Luận văn cao học “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1"

Chia sẻ: Nguyễn Huy Hoàng | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

213
lượt xem 83
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhóm virus cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chim mang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy hiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn cao học “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1"

TRƯỜNG ………………. KHOA……………….. ----- ----- BÁO CÁO TỐT NGHIỆP Đề tài: Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 1
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………...i LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………ii MỤC LỤC …………………………………………………………………iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ……………………………………………vi DANH MỤC CÁC BẢNG ………………………………………………..vii DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………………..viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3 1.1. Cúm A/H5N1 ......................................................................................3 1.1.1. Cấu tạo.............................................................................................. 3 1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ ................................................... 5 1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 ................................... 7 1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ ......................................................................... 8 1.2. Kháng nguyên HA ............................................................................ 10 1.3. Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới ........................... 12 1.3.1. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới.. ....................................................... 116 1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới................................................................ 16 1.4. Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens và ứng dụng ............... 19 1.4.1. Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens .................................................... 19 1.4.2. Hệ vector nhị thể .......................................................................... 251 2
1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp ....................................................................................... 273 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 285 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................... 295 2.1.1. Vật liệu........................................................................................... 295 2.1.2. Hóa chất ........................................................................................ 295 2.1.3. Thiết bị ........................................................................................... 306 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 306 2.2.1. Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR ................. 306 2.2.2. Phương pháp ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal ........... 328 2.2.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E. coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt .................................. 30 2.2.4. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway ........................... 336 2.2.5. Biến nạp vector chuyển gen vào A. rhizogenes ATCC15834 .......... 35 2.2.6. Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa protein vỏ virus vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 .............................. 36 2.2.7. Phương pháp đánh giá cây trồng chuyển gen .............................. 37 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu ………………………………………. 39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 40 3.1. Kết quả tách dòng gen HA1.............................................................. 40 3.1.1. Kết quả PCR nhân đoạn gen HA1 ................................................. 40 3.1.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .................................................. 41 3.1.3. Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal ........................ 446 3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 bằng kỹ thuật Gateway®. 47 3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp theo phản ứng LR ....................................... 47 3.2.2. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR . 48 3
3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn ........... 48 3.3. Kết quả biến nạp pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A.rhizogenes .. 49 3.4. Kiểm tra hệ thống tạo rễ tơ chuyển gen thông qua A.rhizogenes sử dụng gen chỉ thị Gus .................................................................... 51 3.5. Kết quả chuyển gen HA1 vào mảnh lá thông qua A. rhizogens để tạo các dòng rễ tơ chuyển gen HA1 ............................................. 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 57 PHỤ LỤC …………………………………………………………………. 66 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhóm virus cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chim mang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy hiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác. Ngoài ra, chúng còn là nơi cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên các subtype mới. Các subtype virus cúm A gây bệnh trên người đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể và biến chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh, trước đây đã tạo nên những vụ dịch thảm khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại tái hiện và gây nên đại dịch mới. Năm 2004 các đại dịch cúm gia cầm tại các nước châu Á (bao gồm dịch do H5N1 gây ra tại Trung Quốc, Nhật, Nam Triều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia và Lào; do H7N3 (Pakistan); do H5N2 ( Đài Loan) đã gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làm chết hàng chục người ở Việt Nam và tại Thái Lan. Chủng H5N1 điển hình ở 4
