ampicillin 1 241 99,2 1 0,4 0,4

Cephalothin 1 231 95,1 11 0,4 4,5

Cefuroxime 0 228 93,8 15 0 6,2

51 95 39,1 97 21 39,9

Amoxicillin- clavulanicacid

Ceftazidime 4 217 89,3 22 1,6 9,1

Cefotaxime 1 226 93,0 22 0,4 9,1

Cefepime 7 211 86,8 25 2,9 10,3

Co-trimoxazone 5 176 72,4 62 2,1 25,5

Gentamicin 1 193 79,4 49 0,4 20,2

Amikacin 1 160 65,8 82 0,4 33,7

Tobramycin 13 187 77,0 43 5,3 17,7

Imipenem 0 1 0,4 0 242 99,6

Ciprofloxacin 26 35 14,4 182 10,7 74,9

Qua bảng trên ta thấy các chủng K. peumoniae phân lập ở đường hô hấp đã

kháng hầu hết với Ampicillin (99,2%), kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin thế

hệ 3 và 4 từ 86,8% - 93,0 %. Tỷ lệ kháng Imipenem rất thấp 0,4%.

3.2.1.2. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng

kỹ thuật định tính của nhóm NKHHCT :

Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng kỹ

thuật định tính của nhóm NKHHCTđược trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.18. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pneumoniae ở

nhóm NKHHCT (n=155)

Kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S) Kháng sinh n % % n % n

Ampicillin 153 98,7 0,6 1 0,6 1

Cephalothin 146 94,2 0,6 8 5,2 1

Cefuroxime 144 92,9 0 11 7,1 0

50 32,3 34 21,9 71 45,8 Amoxicillin- clavulanicacid

Ceftazidime 137 88,4 1,9 15 9,7 3

Cefotaxime 143 92,3 0,6 11 7,1 1

Cefepime 136 87,7 1,3 17 11,0 2

Co-trimoxazone 109 70,3 1,9 43 27,7 3

Gentamicin 114 73,5 0 41 26,5 0

Amikacin 96 61,9 0,6 58 37,4 1

Tobramycin 112 72.3 5,2 35 22,6 8

Imipenem 0 0 0 155 100 0

Ciprofloxacin 21 9,0 120 77,4 13,4 14

Bảng trên cho thấy các chủng K. pneumoniae phân lập ở đường hô hấp

đã kháng hầu hết với Ampicillin (98,7%), kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin

thế hệ 3 và 4 từ 87,7% - 92,3 %. Nhạy cảm 100% với Imipenem .

3.2.1.3. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng

kỹ thuật định tính của nhóm NKHHCT kết hợp

Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng kỹ thuật

định tính của nhóm NKHHCT kết hợp được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.19. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pneumoniae

ở nhóm NKHHCT kết hợp (n=88)

Kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S) Kháng sinh n % n % n %

Ampicillin 0 0 0 0 88 100

Cephalothin 0 0 3 3,4 85 96,6

Cefuroxime 0 0 4 4,5 84 95,5

17 19,3 26 29,5 45 51,1 Amoxicillin- clavulanicacid

Ceftazidime 1 1,1 7 8,0 80 90,9

Cefotaxime 0 0 5 5,7 83 94,3

Cefepime 5 5,7 7 8,0 76 86,4

2 2,3 19 21,6 67 76,1 Co- trimoxazone

Gentamicin 1 1,1 8 9,1 79 89,8

Amikacin 0 0 24 27,3 64 72,7

Tobramycin 5 5,7 8 9,1 75 85,2

Imipenem 0 0 87 98,9 1 1,1

Ciprofloxacin 62 70,5 14 15,9 12 13,6

Qua bảng trên ta thấy các chủng K. pneumoniae phân lập ở đường hô hấp

của nhóm NKHHCT kết hợp đã kháng hết với Ampicillin (100%), kháng kháng sinh nhóm Cephalosporin thế hệ 3 và 4 từ 86,4% đến 94,3 %. Với Imipenem kháng

1,1%. Tỷ lệ kháng kháng sinh của hai nhóm được thể hiện qua biểu đồ:

Biểu đồ 3.9. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pneumoniae ở

hai nhóm bệnh

Qua biểu đồ ta thấy, tỷ lệ kháng kháng sinh của K. pneumoniae cao hơn hẳn

ở nhóm NKHHCT kết hợp. Ở nhóm này đã kháng hết với Ampicilline (100%);

Cephalosporin thế hệ 1- cephalothin (96,6%); Cephalosporin thế hệ 2- cefuroxime

(95,5%); Cephalosporin thế hệ 3 và 4 từ 86,4% - 94,3 %; Nhóm Aminoglycozid

kháng thấp hơn từ 72,7% - 89,8%. Kháng thấp với ciprofloxacin (15,9%) và

imipenem (1,1%).

3.2.1.4. Tỷ lệ kháng với nhiều kháng sinh thử nghiệm

Biểu đồ 3.10. Tỷ lệ kháng với nhiều kháng sinh thử nghiệm (n=243)

Tỷ lệ kháng tối thiểu 9 kháng sinh chiếm đa số trong các chủng K.pnemoniae

phân lập được.

3.2.1.5. Tỷ lệ kháng nhiều loại kháng sinh ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT

kết hợp

Tỷ lệ kháng với 2 hay nhiều kháng sinh của hai nhóm được thể hiện qua biểu đồ:

Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ kháng nhiều loại kháng sinh ở hai nhóm NKHHCT và

NKHHCT kết hợp

Biểu đồ trên cho thấy, ở cả hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp tỷ lệ

các chủng K. pneumoniae kháng từ 9 đến 12 kháng sinh là chủ yếu chiếm 70,1% -

84,8% số chủng, trong đó nhóm NKHHCT kết hợp có tỷ lệ cao hơn; ngược lại tỷ lệ

chủng kháng 6-8 kháng sinh là 11,4% và 26%, nhóm NKHHCT chiếm tỷ lệ cao

hơn. Xuất hiện một số chủng kháng hết các kháng sinh thử nghiệm trong nhóm

NKHHCT kết hợp.

3.2.1.6. Các kiểu cách đề kháng kháng sinh gặp ở nhóm NKHHCT :

Bảng phân tích dưới đây thể hiện kiểu cách đề kháng kháng sinh với 13 loại

kháng sinh đã được thử nghiệm trong nghiên cứu của chủng vi khuẩn

K.pneumoniae phân lập thuộc nhóm NKHHCT :

Kiểu đề kháng

Số chủng

CXM,AM, AMC,CF

0,65

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS

3,23

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM

0,65

CXM,AM,AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM

10,32

CXM,AM,AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM,CIP

4,52

0,65

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,TM

0,65

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,AK,TM

5,81

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,GM,TM

0,65

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,TS

0,65

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,TM,CIP

0,65

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,TS

0,65

CXM,AM, AMC,CF,CTX,TS,TM,CIP

0,65

CXM,AM, AMC,CF,TS

0,65

CXM,AM, AMC,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,CIP

0,65

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP

2,58

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS

5,81

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM

2,58

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM

23,87

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM,CIP

5,81

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,TM

5,81

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,TM,CIP

0,65

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,TM

0,65

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,GM

2,58

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,AK,TM

9,03

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,TM

0,65

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,AK,TM

1,29

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TM

0,65

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,TS,GM,AK,TM

1,94

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,AK,TM

0,65

CXM,AM,CF,CTX,FEP,GM,AK,TM

0,65

CXM,AM,CF,CTX,TS

065

CXM,AM,CF,CTX,TS,CIP

0,65

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,GM,AK,TM

0,65

AM, AMC,CF

1,29

AM,CF,CAZ

0,65

AM,TS

1,29

3,23

Bảng 3.20. Các kiểu cách đề kháng KS ở nhóm NHKKCT (n=155)

Bảng trên cho thấy, ở nhóm NKHHCT các chủng K. pneumoniae phân lập được có tới 38 kiểu cách đề kháng khác nhau. Kiểu cách đề kháng thường gặp nhất là kháng với các kháng sinh CXM, AM, CF, CAZ, CTX, FEP, TS, GM, AK, TM (23,87%); CXM,AM,AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM (10,32%); CXM,

AM, CF, CAZ, CTX, FEP,GM,AK,TM (9,03%) và không có chủng nào kháng hết các kháng sinh thử nghiệm.

3.2.1.7. Các kiểu đề kháng kháng sinh thử nghiệm ở nhóm NKHHCT kết hợp

Bảng phân tích dưới đây thể hiện kiểu cách đề kháng kháng sinh với 13 loại

kháng sinh đã được thử nghiệm trong nghiên cứu của chủng vi khuẩn K.pneumoniae phân lập thuộc nhóm chẩn đoán khác.

Bảng 3.21. Các kiểu đề kháng kháng sinh thử nghiệm ở nhóm chẩn đoán khác

Kiểu đề kháng

Số chủng %

STT

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP

2,27

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS

2,27

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM

2,27

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM

17,05

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM,IPM,CIP

2,27

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM,CIP

12,50

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,TM,CIP

2,27

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,TM

2,27

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,AK,TM

11,36

10 CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,TM

2,27

11 CXM,AM, AMC,CF,TS,GM

2,27

12 CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM

3,41

13 CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM

18,18

14 CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,TM

2,27

15 CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,TM,CIP

1,14

16 CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP, GM, AK,TM

3,41

17 CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP, GM,TM

1,14

18 CXM,AM,CF,CAZ,CTX,TS, GM, AK,TM

3,41

19 CXM,AM,CF,CAZ,CTX, GM, AK,TM

1,14

20 CXM,AM,CF,CTX,FEP,TS, GM, AK,TM

1,14

21 CXM,AM,CF,CTX,FEP,TS, GM,TM

1,14

22 AM

2,27

23 AM,CF,TS

1,14

24 AM,TS

1,14

(n=88)

Qua bảng ta thấy, ở nhóm NKHH kết hợp các chủng K. pneumoniae phân lập

được 24 kiểu đề kháng. Kiểu đề kháng thường gặp nhất là kháng với các kháng sinh

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM (18,8%); CXM,AM, AMC, CF,

CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM(17,05%); CXM,AM, AMC, CF, CAZ, CTX, FEP,

TS,GM,AK,TM,CIP(12,5%); CXM,AM, AMC, CF, CAZ, CTX, FEP, GM, AK,

TM (11,36) và có chủng kháng hết các kháng sinh thử nghiệm.

3.2.1.8. Tỷ lệ K. pneumoniae đa kháng trên bệnh nhi tử vong của hai nhóm

Biểu đồ 3.12. Tỷ lệ K. pneumoniae kháng với nhiều loại kháng sinh

ở bệnh nhi tử vong của hai nhóm bệnh

Qua biểu đồ ta thấy, tỷ lệ K. pneumoniae kháng ≥ 9 kháng sinh ở bệnh nhi

tử vong chiếm tỷ lệ cao hơn K. pneumoniae kháng < 9 kháng sinh. Nhóm NKHHCT

kết hợp cao hơn hẳn nhóm NKHHCT có ý nghĩa thống kê (p< 0,05).

3.2.3. Xác định khả năng sinh enzym β-lactamase phổ rộng của các chủng K.

pnemoniae

Bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch, với sự sắp xếp

các khoanh giấy của các kháng sinh nhóm β-lactamin đứng gần khoanh giấy

Augmentin (Amoxicillin + Acide clavulanic) để có các hình ảnh hiệp đồng, nghiên

cứu của chúng tôi đã xác định được các chủng có khả năng sinh men β-lactamase

phổ rộng (ESBLs) trên tổng số 267 chủng K. pneumoniae spp.

3.2.3.1. Tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pnemoniae ở cả hai nhóm

Bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch, với sự sắp xếp

các khoanh giấy của các kháng sinh nhóm β-lactamin đứng gần khoanh giấy

Augmentin (Amoxicillin + Acide clavulanic) để có các hình ảnh hiệp đồng, nghiên

cứu này đã xác định được 152 chủng có khả năng sinh enzym β-lactamase phổ rộng

Biểu đồ 3.13.Tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pnemoniae phân lập

được

trên tổng số 267 chủng K. pneumoniae spp., chiếm tỷ lệ 56,9%

3.2.3.2.Sự phân bố các chủng K. peumoniae sinh ESBLs phân lập được ở các

Bảng 3.22. Tỷ lệ sinh ESBLs của K. pnemoniae ở các khoa

khoa

ESBLs Số chủng thử Số chủng Tỉ lệ % p Khoa nghiệm (n) ESBLs (+)

Hồi sức cấp cứu 41 24 58,5

Hồi sức ngoại 39 28 71,8

Sơ sinh 106 55 51,9 p< 0,05

Hô hấp 81 45 55,6

Tổng số 267 152 56,9

Tỷ lệ chủng sinh ESBLs phân lập được ở các khoa có sự thay đổi từ

51,9%-71,8 %, đặc biệt tỷ lệ ở khoa Hồi sức ngoại rất cao 71,8% (p <0,05).

3.2.3.2. Tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pnemoniae nghiên cứu

Bảng 3.23.Tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pneumoniae ở hai nhóm

NKHHCT và NKHHCT kết hợp

Số chủng Nhóm bệnh ESBLs(+) % p K. pneumoniae (+)

NKHHCT 172 98 57,0

NKHHCT kết hợp 95 54 56,8 >0,05

Tổng 267 152 56,9

Bảng trên cho thấy tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pneumoniae ở cả hai

nhóm là 56,9%; ở nhóm NKHHCT, tỷ lệ chủng sinh ESBLs là 57,0%; ở nhóm

NKHHCT kết hợp, tỷ lệ chủng sinh ESBLs là 56,8%. Sự khác biệt tỷ lệ sinh ESBLs

của các nhóm không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

Sự phân bố chủng K. pneumoniae sinh ESBLs ở các khoa lâm sàng được

phân tích trong các bảng sau

Bảng 3.24. Tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pneumoniae

ở nhóm NKHHCT theo khoa

Khoa p Số chủng K. pneumoniae (+) ESBLs (+) Tỷ lệ %

81 Hô hấp (1) 55,6 45

74 Sơ sinh (2) 56,8 42

17 Hồi sức cấp cứu (3) 64,7 11 >0,05

0 Hồi sức ngoại (4) 0 0

172 Tổng 57,0 98

Bảng trên cho thấy: tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pneumoniae ở nhóm

NKHHCT thu được ở khoa Hô hấp là 55,6%, khoa Sơ sinh là 56,8% và khoa Hồi

sức cấp cứu là 64,7%. Sự khác biệt tỷ lệ sinh ESBLs của các khoa không có ý nghĩa

thống kê với p>0,05.

Bảng 3.25. Tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pneumoniae

ở nhóm NKHHCT kết hợp theo khoa

Khoa p ESBLs (+) Tỷ lệ % Số chủng K. pneumoniae (+)

32 Sơ sinh (2) 13 40,6

24 Hồi sức cấp cứu (3) 13 54,2

39 Hồi sức ngoại(4) 28 71,8 p 2-3 >0,05 p 2-4 <0,01 p 3-4 >0,05

95 Tổng 54 56,8

Bảng trên cho thấy: tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pneumoniae ở nhóm

NKHHCT kết hợp thu được ở khoa Sơ sinh là 40,6%, khoa Hồi sức cấp cứu là

54,2% và khoa Hồi sức ngoại là 71,8%. Sự khác biệt tỷ lệ sinh ESBLs của các khoa

không có ý nghĩa thống kê với p>0,05; Tuy nhiên sự khác biệt giữa khoa Sơ sinh và

khoa Hồi sức ngoại là có ý nghĩa thống kê với p<0,01.

Biểu đồ 3.14. Tỷ lệ chủng K. pneumoniae sinh ESBLs ở hai nhóm

Qua biểu đồ ta thấy tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pneumoniae phân lập

được ở khoa Hồi sức ngoại là cao nhất trong các khoa (p<0,05).

3.2.2. Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng K. pnemoniae xác định bằng kỹ

thuật định lượng MIC

Sau khi xác định tính nhạy cảm kháng sinh của 267 chủng K. pnemoniae

bằng kỹ thuật định tính, chúng tôi đã lựa chọn 60 chủng có enzym β-lactamase phổ

rộng (ESBL(+)) để đưa vào nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các

kháng sinh nhóm β-lactamin, đánh giá mức độ đề kháng trên những chủng này.

Bảng 3.26: Nồng độ kháng sinh nhóm β-lactam

ức chế tối thiểu 50% và 90% chủng K. Peumoniae

Nồng độ ức chế (µg/ml) Kháng sinh Điểm gãy MIC (Theo chuẩn CLSI - µg/ml)) Tên kháng sinh viết tắt MIC50 MIC90 Nhạy cảm (S) Kháng(R) Cefoxitin FOX 4 >4 ≤8 ≥32

Cefoperazon CFP ≤8 ≥32 >128 >128

Astreonam AZT 32 >64 ≤4 ≥16

Cefotaxim CTX ≤1 ≥4 128 >128

CTX/CLV 2 >16 ≤1 ≥4 Cefotaxim/Acid clavulanic Ceftazidim CAZ 16 >16 ≤4 ≥16

1 >1 CAZ/CLV ≤4 ≥16

Ceftazidim/Acid clavulanic Piperacillin PIP ≤16 ≥128 >256 >256

PIP/CLV ≤16 ≥128 >256 >256

Piperacillin/Acid clavulanic Cefepim PEP 16 >16 ≤8 ≥32

Imipenem IPM 0,12 >0,12 ≤4 ≥16

Kết quả trên cho thấy: các chủng Klebsiella pneumoniae có ESBL (+) có

mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactamin rất cao: nồng độ ức chế tối thiểu 50%

và 90% số chủng của một số kháng sinh đã vượt lên trên giới hạn điểm gẫy MIC

theo chuẩn CLSI khá cao: Piperacillin và Piperacillin/Acid clavulanic >256 µg/ml;

Cefoperazon >128 µg/ml.

Mức độ kháng nhóm Beta lactamin của chủng K. pneumoniae ESBL (+)

300

250

200

MIC50

150

MIC90

100

Nhạy cảm (S) Kháng (R)

A Z T

IP M

F O X

C F P

P E P

PIP/C L V PIP

C T X C T X/C L V

C A Z/C L V C A Z

Biểu đồ 3.15: Mức độ đề kháng kháng sinh của 60 chủng K. peumoniae

Hình 3.1. Hình ảnh kết quả MIC trên môi trường đặc

3.3. Xác định tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh

Cephalosporin thế hệ 3 và quinolon nằm trên plasmid

3.3.1. Xác định tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng

sinh Cephalosporin thế hệ 3 nằm trên plasmid

Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), với các cặp mồi đã thiết kế nhằm mục

đích xác định các gen mã hóa sự kháng kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 nằm trên

plasmid: CTX-M-3, CTX-M-9, SHV và TEM, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu

trên 107 chủng K. peumoniae có ESBLs.

a) b)

Hình 3.2. Kết quả PCR xác định sự có mặt

của gen CTX-M 9 (a) và TEM(b)

M: Mẫu chuẩn (ADN 100bp)

1-7: 1- chứng dương; 2-chứng âm; 3-7: các chủng nghiên cứu (4690d, 4827d,

6022d, 6035d, 154d).

1-16: 1- chứng dương; 2-chứng âm;3-16: các chủng nghiên cứu (3499d, 3611d,

3700d, 3778d, 3794d, 3866d, 3870d, 3995d, 4105d, 4109d, 5774d, 5887d,

5892d, 6022d).

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ chủng K. peumoniae mang

gen mã hóa sự kháng C3G nằm trên plasmid phát hiện bằng kỹ thuật PCR khá cao:

Bảng 3.27. Tỉ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng C3G

nằm trên plasmid (n=107)

Gen mã hóa

CTX-M-3 Số chủng mang gen (n) 33 Tỉ lệ (%) 30,8

CTX-M-9 79 73,8

SHV 95 88,8

TEM 86 80,4

99 92,5 CTX-M (CTX-M-3+ CTX-M-9)

Tỷ lệ chủng mang gen mã hóa sự kháng C3G nằm trên plasmid khá cao,

đặc biệt là CTX-M nói chung là 92,5%; SHV(88,8%) và thấp nhất là CTX-M 3

Tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang gen mã hóa sự kháng nhóm Beta-lactamin

92.5

88.8

80.4

73.8

30.8

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

CTX-M-3

CTX-M-9

SHV

TEM

CTX-M-3+ CTX-M-9

CTX-M-3 CTX-M-9 SHV TEM CTX-M-3+ CTX-M-9

(30,8%).

Biểu đồ 3.16. Tỉ lệ chủng mang gen mã hóa sự kháng C3G

100

3.3.2. Xác định tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng

sinh nhóm Quinolon (qnr) nằm trên plasmid

Bằng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR), với các cặp mồi đã thiết kế nhằm mục

đích xác định các gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm Quinolon nằm trên

plasmid: qnrA, qnrB, qnrS. Chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu trên 107 chủng

K.pneumoniae. Kết quả thu được có 41/107 chủng có mang gen mã hóa sự kháng

Hình 3.3. Kết quả PCR xác định sự có mặt của gen

kháng qnr nằm trên plasmid

kháng sinh nhóm Quinolon trên plasmid, chiếm tỷ lệ 38,3%.

Mẫu chuẩn (ADN 100bp) Chứng dương qnrA; qnr B; qnr S

Chủng PCR (+) : 3700d, 4336d, 4580d, , 4884d, 565d, 1307d. M: 1-3: 4,5,7,10,11,14,15: Chủng PCR (-): 3487d, 3611d, 3995d, 4619d, 4845d, 1231d, 1260d 6,8,912,13,16: Bảng 3.28. Phân bố các chủng mang gen kháng quinolon nằm trên plasmide

(n=41)

p Gen mã hóa Số lượng (n) Tỉ lệ (%)

1 2,4 qnrA

7 17 qnrB P< 0,05 33 qnrS 80,6

41 Tổng 100

101

Kết quả cho thấy tỷ lệ chủng mang gen kháng Quinolon nằm trên plasmid

trong nghiên cứu này khá cao. Tất cả 107 chủng đưa vào nghiên cứu về gen mã hóa

sự kháng kháng sinh đều đã có chứa các gen mã hóa sự kháng C3G như kết quả

phần trên, nhưng kết quả này cho thấy đồng thời có 38,3% số chủng mang gen mã

hóa kháng kháng sinh nhóm Quinolon (qnr); Trong đó chủ yếu là qnrS (80,6 %),

Phân bố chủng K. pneumoniae mang gen mã hóa sự kháng nhóm Quinolon trên plasmid

2.4

80.6

qnrA

qnrB

qnrS

qnrB (17 %) và gen qnrA chiếm tỉ lệ rất nhỏ (2,4 %).