châu Á có tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng A/Vietnam/1203/04. [1] Để phòng chống sự lây lan mạnh mẽ của đại dịch cúm gia cầm, hàng năm Việt Nam cần một lượng vaccine rất lớn để tiêm chủng cho hàng trăm triệu con gà vịt. Ngoài những công nghệ sẵn có Việt Nam đang tìm kiếm những công nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao. Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được các tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem là hướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức khoẻ cộng đồng như Việt Nam. Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào các cây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trong những hướng đi chính hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũng được bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấy sinh khối tế bào để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Do tế bào thực vật có ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang các mầm bệnh cho người. Với mục đích tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá”. 2. Mục tiêu của đề tài - Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1. 5
- Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens. 3. Nội dung nghiên cứu - Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp. - Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1. - Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1 và biến nạp vào vi khuẩn A. rhizogens. - Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cúm A/H5N1 1.1.1. Cấu tạo Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt vỏ của hạt virus [48]. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dal. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand [61] (Hình 1). 6
Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A. Ghi chú: A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge). Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus [16], [73]. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [61], [63]. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến 7
H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Các subtype này gây nhiễm cho hầu như phần lớn mọi loài sinh vật bao gồm các loài lông vũ (gà, chim và thuỷ cầm), lợn, ngựa, chồn đất, hải cẩu, cá voi và loài người. Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân đoạn (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus (hình 2). Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen (hình trái) gồm 8 gen là 8 đoạn RNA sợi đơn âm (-ssRNA) và mô hình (hình phải) thể virus cúm H5N1 gồm các protein và các đoạn –ssRNA. (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge). 1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ Độc lực gây bệnh của virus cúm A 8
Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [41]. - HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48h sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [17], [65]. - LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [17], [65]. Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên [25]. 9
Hình 1.3. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A (Nguồn: http://www.impe-qn.org.vn/impe- qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194) Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người. Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm [21], [66], [67]. Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [21], [34], [36]. 10
1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng [53] [65]. Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc (H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người, có lẽ do tính thích ứng thụ thể sialic của chúng [58], [71]. Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột Hamster, chồn đất [25], [36]. Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch chống lại virus bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể không có tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus cúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ở tự nhiên, và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm A [65]. Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng nguyên khác với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới. Đây là nguyên nhân làm cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần trong năm, và các đợt dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có thể gây nên đại dịch cúm mới [26]. Khả năng gây bệnh của biến chủng 11
virus cúm mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể có được đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với biến chủng đó và chúng trở nên thích nghi lây nhiễm ở loài vật chủ mới [67], ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân của các đại dịch cúm trên người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người. Tuy nhiên, các chủng này vẫn thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng năm ở người, do khả năng biến đổi kháng nguyên của chúng [34]. Đây cũng chính là nguồn virus trao đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia cầm, để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên người [22], [64], [65], [67]. 1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [49], [53]. Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm. Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ. Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [60], [65]. Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của 12
virus và các RNA vận chuyển. Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [18]. Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus. Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [49], [50]. 13
Hình 1.4. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ (Nguồn: http://www.impe-qn.org.vn/impe- qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194) 1.2. Kháng nguyên HA Hemagglutinin hay Haemagglutinin là glycoprotein kháng nguyên tìm thấy trên bề mặt của virus cúm cũng như nhiều vi khuẩn và virus khác. Nó có tác dụng gắn virus vào tế bào bị nhiễm. Tên gọi của HA bắt nguồn từ việc protein HA có khả năng ngưng kết hồng cầu (hem: bao vây). 16 loại kháng nguyên HA khác nhau được đánh dấu từ 1 đến 16. H16 mới được phát hiện ở virus phân lập từ mòng biển đầu đen tại Thuỵ Điển và Na Uy năm 2005 [15]. Ba loại protein HA đầu tiên (H1, H2 và H3) được tìm thấy phổ biến ở virus cúm người [43]. 14
Cấu trúc: HA là một glycoprotein màng tạo thành từ 3 tiểu phần giống hệt nhau. Nó có hình trụ, dài khoảng 135 Ǻ. 3 monomer tạo thành lõi xoắn alpha ở giữa; 3 đầu hình cầu chứa vị trí gắn sialic acid. Những monomer HA được tổng hợp, glycosyl hoá, rồi cắt thành hai chuỗi polypeptide nhỏ hơn: HA1 và HA2. Mỗi monomer bao gồm một chuỗi xoắn dài Hình 1.5. Mô hình cấu trúc protein 3 chiều của HA HA2 neo bám vào màng virus (Nguồn:http://vi.wikipedia.org/wiki/Hemagglutinin) và một hạt HA1 lớn ở đầu [51]. Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704 - 1707 bp). Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzym protease, và đây là vùng quyết định độc lực của virus [19], [30]. Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Dal (nếu không được glycosyl hóa) và 77.103 Dal (nếu được glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.103 Dal và HA2 là 29.103 Dal) [40], [46]. Chức năng: Cho phép nhận biết tế bào đích của động vật có xương sống và hoàn thành quá trình nhận biết bằng cách gắn kết với thụ thể chứa sialic acid của những tế bào này; và cho phép đưa bộ gen của virus vào tế 15