Biểu đồ 3.17. Phân bố các chủng mang gen kháng quinolon

3.3.3. Tỷ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr

Tổng hợp hai phần nghiên cứu trên, chúng tôi thấy, có một tỷ lệ khá cao

chủng mang đồng thời nhiều gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm C3G và nhóm Quinolon nằm trên plasmid:

Bảng 3.29. Tỉ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr

Các gen mã hóa Tỉ lệ % p Số lượng (n = 107)

qnr+CTX-M+SHV+TEM 24 22,4

p< 0,05 CTX-M+SHV+TEM 91 85

CTX-M-3+ CTX-M-9 11 10,3

102

CTX-M-3+CTX-9+SHV+TEM 9 8,4

Kết quả trên cho thấy: tỷ lệ các chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa

kháng C3G là rất cao 85%, chủng đồng thời mang gen CTX-M-3 và CTX-M-9 là

10,3%, chủng mang tất cả các gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G là 8,4%.

Trong số các chủng đồng thời mang nhiều gen mã hóa kháng kháng sinh nhóm C3G

Tỷ lệ chủng K. pneumoniae mang nhiều gen mã hóa kháng C3G và quinolon

8.4

22.4

10.3

qnr+CTX-M+SHV+TEM

CTX-M+SHV+TEM

CTX-M-3+ CTX-M-9

CTX-M-3+CTX-9+SHV+TEM

có 22,4% chủng mang cả gen mã hóa sự kháng sinh nhóm Quinolon(qnr).

Biểu đồ 3.18. Tỉ lệ chủng mang đồng thời nhiều gen kháng C3G và qnr

3.3.4. Khẳng định các gen mã hóa kháng kháng sinh đã được phát hiện nằm

trên plasmid bằng kỹ thuật Southern Blot.

Với điều kiện cho phép về kinh phí, bằng kỹ thuật Southern Blot, với enzym

giới hạn S1, để cắt đặc hiệu trên ADN plasmid, chúng tôi đã tiến hành xác định các gen

mã hóa được phát hiện nằm trên plasmid của 46 chủng.

103

a) b)

Hình 3.4.a và 3.4.b

3.4.a - Sản phẩm PCR đã được enzym giới hạn S1 phát hiện bằng điện di xung

trường

M: Mẫu chuẩn ADN

1 – 19: 3487d, 3611d, 5233d, 3870d, 4690d, 5319d, 3431d, 5022d, 6035d, 861d,

1133d, 1307d, 1707d, 1713d, 2166d, 2371d, 2376d, 2523d, 276d.

3.4.b - Kết quả của kỹ thuật Southern Blot: làm xuất hiện các mảnh cắt của

ADN plasmid .

7- 19: 3431d, 5022d, 6035d, 861d, 1133d, 1307d, 1707d, 1713d, 2166d, 2371d,

2376d, 2523d, 276d được phát hiện bằng kỹ thuật Southern Blot

Hình ảnh các băng hiện rõ trên ảnh 17a và 17b, cho biết các ADN của đoạn gen

khuếch đại bằng kỹ thuật PCR đã được cắt bởi các enzym đặc hiệu cho ADN

plasmid là S1, xác định chắc chắn các gen này nằm trên plasmid.

104

Chương 4

BÀN LUẬN

4.1. Đặc điểm phân bố các chủng vi khuẩn gây bệnh trong nhiễm khuẩn hô hấp

ở bệnh nhi 0 đến 6 tuổi và một số yếu tố liên quan

Phương pháp thu thập mẫu trong đề tài này là thu thập mẫu thuận tiện, chính

vì vậy mà nó mang những ưu điểm và những hạn chế nhất định:

- Ưu điểm: Mẫu được chỉ định làm theo thường quy nên quy trình lấy mẫu,

vận chuyển, bàn giao mẫu cho phòng xét nghiệm và thực hiện xét nghiệm được làm

theo hướng dẫn thường quy của bệnh viện tiết kiệm nhiều công sức cũng như thời

gian và kinh phí cho nghiên cứu. Thời gian thu thập mẫu kéo dài cho tới khi đủ cỡ

mẫu nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu trong một năm thì đủ số lượng

mẫu dự kiến và thời gian cho phân tích một số yếu tố liên quan.

- Hạn chế: Thu thập mẫu thuận tiện theo thường quy do rất nhiều người thực

hiện kỹ thuật, kỹ năng và độ thành thạo rất khác nhau sẽ không kiểm soát được kỹ

thuật thu thập mẫu và thời gian vận chuyển mẫu có đảm bảo hay không, điều đó có

ảnh hưởng tới tỷ lệ phân lập tác nhân gây bệnh và kết quả của nghiên cứu về mặt

tác nhân. Đây cũng chính là lý do mà nghiên cứu của chúng tôi chỉ phân lập được

1.181 mẫu dương tính với vi khuẩn trong số 3.567 mẫu.

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập tác nhân trong đề tài là phương pháp cấy

đếm. Đây là phương pháp tối ưu cho chẩn đoán các căn nguyên gây nhiễm khuẩn

đường hô hấp cấp tính. Sở dĩ như vậy là vì đường hô hấp mở thông với bên ngoài

nên đường hô hấp sẽ có rất nhiều các tác nhân gây bệnh bình thường là sống cộng

sinh, khi có điều kiện thuận lợi trở thành tác nhân gây bệnh thể hiện bằng số lượng

có mặt của tác nhân trong đường hô hấp.

Kỹ thuật định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ được thực hiện ở phòng

xét nghiệm hiện đại của Bệnh viện Nhi trung ương và kỹ thuật xác định ESBL, kỹ

thuật xác định gen kháng kháng sinh tại Phòng nghiên cứu kháng thuốc của Khoa vi

sinh tại Bệnh viện Several – Hàn quốc theo tiêu chuẩn của Viện tiêu chuẩn xét

nghiệm lâm sàng quốc tế (CLSI) nên kết quả đảm bảo độ tin cậy cao [85].

105

Kỹ thuật xác định gene kháng kháng sinh của vi khuẩn được thực hiện tại

phòng xét nghiệm nghiên cứu kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn tại Bệnh viện

Sevral thuộc đại học tổng hợp Yonsei Hàn Quốc - là một trong những bệnh viện

danh tiếng.

Sự phân bố căn nguyên nhiễm khuẩn đường hô hấp ở bệnh viện có những

đặc điểm khác với nhiễm khuẩn đường hô hấp ở cộng đồng, đặc biệt ở các khoa hồi

sức cấp cứu, ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, đồng thời có sự khác nhau giữa nhóm bệnh

nhân vào viện ở nhóm NKHHCT với nhóm bệnh nhân ở nhóm NKHHCT kết hợp.

4.1.1. Sự phân bố mẫu bệnh phẩm nhiễm khuẩn hô hấp theo nhóm bệnh

và theo khoa lâm sàng.

Từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010, có tổng số 3.567 mẫu bệnh phẩm đường

hô hấp được nuôi cấy xác định tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính ở

các khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp đã được đưa vào

nghiên cứu. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này được thu thập từ bệnh nhi

dưới 6 tuổi có 1.181 mẫu bệnh phẩm phân lập được vi khuẩn trong 3.567 mẫu bệnh

phẩm đường hô hấp, cho thấy tỷ lệ nuôi cấy dương tính với các vi khuẩn gây bệnh

là 33,1%, trong đó có 87 mẫu có hai loài chiếm 7,4%.

Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này thuộc hai nhóm bệnh nhân:

- Nhóm vào viện điều trị với chẩn đoán ban đầu là nhiễm khuẩn đường hô

hấp cấp tính - gọi là nhóm NKHHCT (gồm những bệnh nhân vào với chẩn đoán

NKHHCT ở các khoa Hồi sức cấp cứu, Sơ sinh và khoa Hô hấp) có 1.909 mẫu bệnh

phẩm.

- Nhóm vào viện điều trị với chẩn đoán ban đầu không phải là nhiễm khuẩn

đường hô hấp, mà NKHHCT là bệnh đi kèm hoặc xuất hiện sau thời gian nằm điều

trị - gọi là NKHHCT kết hợp (gồm những bệnh nhân vào điều trị ở các khoa Hồi

sức cấp cứu, Sơ sinh và Hồi sức ngoại) có 1.658 mẫu bệnh phẩm.

Tỷ lệ dương tính ở bảng 3.2 cho thấy, tỷ lệ nuôi cấy dương tính chung là

37,4% ở nhóm bệnh NKHHCT và 28,1% ở nhóm bệnh NKHHCT kết hợp. Cao nhất

ở khoa sơ sinh (nhóm NKHHCT là 48,8% và nhóm NKHHCT kết hợp là 54,7%) ,

106

sau đó là khoa hô hấp (37,5%) và thấp nhất là khoa HSCC (21,1% và 22,2%). Như

vậy, ta thấy tỷ lệ dương tính chung ở nhóm nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính cao hơn

nhóm NKHHCT kết hợp và tỷ lệ cao nhất là khoa sơ sinh. Sự khác biệt này có ý

nghĩa thống kê với p<0,001. Kết quả của chúng tôi tương tự như nghiên cứu khác

về tỷ lệ cao các nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính thường gặp ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

[4].

Ở biểu đồ 3.3 tỷ lệ nuôi cấy dương tính 2 loài vi khuẩn/1 bệnh phẩm ở nhóm

NKHHCT là 7% và ở nhóm NKHHCT kết hợp là 7,9%. Không có sự khác biệt về

tỷ lệ nuôi cấy dương tính 2 loài/ 1 bệnh phẩm thu được ở bệnh nhân NKHHCT và

NKHHCT kết hợp với p>0,05.

Juhi Taneja và cộng sự nghiên cứu tại Ấn Độ trên trẻ ở độ tuổi trung bình dưới

6 tuổi có viêm cấp đường hô hấp dưới với tỷ lệ dương tính là 58,6%, trong đó 8,6%

phân lập có 2 loài [66]; Nghiên cứu của các tác giả Brazil về tỷ lệ và các yếu tố phơi

nhiễm viêm đường hô hấp dưới ở trẻ dưới 5 tuổi cho thấy tỷ lệ trẻ nhiễm khuẩn hô hấp

dưới ở các bệnh nhi là 23,9% [104]. Filiz Günseren và cộng sự cho biết tỷ lệ này ở

Thổ Nhĩ Kỳ là 38,8% [51]; Nghiên cứu của các tác giả Trung quốc về tỷ lệ viêm đường

hô hấp dưới - 29,7%; Hàn Quốc tỷ lệ viêm đường hô hấp - 25,3%. Như vậy, tỷ lệ

nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới ở trẻ em dao động khá nhiều; trong đó nghiên cứu của

các tác giả Ấn độ và Thổ Nhĩ Kỳ cao hơn của chúng tôi còn nghiên cứu của chúng tôi

cao hơn của Brazil.

Từ tháng 2/2002 - 6/2003 Ngô Thị Thi và cộng sự đã nghiên cứu căn nguyên

nhiễm khuẩn từ dịch hút phế quản trẻ em ở bệnh viện Nhi Trung ương cho thấy tỷ

lệ dương tính là 69,6% [11]; Nguyễn Văn Bàng - Bệnh viện Bạch Mai nghiên cứu

trên bệnh nhi 2 tháng đến 5 tuổi viêm phổi điều trị ở khoa Nhi (2009) với tỷ lệ

31,5% [20]; Cao Minh Nga - Bệnh viện Thống Nhất năm 2006 (25,7%) [5]. Nghiên

cứu của chúng tôi tỷ lệ nhiễm khuẩn hô hấp ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương

năm 2009-2010 chỉ còn 33,1%, giảm hơn một nửa so với nghiên cứu của Ngô Thị

Thi; Như vậy cho thấy sự khác biệt này có thể là do thực hiện vô trùng trong chăm

sóc tại các khoa đặc biệt là các khoa hồi sức đã được cải thiện đáng kể trong nhiều

107

năm qua. Bên cạnh đó tỉ lệ phân lập được 2 loài vi khuẩn trên 1 bệnh phẩm của Ngô

Thị Thi là (1,4), của chúng tôi cao hơn (7,4). Nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ

tương đương Nguyễn Văn Bàng trong cùng thời điểm, cao hơn nghiên cứu của Cao

Minh Nga.

4.1.2. Sự phân bố của các tác nhân vi khuẩn phân lập được

Qua bảng 3.3 ta thấy đứng đầu là Klebsiella pneumoniae (22,61%) sau đó là

Acinetobacter spp. (19,9%), P. aeruginosa (18,37%). Các căn nguyên thường gặp ở

cộng đồng không cao S. pneumoniae (5,08%), H. influenzae(5,33%).

Qua bảng 3.4 ta thấy, tỷ lệ phân lập được Klebsiella pneumoniae là cao nhất

(24,1%) ở nhóm bệnh NKHHCT và Acinetobacter spp. (29,8%) ở nhóm bệnh

NKHHCT kết hợp, sau đó là P. aeruginosa (17,4%) ở nhóm bệnh NKHHCT và

Klebsiella pneumonia (20,3%) ở nhóm bệnh NKHHCT kết hợp. Các cầu trùng gram

dương có tỷ lệ từ 5,0% đến 7,8%. Có sự khác biệt của các vi khuẩn phân lập được ở

nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp như Acinetobacter spp. (13,4 và 29,8%); H.

influenzae (7,4 và 2,1%); S. pneumoniae (6,7% và 2,6%). Sự khác biệt này có ý

nghĩa thống kê với p<0,02, phù hợp với thống kê về tác nhân gây nhiễm khuẩn

đường hô hấp ở cộng đồng và ở bệnh viện (NKHHCT có bao gồm các bệnh nhân

nhiễm khuẩn từ cộng đồng). Klebsiella pneumonia và các vi khuẩn gram âm khác

vẫn là vi khuẩn đứng hàng đầu ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp có thể

vì bệnh nhân là trẻ nhỏ và đã được điều trị ở các tuyến dưới [40].

Tác giả Taneja và cộng sự - Ấn Độ nghiên cứu viêm phổi ở trẻ em dưới 5 tuổi

có tỷ lệ K. pneumoniae 32,2%, S. pneumoniae 10%, E. coli 10%, P. aeruginosa

5,7%, S. aureus 2,8% và H.influenzae 1,4% [103]. Nghiên cứu của tác giả F.

Günseren và cộng sự - Thổ Nhĩ Kỳ nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn gram âm ở khoa

Hồi sức cấp cứu của 9 bệnh viện ở Thổ Nhĩ Kỳ cho thấy căn nguyên hàng đầu

thường gặp là các loài gram âm 26,8%. Đứng đầu là P. aeruginosa 22,1%, loài

Klebsiella spp trong đó K. peumoniae chiếm 66%; E.coli, Acinetobacter spp và

Enterobacter spp 26,2% [51].

108

Tác giả Ngô Thị Thi và cộng sự ở Bệnh viện Nhi Trung ương nghiên cứu

thấy các tác nhân vi khuẩn phân lập được từ dịch hút phế quản phân bố chủ yếu là

các trực khuẩn gram âm: Klebsiella spp: 42,12%; P.aeruginosa: 26,92% E.coli:

14,56%, Acinetobacter: 1,28%, các trực khuẩn gram âm khác: 6,5%; Nhóm cầu

khuẩn gr (+): S. viridans : 4,94%, S. aureus: 2,29% , S. pneumoniae: 0,36%; Nhóm

cầu khuẩn gr (-): N. meningitidis: 0,09%, M. catarrhalis: 0,36%. Qua đó, nghiên

cứu của chúng tôi, của tác giả Ngô Thị Thi và các tác giả Ấn Độ đều cho thấy căn

nguyên hàng đầu là Klebsiella spp và P. aeruginosa. Trong nghiên cứu của chúng

tôi, sau K. pneumoniae, Acinetobacter chiếm tỷ lệ đáng quan tâm tới 19,9% cao hơn

rất nhiều nghiên cứu của các tác giả khác; tỷ lệ Klebsiella spp. trong nghiên cứu của

Ngô Thị Thi và cộng sự thấp hơn của chúng tôi rất nhiều.

Tỷ lệ phân bố các vi khuẩn phân lập được trong các nghiên cứu đều thấy nổi

trội chiếm ưu thế là các trực khuẩn Gram âm.

Qua biểu đồ 3.4 cho thấy chủ yếu các căn nguyên vi khuẩn phân lập được

chung cho cả hai nhóm là trực khuẩn gram âm chiếm 80,8%, cầu khuẩn gram dương

chỉ có 18%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p< 0,5. Kết quả nghiên cứu

với tỷ lệ trực khuẩn gram âm chiếm đa số là dấu hiệu cảnh báo về khả năng kháng

thuốc, đặc biệt là kháng thuốc lan truyền plasmid là rất lớn. Nguy cơ thất bại điều trị

trong nhóm này là rất cao [25].

Tại biểu đồ 3.5, ta thấy trực khuẩn gram âm chiếm đa số ở cả 2 nhóm (77,5-

84,9%), trong đó nhóm NKHHCT kết hợp cao hơn nhóm NKHHCT. Tỷ lệ cầu

trùng ở nhóm NKHHCT cao hơn nhóm NKHHCT kết hợp. Sự khác biệt này có ý

nghĩa thống kê, với p<0,01. Qua các biểu đồ, một lần nữa cho thấy tỷ lệ phân bố các

vi khuẩn phân lập được trong các nghiên cứu đều nổi trội chiếm ưu thế là các trực

khuẩn Gram âm. Ở đây ta cũng thấy tỷ lệ cầu trùng ở nhóm NKHHCT (bao gồm cả

những bệnh nhân nhiễm khuẩn hô hấp ở cộng đồng) cao hơn nhóm NKHHCT kết

hợp. Điều đó cho thấy sự phù hợp về cơ cấu căn nguyên mà các nghiên cứu đã

thống kê.

109

4.1.3. Tỷ lệ phân bố các chủng K. pnemoniae phân lập được

Klebsiella spp. là vi khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều bởi khả năng đa

kháng kháng sinh, lan truyền thành dịch đa kháng và siêu kháng kháng sinh. Điều trị

nhiễm khuẩn Klebsiella spp. khó khăn và là nguyên nhân tử vong của nhiều ca bệnh [1],

[19], [39], [66].

Các nghiên cứu trên cho thấy tỷ lệ phân lập Klebsiella spp. ở bệnh viện là

khác nhau tùy từng quốc gia thay đổi từ 10,2% - 32,2%. Phần lớn gặp ở trẻ sơ sinh

non yếu và trẻ nhỏ. Chúng là chủng vi khuẩn quan trọng có khả năng kháng lại

nhiều kháng sinh và gây bùng phát dịch trong bệnh viện [49], [66], [110].

Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae phân lập được ở các khoa và theo tuổi được

trình bày trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ các bệnh nhi nhiễm khuẩn

đường hô hấp do K. peumoniae thường gặp ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ dưới 1 tuổi là

chủ yếu (cao nhất ở các khoa trong nghiên cứu là khoa Sơ sinh 39,7%; 92,5% ở trẻ

sơ sinh và trẻ nhỏ dưới 1 tuổi). Kết quả này phù hợp với tính chất gây bệnh của K.

peumoniae nói riêng và giống Klebsiella nói chung, chúng thường gây bệnh ở trẻ sơ

sinh, trẻ nhỏ, người mắc bệnh mãn tính, người già yếu và những bệnh nhân nằm

điều trị cấp cứu kéo dài [13], [40]. Kết quả này cũng có kết luận giống với kết quả

nghiên cứu các chủng Klebsiella spp. phân lập từ các bệnh phẩm là dịch đường hô

hấp) ở bệnh viện Nhi Trung ương (BVNTƯ), từ tháng 2/2007 – tháng 8/2007 với tỷ

lệ 43,3%, tỷ lệ ở nghiên cứu này cao hơn rất nhiều (92,5%). Có lẽ sự khác biệt này

là do đối tượng nghiên cứu khác nhau (trong nghiên cứu năm 2007, đối tượng là tất

cả các bệnh nhân khám và điều trị tại BVNTƯ; còn trong nghiên cứu này đối tượng

là bệnh nhi 0-6 tuổi) [4].

Bảng 3.6 cho thấy, tỷ lệ nhiễm K. pneumoniae của trẻ trong độ tuổi sơ sinh ở

nhóm NKHHCT là 26,6%; Của trẻ dưới 1 tuổi là 22,7% và trẻ 1 - 6 tuổi là 15,8%.

Các tỷ lệ này không có sự khác biệt với p>0,05. Bảng 3.7, tỷ lệ nhiễm

K.pneumoniae của trẻ trong độ tuổi Sơ sinh ở nhóm NKHHCT kết hợp là 21,6%; trẻ

dưới 1 tuổi là 20,3% và trẻ 1 đến 6 tuổi là 8,3%. Các tỷ lệ này không có sự khác biệt

với p>0,05.

110

Nghiên cứu của chúng tôi không thấy có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm

K.pneumoniae của trẻ trong các độ tuổi giữa trẻ nam và nữ. Tỷ lệ nhiễm

K.pneumoniae ở các khoa ở cả tổng số phân lập cũng như các nhóm thể hiện ở bảng

3.11 tỷ lệ các chủng phân lập được ở Khoa Sơ sinh là cao nhất chiếm 13,7%, tiếp

đến Khoa Hô hấp 9,0% và thấp nhất là Khoa Hồi sức ngoại 3,9%. Sự khác biệt này

có ý nghĩa thống kê, với p< 0,05; Bảng 3.12 trong nhóm NKHHCT tỷ lệ phân lập

được chủng K. pneumoniae ở Khoa Sơ sinh là cao nhất chiếm 13,0%, tiếp đến

Khoa Hô hấp 8,7% và thấp nhất là Khoa Hồi sức cấp cứu 4,2%. Sự khác biệt này có

ý nghĩa thống kê, với p< 0,01; Bảng 3.13 nhóm NKHHCT kết hợp tỷ lệ phân lập

được chủng K. pneumoniae ở Khoa Sơ sinh là cao nhất chiếm 14,3%, tiếp đến Khoa

Hồi sức cấp cứu 4,2% và Khoa Hồi sức ngoại 4,5%. Sự khác biệt giữa khoa sơ sinh

và các Khoa Hồi sức cấp cứu là có ý nghĩa thống kê, với p< 0,01. Sự khác biệt giữa

Khoa Hồi sức cấp cứu và Hồi sức ngoại không có ý nghĩa thống kê, với p>0,05. Tất

cả các bảng đều nổi trội là Khoa Sơ sinh đúng như đã bàn luận ở trên.