bào đích bằng cách hợp nhất màng endopisome của tế bào chủ với vỏ ngoài virus [52]. Cơ chế hoạt động: HA gắn kết với phân tử glycoprotein trên bề mặt của tế bào đích, dẫn đến các phân tử virus kết dính với tế bào vật chủ. Màng tế bào sẽ bao bọc lấy virus và phần màng này sẽ tách ra hình thành một màng mới nằm trong tế bào gọi là endosome, endosome chứa virus được bao gói. Tế bào sau đó bắt đầu cố gắng phân giải những thành phần bên trong endosome bằng cách acid hoá phần bên trong nó và biến nó thành một lysosome (thể sinh tan). Tuy nhiên, ngay khi pH trong endosome xuống 6.0, cấu trúc vốn được gấp lại của phân tử HA trở nên không bền, mở ra một phần và giải phóng một chuỗi peptide rất kị nước nằm trong phân tử protein. Chuỗi fusion protein này hoạt động như một mỏ neo, gắn vào màng của endosome và khoá lại. Sau đó, ở pH thấp hơn, phần còn lại của HA sẽ gấp lại hình thành một cấu trúc mới, rút mỏ neo lại và kéo màng endosome vào sát màng virus rồi hợp nhất hai màng này. Ngay lúc này, các thành phần của virus, bao gồm RNA genome, tự do hoà vào tế bào chất [43]. 1.3. Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 1.3.1. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay và phát sinh nhiều dưới dòng (sublineage) và nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực rất cao [36], [53]. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Có thể gọi cúm A/H5N1 phân lập năm 1959 16
tại Scotland là virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-Ck-Scotland- (59)(H5N1) (số đăng ký: X07869). Từ đó cho đến nay, H5 và N1 đã có thay đổi lớn xét về cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch [37]. Sau gần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông (1996), và Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh. Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003 đến nay, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1 trước đây [38], [57], [72]. Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế giới đã có hàng trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và kinh tế. Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1, mỗi năm một cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243 trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11%. Việt Nam và Indonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 trên thế giới. Tính gây bệnh của A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến. Hàng ngàn công trình nghiên cứu về cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt trong 5 năm gần đây, trong đó có phát triển công nghệ và các loại vaccine gây miễn dịch cho gia cầm và chuẩn bị đối phó với đại dịch có thể xảy ra ở người. 17
Virus cúm A/H5N1 có 3 trong 4 tính chất cần có để tạo một đại dịch: có khả năng lây nhiễm trên người, gần như tất cả mọi người đều chưa có đáp ứng miễn dịch bảo vệ và virus có khả năng gây chết cao. Trong số 16 nước có người chết do cúm gia cầm, Inonesia và Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúm A/H5N1 có được các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người. Không giống như dịch cúm A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2002, có thể khống chế bằng cách tiệu diệt và loại trừ loài gia cầm trong vùng dịch để cắt đứt nguồn lây. Cúm A/H5N1 thể độc lực cao giai đoạn 2003 đến nay, với sự xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan truyền từ Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới, đây vẫn là thách thức đối với cộng đồng và cần nghiên cứu ứng dụng các phương pháp khác nhau để khống chế sự lây truyền một cách có hiệu quả. Theo số liệu thống kê năm 2006, virut cúm gia cầm đã làm số người chết ở Indonesia 45 người, Trung Quốc là 8 người, Thái Lan là 3 người, và cho đến nay, chủng A/Vietnam/1203/2004 (Viet04) là một trong những chủng có độc tính cao nhất ở động vật có vú, như chồn và chuột. Trước tình hình lây lan của dịch cúm A/H5N1. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu như: Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi gen giúp xác định phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen [35], [44]. Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam 18
cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc [35]. Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông [35]. Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông. Các chủng phân lập những năm 2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hồng Kông [21], [45]. Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch [1]. Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân type HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Phát hiện nhanh H5N1 và các phân type khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử đã được xây dựng thành phương pháp [70]. Nghiên cứu vaccine và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam [1]. 19
Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ sinh học được giao đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm” và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” trong giai đoạn 2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương (VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung ương II (NAVETCO), Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccine sản xuất từ chủng NIBRG-14 [2]. 1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới Trong tự nhiên, “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” là các hiện tượng xảy ra liên tục theo thời gian, còn “trộn kháng nguyên” tái tổ hợp subtype Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) thường định kỳ xảy ra giữa các loài mắc nhằm tạo nên các biến thể virus cúm mới mà hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ không có khả năng nhận dạng đáp ứng và kịp hình thành miễn dịch. H5N1 sử dụng thụ thể sialic xâm nhập tế bào [71]. Hemagglutinin cùng với protein enzyme neuraminidase, được xác định là protein có vai trò kháng nguyên và độc lực [62] và các protein kháng nguyên có nguồn gen từ các chủng H5N1 của Việt Nam, cũng được nghiên cứu sản xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp và sử dụng với các mục đích khác nhau, trong đó có thử nghiệm làm kháng nguyên kích thích miễn dịch và chẩn đoán. Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người [36]. Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng 20