Nghiên cứu của chúng tôi không thấy có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm K.

pneumoniae phân lập được ở các nhóm tuổi theo mùa nói chung cũng như các nhóm

NKHHCT trừ NKHHCT kết hợp tỷ lệ các chủng K pneumoniae phân lập được ở

bệnh nhi sơ sinh cao nhất vào mùa thu (69,4%), mùa hạ (58,6%), mùa xuân (45,5%)

và mùa đông (21,1%). Ở bệnh nhi lớn hơn độ tuổi sơ sinh tỷ lệ này cao nhất vào

mùa đông (79%), sau đó là mùa xuân (54,5%), mùa hạ (41,4%) và mùa thu (30,6%).

Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,01. Kết quả phân bố các chủng

K.pneumoniae – tác nhân chính gây NKHHCT theo mùa, chủ yếu vào mùa đông-

xuân thường gặp không chỉ ở nhóm tuổi nhỏ mà cho các lứa tuổi khác nói chung.

Tỷ lệ các vi khuẩn thường gặp trong nghiên cứu như K. pneumoniae,

Acinetobacter, P. aeruginosa, S. aureus ở bệnh nhi NKHHCT xin về và tử vong

không có sự khác biệt, với p>0,05. Nhưng trong hai nhóm NKHHCT và NKHHCT

kết hợp, tỷ lệ tử vong liên quan với các chủng Acinetobacter và S. aureus nổi lên

hàng thứ nhất và thứ hai. Trong hai nhóm, tỷ lệ 4 loài vi khuẩn nói trên ở bệnh nhi

111

xin về và tử vong trong nhóm NKHHCT kết hợp cao hơn nhóm NKHHCT, sự khác

biệt có ý nghĩa thống kê với p <0,05.

4.2. Tính nhạy cảm kháng sinh và khả năng sinh enzym β-lactamase phổ rộng

(ESBLs) của chủng K. pneumoniae

4.2.1. Tỷ lệ phân bố các chủng K. pnemoniae sinh enzym β-lactamase phổ rộng

(ESBLs) phân lập được.

4.2.1.1. Tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pnemoniae

Đề kháng với bêta - lactams và các kháng sinh khác ở các trực khuẩn gram

âm họ đường ruột là rất thường gặp với phát hiện đề kháng trên plasmid, là kiểu đề

kháng rất dễ lan truyền trong các loài vi khuẩn. Đề kháng bêta - lactams tăng lên

trong cộng đồng với các plasmid mang gen mã hóa ESBL và carbapenemase, đặc

biệt là họ CTX-M của ESBL, K.pneumoniae carbamenemase (KPC) và NDM-1

metalobeta- lactamases. Sự đề kháng này xuất hiện và lan truyền rộng khắp trên thế

giới. Những enzym này ngày nay thường xuất hiện kết hợp cùng nhau trên một

plasmid gây tình trạng đa kháng và siêu kháng thuốc [67]. Klebsiella là một giống

trong họ vi khuẩn được tập trung nhất để nghiên cứu đề kháng với bêta - lactams

trong bệnh viện và cơ sở chăm sóc y tế trong cộng đồng. Bêta - lactamase được biết

theo danh mục mới đây dựa vào cấu trúc và chức năng có tới trên 950 đơn vị nguồn

gốc xuất hiện các enzym được giới thiệu trong các tài liệu hoặc trên các trang

website. 4 nhóm chính bêta - lactamase đã được phát hiện trong đó ESBL nhóm phổ

biến nhất [32].

Bốn nhóm chính của Beta-lactamase được xác định: Penicillinases,

Cephalosporinases (AmpC), Beta-lactamase phổ rộng (ESBL), và Carbapenemases.

Như đã thấy ESBL, Cephalosporinases có thể thủy phân các kháng sinh nhóm

cephalosporin phổ rộng như cefotaxime ceftazidime..., là nhóm lớn nhất. Các men

này đã làm cho họ Enterobacteriaceae có khả năng để thủy phân hầu như tất cả các

penicillin và cephalosporins, kết quả là tăng cường sử dụng thường xuyên

carbapenems. Tuy nhiên, carbapenemases cũng đạt được tỷ lệ cao. Các men này có

khả năng ức chế cao carbapenem. Carbapenemases bao gồm: 1) các enzyme với

112

một serine ở vị trí hoạt động, tương tự như 90% của beta-lactamases và 2) các

Metallo-beta-lactamase (MBL) sử dụng ít nhất một ion kẽm thuỷ phân. Mối quan

tâm lớn nhất là "carbapenemases mắc phải" được lan truyền giữa các loài và khó

phát hiện và chống lan truyền trên lâm sàng. ESBL là một trong những cơ chế đề

kháng có ảnh hưởng nhất tới nhóm cephalosporin của họ Enterobacteriaceae, đặc

biệt là E. coli và Klebsiella. Chúng có nguồn gốc trên plasmid có thể thay đổi đề

kháng với kháng sinh khác. Tuy nhiên, ban đầu TEM và SHV- mã hóa ESBL hiện

nay đã được thay thế bằng beta - lactamases họ CTX-M, CTX-M-15 trở thành men

mã hóa ESBLs rộng khắp trên toàn cầu (Karen Bush) ,[32],[67].

Trên thế giới, tỷ lệ sinh ESBLs của các chủng K. pnemoniae là rất khác nhau

theo các vùng địa lý. Trong một mẫu hơn 4.700 K. pnemoniae phân lập từ năm

1997 đến 1999, tỷ lệ phân lập được vi khuẩn tạo men ESBL: Châu Mỹ La Tinh

45,4%, Tây Thái Bình Dương 24,6%, Châu Âu 22,6%, Mỹ 7,6%, Canada 4,9%[19].

Nghiên cứu của Chi Seon Ko và cộng sự tại Hàn Quốc thấy tần suất phân lập được

K. pnemoniae có ESBL ở Khoa Hồi sức cấp cứu cao hơn các khoa khác trong bệnh

viện (60%) [36]. 35% của tất cả loài Klebsiella trong báo cáo của Navon-Venezia S

và cộng sự ở Israel [87], nghiên cứu từ các chủng K. pnemoniae không lặp lại tại

khoa Hồi sức cấp cứu của Hadi mehrgan và cộng sự ở Iran thấy tỷ lệ ESBL rất cao

77,7% [57]. Tại học viện Santa Maria, tỷ lệ này cũng rất cao 63,3% [34].

Tại Việt Nam, tỉ lệ này cũng khác nhau ở các bệnh viện: Bệnh viện Chợ

Rẫy 61%, bệnh viện Việt Đức 39,3%, Bệnh viện Nhi Trung ương 22,97% [19].

Nghiên cứu SMART tại Việt Nam thực hiện trên các vi khuẩn E.coli và K.

pneumoniae phân lập từ nhiễm khuẩn ổ bụng và và nhiễm khuẩn đường tiết niệu

năm 2011 cho thấy tỷ lệ tiết ESBL là 54% và 37%. Công trình nghiên cứu tổng kết

tình hình đề kháng kháng sinh ghi nhận từ 15 bệnh viện tại Việt Nam cho thấy tỷ lệ

K. pneumoniae có sinh men ESBL là rất báo động từ nhiều bệnh viện như Chợ Rẫy

(58%), Việt Đức (49%), Nhiệt đới quốc gia (73%), Bình Định (54%). Một nghiên

cứu đa trung tâm tìm hiểu tình hình đề kháng các kháng sinh trên các trực khuẩn

Gram âm gây nhiễm khuẩn bệnh viện được công bố năm 2009 đã cho thấy vi khuẩn

113

K. pneumoniae có sinh ESBL là 66%. Tại khoa Hồi Sức Ngoại, tỷ lệ này cao 71,8%

giống nghiên cứu các tác giả nước ngoài. Một khi đã xuất hiện ESBL thì sẽ không

chỉ đề kháng với kháng sinh thông thường hay các kháng sinh cephalosporin các thế

hệ mà còn có tỷ lệ cao kháng được kháng được các aminoglycoside và các

fluoroquinolone nữa. Như vậy phần lớn kết quả trong nghiên cứu này tương đối

phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước.

Qua biểu đồ 3.15 ta thấy tỷ lệ sinh ESBL của các chủng K. pneumoniae

phân lập được ở hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp tại khoa Hồi sức ngoại

là cao nhất trong các khoa. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, với p<0,05. Đây là

một vấn đề hết sức quan trọng mà các bác sỹ và điều dưỡng phải lưu ý quan tâm.

Đây là tình trạng chung của nhiều khoa Hồi sức ngoại như: tại khoa Hồi sức ngoại

của bệnh viện Việt Tiệp - Hải Phòng, tỷ lệ sinh ESBL của các chủng K. pneumoniae

phân lập được là 72,41%; Ở bệnh nhân thở máy của khoa Hồi sức cấp cứu bệnh

viện Việt Đức và Bạch Mai tỷ lệ này là 93,75% [10], [20].

4.2.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K. pnemoniae

Như bàn luận ở trên, Klebsiella là giống vi khuẩn có tỷ lệ mang ESBLs

cao ở các chủng phân lập từ bệnh viện, chính vì vậy mà khả năng kháng kháng sinh

của nó cao. Nghiên cứu của các tác giả Thổ Nhĩ Kỳ cho thấy sự đề kháng qua tỷ lệ

nhạy với kháng sinh của các chủng đề kháng, K. pneumoniae kháng với Cefepim

(PEP) 62%, Ceftazidime (CAZ) 99%, Tazocin (TZP) 78%, Amikacin (AK) 83%,

Ciprofloxacine (CIP) 53% và Imipenem (IPM) 11% [49]:

Các báo cáo mới đây của Israel và Tây Ban Nha cho thấy tỷ lệ chủng đa

kháng thuốc kháng với Co- trimoxazon 64%, Gentamicin 9 và 61% thấp hơn nghiên

cứu của chúng tôi [85], [103]. Alaa H. Al-Charrakh và cộng sự nghiên cứu kháng

kháng sinh của các chủng Klesiella phân lập từ môi trường và bệnh viện, kết

quảnghiên cứu chỉ có 34,2% chủng đề kháng với piperacillin.

Mặc dù kháng sinh này lần đầu tiên được giới thiệu trong lâm sàng điều trị

vào năm 1978 (Fu và Neu, 1978), mức thấp đề kháng với thuốc này có thể được quy

114

cho thực tế rằng kháng sinh này gần đây mới được giới thiệu tại Iraq, vì vậy xuất

hiện của sự đề kháng hiện chưa được hình thành.

Một trong những phát hiện nổi bật nhất trong nghiên cứu này là sự xuất

hiện đề kháng với các cephalosporin thế hệ thứ ba (C3G) giữa các chủng Klebsiella

phân lập. Một nửa của các chủng phân lập đề kháng với cefotaxime và hơn 73%

trong số đó đề kháng với ceftizoxime, nhưng các chủng này có thấy mức độ thấp đề

kháng với ceftazidime (18,4%) và ceftriaxone (34,2%). Đề kháng Ceftazidime và đề

kháng cefotaxime đánh dấu cho sự hiện diện enzym có hoạt phổ rộng bêta -

lactamase (ESBL)[53], [89].

Từ kết quả tính nhạy cảm kháng sinh của K. pneumoniae trong nghiên cứu

của chúng tôi nhận thấy tỷ lệ kháng với Ampicillin (99,2%), với Cephalosporin thế

hệ 2, 3 và 4 từ 86,8 đến 93,8% là cao hơn so với kết quả nghiên cứu các chủng

Klebsiella spp. phân lập từ các bệnh phẩm dịch ở BVNTƯ( từ tháng 2/2007 – tháng

8/2007) 75,25 đến 87,29% [4]; cao hơn nhiều so với nghiên cứu vi khuẩn từ dịch

hút phế quản của Ngô Thị Thi và cộng sự từ 40,4% đến 51,2% [11]. K. pneumoniae

trong nghiên cứu của chúng tôi kháng với Co- trimoxazon, Gentamicin, Amikacin

và Tobramycin cao gần như nghiên cứu trước tại Bệnh viện Nhi Trung ương của tác

giả Ngô Thị Thi 79,5%, 70%, 30,2% và 79,5% [11]. Trần Thị Ngọc Anh năm 2007,

nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện

Nhi đồng 2 năm 2007 cho thấy vi khuẩn Klebsiella pneumoniae kháng đa kháng sinh

ở mức cao các Trimethoprim/sulfamethoxazol (74%), Cefuroxime(71,2%),

Cefotaxime (65,3%), Gentamycine (63,6%), Ceftazidime (53,1%), Netilmycine

(43,52%), Amikacin (42,9%) [23]. Tình trạng kháng kháng sinh trong nghiên cứu

của chúng tôi cao hơn rất nhiều. Hầu hết các chủng trong nghiên cứu của chúng tôi

kháng với Ampicilline, còn nhạy cảm với Imipenem và Ciprofloxacin phù hợp với

nghiên cứu trước đây [4], [11]. Qua bảng 3.19 và 3.20, tính nhạy cảm kháng sinh

của các chủng K. pneumoniae ở nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp cũng tương

tự nhưng ở nhóm NKHHCT kết hợp tỷ lệ kháng với Ampicilline là 100%.

115

Tỷ lệ kháng với nhiều loại kháng sinh cao. Kháng với 9 đến 12 kháng sinh

chiếm đa số trong các chủng K. pnemoniae phân lập được( 75%) nói chung.

Biểu đồ 3.11 cho thấy, ở cả hai nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp, tỷ lệ

các chủng K. pneumoniae kháng từ 9 đến 12 kháng sinh là chủ yếu chiếm 70,1 đến

84,8 % số chủng, trong đó nhóm NKHHCT kết hợp có tỷ lệ cao hơn; ngược lại tỷ lệ

chủng kháng 6-8 kháng sinh là 11,4% và 26%, nhóm NKHHCT chiếm tỷ lệ cao

hơn. Xuất hiện một số chủng kháng hết các kháng sinh thử nghiệm trong nhóm

NKHHCT kết hợp. Như vậy tình trạng kháng kháng sinh trầm trọng xảy ra ở nhóm

NKHHCT kết hợp, đây là một cảnh báo nữa với các thầy thuốc lâm sàng. Ngoài ra

chúng ta cũng thấy trên bảng 3.21, các chủng K. pneumoniae phân lập ở nhóm

NKHHCT được có tới 38 kiểu cách đề kháng khác nhau. Kiểu cách đề kháng

thường gặp nhất là kháng với các kháng sinh

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM (23,87%);

CXM,AM,AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM (10,32%);

CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,AK,TM (9,03%) và không có chủng nào kháng

hết các kháng sinh thử nghiệm.

Ở bảng 3.22- nhóm NKHHCT kết hợp các chủng K. pneumoniae phân lập

được có 24 kiểu đề kháng. Kiểu đề kháng thường gặp nhất là kháng với các kháng

sinh CXM,AM,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM (18,18%);

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM (17,05%);

CXM,AM, AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,TS,GM,AK,TM,CIP (12,5%); CXM,AM,

AMC,CF,CAZ,CTX,FEP,GM,AK,TM (11,36%) và có chủng kháng hết các kháng

sinh thử nghiệm.

Qua biểu đồ 3.12 ta thấy, tỷ lệ K. pneumoniae kháng ≥9 kháng sinh ở bệnh

nhi tử vong chiếm tỷ lệ cao hơn ở những chủng K. pneumoniae kháng < 9 kháng

sinh. Nhóm NKHHCT kết hợp cao hơn hẳn nhóm NKHHCT. Sự khác biệt này có ý

nghĩa thống kê, với p< 0,05. Như vậy các chủng đa kháng là mối nguy hiểm rất lớn

đối bệnh nhân và đặc biệt là những bệnh nhân nằm các khoa Hồi sức cấp cứu.

116

4.2.3. Mức độ kháng kháng sinh xác định bằng kỹ thuật định lượng MIC

Kết quả nghiên cứu của các tác giả nước ngoài đã thực hiện trên các chủng

=16µg/ml và MIC90 ≥ 64µg/ml, Cefepime: MIC50

K. pneumoniae có ESBLs (+) có điểm gãy MIC ở nồng độ rất cao. Nghiên cứu của

của chúng tôi thấp hơn.

Myeong Hee Kim và cộng sự tại Hàn Quốc năm 2009 với kết quả [81]: Amikacin: =32µg/ml và MIC90 ≥ MIC50 64µg/ml, Ceftazidime: MIC50 ≥ 64µg/ml và MIC90 ≥ 64µg/ml, Cefotaxime: MIC50 ≥ 64 µg/ml và MIC90 ≥ 64 µg/ml, Aztreonam: MIC50 ≥ 64 µg/ml và MIC90 ≥ 64 µg/ml, Ciprofloxacin: MIC50 ≥ 16 µg/ml và MIC50 ≥ 16µg/ml, Cefoxitin: MIC50 ≥ 64µg/ml và MIC90 ≥ 64µg/ml. So với các kháng sinh cùng được thử nghiệm với

nghiên cứu của chúng tôi MIC50 và MIC90

Một tác giả khác là Alaa H. Al-Charrakh và cộng sự nghiên cứu kháng kháng

sinh của các chủng Klesiella phân lập từ môi trường và bệnh viện, kết quả nghiên cứu

MIC của các nhóm chủng K. pneumoniae có ESBLs (+), có 8 chủng [93] như sau do số chủng nghiên cứu không đủ lớn): (tác giả này không tính được MIC50 và MIC90

K. pneumoniae E 46: AMP >128 µg/ml, AMX >128µg/ml, PIP 32µg/ml, CF =

64µg/ml, CTX= 16µg/ml, CAZ = 32µg/ml, ZOX = 64µg/ml, CTR = 32µg/ml; chủng

K. pneumoniae E 51: AMP >128µg/ml, AMX >128µg/ml, PIP = 16µg/ml, CF =

32µg/ml, CTX = 32µg/ml, CAZ = 32µg/ml, ZOX = 32µg/ml, CTR = 32µg/ml,

chủng K. pneumoniae E 52: AMP = 64µg/ml, AMX = 64µg/ml, PIP = 64µg/ml, CF

= 32µg/ml, CTX = 32µg/ml, CAZ = 32µg/ml, ZOX = 64µg/ml, CTR = 64µg/ml;

chủng K. pneumoniae E 54: AMP >128µg/ml, AMX = 64µg/ml, PIP >128µg/ml, CF

= 32µg/ml, CTX = 16µg/ml, CAZ = 64µg/ml, ZOX = 128µg/ml, CTR = 64µg/ml;

chủng K. pneumoniae E59 AMP >128µg/ml, AMX = 32µg/ml, PIP = 64µg/ml, CF =

64µg/ml, CTX = 16µg/ml, CAZ = 32µg/ml, ZOX = 64µg/ml, CTR >128 µg/ml;

chủng K. pneumoniae E6C AMP>128µg/ml, Amx>128µg/ml, PIP = 32µg/ml, CF =

64µg/ml, CTX = 16µg/ml, CAZ = 32µg/ml, ZOX = 32µg/ml, CTR = 64µg/ml; chủng

K. pneumoniae E21C AMP>128µg/ml, Amx>128µg/ml, PIP = 32µg/ml; CF =

64µg/ml, CTX = 16µg/ml; CAZ = 32µg/ml; ZOX = 32µg/ml, CTR = 64µg/ml; chủng

K. pneumoniae E22C AMP>128µg/ml, AMX = 64µg/ml, PIP >128µg/ml; CF =

117

32µg/ml, CTX = 32µg/ml, CAZ = 32µg/ml, ZOX = 64µg/ml; CTR >128µg/ml. Đồng

thời nhóm tác giả Alaa H. Al-Charrakh và cộng sự cũng nghiên cứu nồng độ ức chế

tối thiểu của các nhóm chủng trên với các kháng sinh phối hợp giữa các kháng sinh

nhóm β-lactamin với các kháng sinh Clavulanic, để chứng minh cho sự có mặt của

enzym ESBLs (+) ở các chủng này: do có sự cạnh tranh vị trí bám của kháng sinh

Clavulanic, nên enzym ESBLs của vi khuẩn bị ức chế, phát huy tác dụng của các

kháng sinh nhóm β-lactamin, làm cho nồng độ ức chế tối thiểu MIC giảm xuống. Kết

quả nghiên cứu của nhóm này như sau: chủng K. pneumoniae E 46: CTX = 16 µg/ml

và CTX/CLA = 0,008 µg/ml, CAZ = 32µg/ml và CAZ/CLA = 0,004µg/ml; chủng K.

pneumoniae E 51: CTX = 32µg/ml và CTX/CLA = 0,008 µg/ml, CAZ = 32µg/ml và

CAZ/CLA = 0,004µg/ml; chủng K. pneumoniae E 52: CTX = 32µg/ml và

CTX/CLA = 0,008µg/ml, CAZ = 32µg/ml và CAZ/CLA = 0,00µg/ml; chủng K.

pneumoniae E54: CTX = 16µg/ml và CTX/CLA = 0,008µg/ml, CAZ = 64µg/ml và

CAZ/CLA = 0,008µg/ml; chủng K. pneumoniae E59: CTX = 16 µg/ml và CTX/CLA

= 0,008µg/ml, CAZ = 32µg/ml và CAZ/CLA = 0,002µg/ml; chủng K. pneumoniae

6c: CTX = 64µg/ml và CTX/CLA = 0,008µg/ml, CAZ = 32µg/ml và CAZ/CLA =

0,008µg/ml; chủng K. pneumoniae 21c: CTX = 16µg/ml và CTX/CLA =

0,008µg/ml; CAZ = 32µg/ml và CAZ/CLA = 0,008µg/ml; chủng K. pneumoniae

22c: CTX = 16µg/ml; CTX/CLA = 0,008 µg/ml, CAZ = 32µg/ml và CAZ/CLA =

0,008µg/ml. Nghiên cứu này có giá trị trong phòng thí nghiệm để chúng minh sự có

mặt của enzym ESBLs (+), không có giá trị trên lâm sàng, do cơ chế kháng chéo của

ESBLs, vì vậy nếu chủng vi khuẩn có ESBL (+), để tránh thất bại điều trị, bác sĩ lâm

sàng sẽ phải chuyển sang nhóm kháng sinh khác để điều trị là Carbapenem

(Imipenem, Ertapenem, Meropenem và Doripenem).

Kết quả MIC50 và MIC90 , nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế 50% và 90%

chủng vi khuẩn K. pneumoniae được thử nghiệm điểm trong nghiên cứu của chủng

tôi (bảng 3.9) với các kháng sinh nhóm β-lactamin (FOX, CFP, AZT, CTX, CAZ,

PIP, PEF) đều có nồng độ khá cao, vượt lên trên giá trị chuẩn để xác định kháng (R)

và với các kháng sinh phối hợp với kháng sinh clavulanic (CTX/CLA, CAZ/CLA,

118

PIP/CLA) có nồng độ ức chế tối thiểu thấp hơn, xấp xỉ giá trị ngưỡng chuẩn, trừ

PIP/CLA đã vượt giá trị chuẩn khá cao, song nhìn chung nồng độ ức chế tối thiểu

của nhóm kháng sinh phối hợp này đã cao hơn so với nghiên cứu của nhóm tác giả

Alaa H. Al-Charrakh và cộng sự .

Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC50 và MIC90 , của chúng tôi

đã khẳng định mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactamin của các chủng K.

pneumoniae trong nghiên cứu là rất cao, do chúng có enzym ESBL (+).

4.3. Tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh

Cephalosporin thế hệ 3 (C3G) nằm trên plasmid

Cephalosporin thế hệ 3 gồm các kháng sinh: Cefcapene, Cefdaloxime,

Cefdinir, Cefditoren, Cefetamet, Cefixime, Cefmenoxime, Cefozidime, Cefotaxime,

Cefovecine, Cefpimizole, Cefpodoxime, Cefterame, Ceftibuten, Ceftiofur,

Ceftiolene, Ceftizoxime, Ceftriaxone, Cefoperazone, và Ceftazidime. Thế hệ

cephalos này được phát triển từ vòng β-lactam cua cephalosporin gắn thêm một gốc

thuộc nhóm oxyimino do vậy mà còn được gọi là nhóm oxyimino- cephalosporin.

Cephalosporin thế hệ 3 có phổ kháng khuẩn rất rộng trên các vi khuẩn Gram âm, kể

cả Pseudomonas ( như Ceftazidime và Cefoperazone). Do phổ kháng khuẩn rộng và

mạnh, đồng thời kháng được β-lactamase cổ điển nên cephalosporin thế hệ 3 được

xem là kháng sinh hàng đầu điều trị các nhiêm khuẩn nặng nằm viện. Ngoài ra do

dược động học của nhiều cephalosporin thế hệ 3 là qua được hàng rào máu màng

não, các kháng sinh như Cefotaime, Ceftriaxone là được lựa chọn như là kháng sinh

hàng đầu điều trị viêm màng não mủ cho các vi khuẩn Gram âm còn nhạy cảm hiện

nay. Hiện nay chúng ta đang phải đối phó với các vấn đề do lạm dụng

cephalosporin thế hệ 3 gây ra, trước hết là sẽ chọn lọc vi khuẩn mang gen ampC

giải ép đột biến từ gen ampC cảm ứng làm cho vi khuẩn có khả năng tiết β-

lactamase phá hủy được các cephalosporin thế hệ 3 mà không cần phải bị cảm ứng

nữa, và nếu gen này nằm trên plasmid thì nguy cơ lây lan tính đề kháng cho các vi

khuẩn cùng loài hay khác loài sẽ xảy ra. Tuy nhiên, vấn đề này không nổi trội bằng

119

vấn đề phải đối phó với tỷ lệ ngày càng gia tăng các vi khuẩn sinh ESBL kháng

được tất cả các thế hệ cephalosporin.

Enterobacteriae kháng lại oxyimino-cephalosporin như ceftriaxone và

ceftazidime (CAZ) ngày càng tăng, vấn đề trong điều trị các bệnh nhiễm trùng

bệnh viện gặp khó khăn thường gây ra bởi việc sản xuất enzym phổ rộng β-

lactamase (ESBL) [92]. ESBL thường xuyên được xác định trong Klebsiella

pneumoniae và Escherichia coli , nhưng cũng được xác định trong loài khác, chẳng

hạn như Citrobacter spp, Enterobacter spp. Và Pseudomonas aeroginosa. Các vi

khuẩn sinh ESBL đã được tìm thấy trên toàn thế giới . Các loại của ESBLs bao gồm

penicillinase, cephalosporinase và monobactamase. Hơn 100 ESBL type khác nhau

đã được biết đến. Các loại ESBLs thường được gặp đại diện: do các gen SHV,

TEM, OXA và CTX-M mã hóa [53]. Tất cả loại trừ gen OXA thuộc lớp D hoặc

nhóm 2d. Trong khi loại TEM-và SHV mã hóa ESBL đã xuất hiện từ họ SHV-1 và

TEM-1/-2 bởi đột biến điểm, nguồn gốc từ những enzym nhóm khác là không rõ

ràng. Plasmid mang gen TEM-1/-2 lan rộng và là nguyên nhân gây ra sự đề kháng

với penicillin phổ rộng ở nhiều vi khuẩn Gram âm, chẳng hạn như E. coli, Neisseria

gonorrhoeae và Haemophilus influenzae [76]. Gen SHV-1 nằm trên nhiễm sắc thể

mã hóa enzym beta-lactamase K2 từ K. pneumoniae, nhưng cũng đã tìm thấy được

nằm trên plasmid trong các loài khác . Đối với cả hai gen TEM-1 và SHV-1, một

liên kết với transposon đã được công nhận. Một số gen CTX-M giống hệt nhau hoặc

tương tự mã hóa sinh beta-lactamase đặc biệt từ loài Kluyvera spp. . Các phát hiện

sản xuất men ESBLs trong chẩn đoán vi sinh vật là vấn đề đặc biệt, vì vi sinh vật

thường nhạy cảm với các cephalosporin trong phòng thí nghiệm[53]. Không phát

hiện ESBL và sau đó điều trị với oxyimino-cephalosporin dẫn tới nguy cơ thất bại

điều trị. Tỷ lệ tử vong cao hơn cũng đã được mô tả. Mặc dù ESBL đầu tiên được

phát hiện ở Đức, việc áp dụng các kỹ thuật ở nhiều mức độ, luôn được thực hiện để

phát hiện để có biện pháp kiểm soát nó [52], [54], [68], [65].

Trong quá trình đấu tranh với sự phát triển các thế hệ cephalosporin càng về

sau càng mạnh hơn và phổ càng rộng hơn. Trực khuẩn Gram âm đặc biệt là

120

Enterobacteriaceae đã tiếp tục tiến hóa để tạo ra một loại men β-lactamase có hoạt

phổ phá hủy được hầu hết các thế hệ cephalosporin được đặt tên là β-lactamase phổ

rộng(ESBL) đúng như khả năng của nó. Sự nguy hiểm của ESBL không chỉ ở chỗ

phá hủy được hầu hết các thế hệ cephalosporin mà còn ở nguy cơ lây lan rất cao do

nguồn gốc gen của ESBL là đột biến của gen TEM (với 100 biến thể) và SHV (với

trên 50 biến thể) nằm trên plasmid, hay từ các gen mới (như CTX, VER< OXA,

PER) cũng trên plasmid hay trên nhiễm sắc thể nhưng lại là các gen nhảy.

Sự phát hiện các gen mã hóa enzym ESBLs luôn được nghiên cứu ở nhiều

quốc gia trên các châu lục. Tác giả Caio Fernando de Oliveira và cộng sự nghiên cứu

trên K.pneumoniae phân lập từ bệnh viện ở bang Rio Grande do Sul- Brazil thấy TEM

(89,1%), SHV (79,7%), CTX (50%) [34]. Tác giả ở Tehran nghiên cứu trên các

chủng K.pneumoniae phân lập từ bệnh nhân (2007) với TEM: 32,8%; SHV: 69,6%;

nghiên cứu của các tác giả Pháp năm 2009 tỷ lệ mang gen kháng C3G của K.

Pneumoniae có tỷ lệ TEM (89,1%) cao hơn; Nhưng SHV (79,7%) và CTX-M

(25%) thấp hơn nghiên cứu của chúng tôi. Đây là một sự báo động về thực trạng

kháng thuốc và sử dụng kháng sinh của chúng ta

Ở Việt nam, nghiên cứu của Cao Thị Bảo Vân và cộng sự cho thấy: tỷ lệ

mang gen mã hóa sinh β-lactamase của các chủng thuộc họ Enterobacteriacea phân

lập năm 2002 là CTX-M chiếm 25,5%, SHV chiếm 38,1%, TEM chiếm 76,3%.

Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ mang gen mã hóa sự kháng C3G ở chủng

K. pneumoniae đã tăng rất cao, đặc biệt là tỷ lệ mang gen CTX-M chiếm 92,5%),

SHV chiếm 88,8% và TEM chiếm 80,4%.[21]

121

4.4. Tỷ lệ chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh

quinolon (qnr)

Sự kháng kháng sinh nhóm quinolon được xác định bởi gen qnr nằm trên các

Integron khác nhau. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn bởi nó nói lên rằng gen

kháng quinolon có thể lan truyền ngang giữa các vi khuẩn với nhau. Nó được nghiên

cứu và phát hiện ở rất nhiều nước khắp các châu lục.

Tỷ lệ các gen kháng Quinolon trong nghiên cứu nàycủa chúng tôi tương đương

một số nghiên cứu của một số nước: các tác giả Hyunjoo Pai và cộng sự tỷ lệ qnrB

phân lập được là 40,5%, qnrA 3,8%; Myeong Hee Kim và cộng sự ở Hàn Quốc

nghiên cứu trên các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập từ bệnh viện thấy tổng số

các chủng có mang gen qnr là 40,5%. Trong đó qnr B chiếm 85,7%, qnrS 14,3% và

Trung Quốc từ 2,4 đến 15,1% [28], [81], [104].Với tỷ lệ 38,3% mang gen kháng qnr

trong số chủng mang gen kháng C3G cũng nằm trong tỷ lệ cao so với nghiên cứu của

các nước. Đây là kháng sinh cũng được sử dụng nhiều và có hiệu quả trong điều trị các

căn nguyên nhiễm khuẩn do vậy việc hạn chế lan truyền là vấn đề cấp thiết cần chú ý.

4.5. Xác định chủng K. peumoniae mang đồng thời gen mã hóa sự kháng

kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 (C3G) và quinolon (qnr)

Nghiên cứu này đã chỉ ra một chủng vi khuẩn có thể mang đồng thời rất

nhiều gen mã hóa sự kháng thuốc nằm trên plasmid, tỷ lệ những chủng này chiếm

tới 85%, điều đó đồng nghĩa với việc rất nhiều gen mã hóa sự kháng thuốc được

truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác nhanh chóng trong một thời gian ngắn và

rất khó kiểm soát, do cơ chế lan truyền ngang, qua tiếp xúc trực tiếp giữa các vi

khuẩn có chứa plasmid mang gen mã hóa kháng thuốc với một vi khuẩn khác còn

nhạy cảm. Đặc biệt những chủng này ngoài việc mang gen mã hóa sự kháng kháng

sinh nhóm β-lactam còn có tỷ lệ không nhỏ mang đồng thời cả gen mã hóa sự kháng

Quinonol, chiếm tỷ lệ 22,4%. Quinolon và Cephalosponrin thế hệ 3,4 là kháng sinh

đang được sử dụng khá rộng rãi và có hiệu quả trong điều trị các bệnh nhiễm trùng.

Vì vậy, để dự phòng sự gia tăng chủng đa kháng, việc hạn chế tối thiểu sự lan

122

truyền các chủng mang gen mã hóa sự kháng C3G cũng đồng thời làm giảm đáng

kể sự lan truyền gen mã hóa sự kháng Quinolon.

4.6. Xác định chủng K. peumoniae mang gen mã hóa sự kháng kháng sinh

Cephalosporin thế hệ 3 (C3G) và quinolon (qnr) nằm trên plasmid

Trong nghiên cứu của chúng tôi, kỹ thuật PCR và kỹ thuật Southern Blot đã

sử dụng là hai kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cảm và độ đặc hiệu cao, với

việc sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu chỉ nhân các đoạn ADN nằm trên plasmide

trong kỹ thuật PCR và sử dụng enzym giới hạn S1, chỉ cắt đặc hiệu trên đoạn ADN

plasmide, kết quả nghiên cứu đã 2 lần khẳng định sự có mặt của các gen tìm được

nằm trên ADN plasmid, sự khẳng định lần thứ 2 với kỹ thuật Southern Blot, đã làm

giảm sự sai số trong nghiên cứu xuống thấp dưới 100 lần (theo nguyên lý của xác

xuất thống thống kê).

Mặt khác, các kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra tỷ lệ chủng vi khuẩn K.

pneumoniae mang các gen mã hóa sự kháng kháng sinh nhóm C3G và quinolon

nằm trên plasmid khá cao, đồng thời một chủng mang nhiều loại gen khác nhau.

Điều này rất có ý nghĩa, nó cho biết mức độ lan truyền các gen kháng sẽ có tần xuất

cao hơn nhiều so với sự có mặt gen mã hóa sự kháng nằm trên ADN nhiễm sắc thể,

do nó có thể truyền ngang qua tiếp xúc trực tiếp của các chủng vi khuẩn, và có thể

truyền đồng thời nhiều gen kháng. Đây là một cơ chế kháng thuốc nghiêm trọng,

làm gia tăng rất nhanh sự kháng thuốc trong quần thể vi khuẩn gây bệnh.

Với nghiên cứu này, chúng tôi hy vọng sẽ đóng góp thêm sự hiểu biết về cơ

chế đề kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn K. pneumoniae gây nhiễm khuẩn

đường hô hấp phân lập tại Bệnh viện Nhi Trung ương, là cơ sở để các bác sĩ và các

nhà dược sĩ lâm sàng xây dựng phác đồ điều trị hiệu quả hơn.

123

KẾT LUẬN

1. Với 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của bệnh nhi 0 đến 6 tuổi ở các khoa

HSCC, Sơ sinh, HSN và khoa Hô hấp có 1.181 mẫu dương tính. Tỉ lệ nuôi cấy

dương tính là 33,1%. Trong đó có 7,4% mẫu có 2 loài. Trực khuẩn gram âm chiếm

đa số tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lập được nói chung. Trong các loài vi khuẩn

phân lập được, K.pneumoniae chiếm hàng đầu 22,61%, theo sau là Acinetobacter

spp 19,9% và p.aeruginosa là 18,37%.

2. Từ 3.567 mẫu bệnh phẩm đường hô hấp của bệnh nhi 0 đến 6 được chia thành hai

nhóm NKHHCT (1.909) và NKHHCT kết hợp (1.658).

- Tỷ lệ nuôi cấy dương tính NKHHCT là 37,4%; Trực khuẩn gram âm chiếm

đa số, trong đó K.pneumoniae chiếm hàng đầu 24,1%, theo sau là P.aeruginosa là

17,4%. Tỷ lệ phân lập được chủng K. pneumoniae ở khoa Sơ sinh là cao nhất chiếm

13,0%, tiếp đến khoa Hô hấp 8,7% và thấp nhất là khoa Hồi sức cấp cứu 4,2%

- Tỷ lệ nuôi cấy dương tính NKHHCT kết hợp là 28,1%; Trực khuẩn gram

âm chiếm đa số trong đó Acinetobacter. spp chiếm hàng đầu 29,8%, theo sau là

K.pneumoniae 20,3%. Tỷ lệ K.pneumoniae phân lập được cao nhất ở khoa Sơ sinh,

sau đó là khoa HSCC và HSN.

- Cầu trùng Gram dương phân lập được ở nhóm NKHHCT cao hơn nhóm

NKHHCT kết hợp .

3. Các chủng Klebsiella kháng cao với kháng sinh nhóm cephacosporin thế hệ 2, 3,

4 từ 86,8% đến 95%. Các chủng K.pneumoniae kháng hầu hết kháng sinh

cefuroxime: 93,8%, cephalothin 95,1% và ampicilin 99,2%- 100%, các kháng sinh

nhóm aminoglycoside kháng cao với tỷ lệ 65,8% đến 79,4%. Còn nhạy đối với

imipenem và ciprofloxcin. Tỷ lệ đa kháng cao, có nhiều kiểu đề kháng, chủ yếu là

kiểu đề kháng 9 đến 12 loại kháng sinh(75%). Xuất hiện chủng kháng với tất cả các

kháng sinh thử nghiệm. Tỷ lệ K. pneumoniae kháng ≥9 kháng sinh ở bệnh nhi tử

vong chiếm tỷ lệ cao hơn ở những chủng K. pneumoniae kháng < 9 kháng sinh, tỷ

124

lệ K. pneumoniae kháng ≥9 kháng sinh ở bệnh nhi tử vong ở nhóm NKHHCT kết

hợp cao hơn hẳn nhóm NKHHCT.

- Tỷ lệ sinh ESBL ở các chủng K.pneumoniae phân lập được là 56,9%, cao

nhất ở khoa Hồi sức ngoại 71,8% và có sự khác biệt giữa các khoa.

- MIC có điểm gẫy ở nồng độ cao, lớn hơn chuẩn đề kháng kháng sinh MIC .

Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC50 và MIC90 của chúng tôi đã khẳng

định mức độ kháng kháng sinh nhóm β-lactam của các chủng K. pneumoniae trong

nghiên cứu là rất cao.

4. Tỷ lệ mang gen kháng C3G và qinolon trong nghiên cứu cho thấy:

- Tỷ lệ mang gen kháng C3G cao: CTXM- 3; 30,8%; CTXM-9: 73,8%; SHV:

88,8%; TEM: 80,4%. Tổng họ CTXM: 92,5%, tỷ lệ chủng mang đồng thời gen

CTX-M-3 và CTX-M-9 trong nghiên cứu 10,3%. Tỷ lệ đồng thời mang tất cả các

gen kháng C3G là 85%.

- Tỷ lệ mang gen kháng qnr là 38,3%. Trong đó qnrA: 2,4%; qnrB: 17% và

chủ yếu là qnrS: 80,6%.

- Tỷ lệ đồng thời mang gen kháng C3G và qnr trong nghiên cứu là 22,4% .

125

KIẾN NGHỊ

1. Điều trị có hiệu quả và phòng ngừa sự phát triển cũng như lây lan những

chủng vi khuẩn K.pneumoniae kháng thuốc. Cần coi trọng công tác xét nghiệm và

điều trị theo kháng sinh đồ.

2. Nên có nhiều nghiên cứu về các gene kháng kháng sinh của vi khuẩn gây

bệnh và dịch tễ học của nó để có biện pháp phòng ngừa và khống chế các vi khuẩn

này

Luận án Tiến sĩ Y học: Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại Bệnh viện Nhi Trung ương, 2009 - 2010

Bùi Thị Mùi

TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ 3 VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG,2009 - 2010

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2014

Bùi Thị Mùi

TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ 3 VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG,2009 - 2010

Chuyên nghành: Vi sinh y học

Mã số: 62720115

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Nguyễn Thanh Liêm

2. TS. Lê Thị Ánh Hồng

HÀ NỘI - 2014

LLờờii ccảảmm ơơnn

CCHHỮỮ VVIIẾẾTT TTẮẮTT

Mức độ kháng nhóm Beta lactamin của chủng K. pneumoniae ESBL (+)

Có thể bạn quan tâm

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và kết quả điều trị ở bệnh nhân tổn thương mạn tính động mạch đùi - khoeo bằng phương pháp can thiệp nội mạch qua da

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hình ảnh cộng hưởng từ sức căng khuếch tán, tưới máu thận ghép và mối quan hệ với lâm sàng và siêu âm Doppler

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và kết quả điều trị ở bệnh nhân tổn thương mạn tính động mạch đùi – khoeo bằng phương pháp can thiệp nội mạch qua da

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kết quả phẫu thuật thay van động mạch chủ qua đường mở ngực nhỏ khoang liên sườn II trước phải

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kết quả phẫu thuật thay van động mạch chủ qua đường mở ngực nhỏ khoang liên sườn II trước phải

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Các yếu tố tiên lượng kết cục ở bệnh nhân nhồi máu não cấp do tắc động mạch thân nền được điều trị tái thông trong cửa sổ 24 giờ

Luận án Tiến sĩ: Các yếu tố tiên lượng kết cục ở bệnh nhân nhồi máu não cấp do tắc động mạch thân nền được điều trị tái thông trong cửa sổ 24 giờ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại bệnh viện thống nhất, thành phố hồ chí minh

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hình ảnh cộng hưởng từ sức căng khuếch tán, tưới máu thận ghép và mối liên quan với lâm sàng và siêu âm Doppler

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tác dụng của viên nang cứng Nhất Gan Linh trong điều trị xơ gan trên thực nghiệm và lâm sàng

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tác dụng của viên nang cứng Nhất Gan Linh trong điều trị xơ gan trên thực nghiệm và lâm sàng

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tác dụng của phương pháp thủy châm chế phẩm chứa nọc ong trong điều trị đau thắt lưng do thoái hóa cột sống

Luận án Tiến sĩ: Giá trị của nghiệm pháp nhận biết mùi trong chẩn đoán bệnh Parkinson tại Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Vai trò của real-time PCR mẫu bệnh phẩm đường hô hấp dưới trong chẩn đoán và điều trị viêm phổi nhập viện có yếu tố nguy cơ nhiễm Staphylococcus kháng methicillin

Luận án Tiến sĩ: Tính giá trị và chi phí - hiệu quả của một số quy trình chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tỷ lệ trẻ rối loạn phổ tự kỷ và hiệu quả chương trình can thiệp dựa vào cộng đồng tại tỉnh Quảng Ngãi

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu trầm cảm và đánh giá kết quả can thiệp cộng đồng phòng chống trầm cảm ở người cao tuổi tại thành phố Quảng Ngãi

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu nồng độ periostin huyết thanh trong tiên lượng chức năng tim sau nhồi máu cơ tim cấp

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng stress oxy hoá lên chức năng sinh sản ở nam giới và kết quả của liệu pháp chống oxy hóa

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok