Luận văn : HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α part 3

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

147
lượt xem 33
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính. Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thiết...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α part 3

35 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính. Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase I large fragment (Klenow). Phản ứng tạo đầu bằng Đầu bằng Đầu dính Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau: 2µl NEbuffer 10X DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl 1 unit (1µl) DNA fragment Klenow Thêm nƣớc cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút. Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid Plasmid sau khi cắt bằng HindIII, và thực hiện phản ứng phủ đầu bằng theo qui trình sau: 2µl NEbuffer 10X 6µl (1µg) DNA plasmid dNTPs (33µmol) 1µl
36 1 unit (1µl) DNA fragment Klenow Thêm nƣớc cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) T4 DNA ligase không giống nhƣ E. coli DNA ligase, nó có thể xúc tác phản ứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych 1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ enzym ligase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10. Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng ligation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ ligase giảm xuống và không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra. Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn Tỉ lệ DNA chèn (bp) Vector (ng) x DNA chèn (kb) (ng)DNA chèn = X Vector (kb) Vector Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra lƣợng DNA cần sử dụng Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau: 1µl T4 reaction buffer DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng) 1µl (50ng) DNA plasmid T4 ligase 1 unit Thêm nƣớc cho tới 10µl Ủ phản ứng ở 160C qua đêm, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer.
37 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) Thực hiện biến nạp theo quy trình sau: - Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. - Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ). - Quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri, bắt những khuẩn lạc trắng cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ. Thực hiện biến nạp theo quy trình trên plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng. Bắt những khuẩn lạc xanh cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ. Thực hiện tách chiết plasmid theo qui trình ở mục 3.4.6.1.
38 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn B A C Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5 (A) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 10:1.5 phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10 µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100 µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C.
39 A B C D Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5 (A)Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1giờ, cấy 10 µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X - gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (D) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200 µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X - gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C.
40 Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 2 (ở thể tích biến nạp là 3:0.5, và dịch biến nạp đã pha loãng ½ khi trang lên đĩa) cho kết quả tốt hơn chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 1 (ở thể tích biến nạp 3:0.5, và dịch biến nạp không pha loãng khi trang lên đĩa) và chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 3 (ở thể tích biến nạp là 10:1.5). Biến nạp theo quy trình 1 cho kết quả chỉ vài khuẩn lạc xanh xuất hiện và có rất nhiều khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng. Điều này có thể giải thích là do trong quá trình làm thí nghiệm đã có một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với kháng sinh hoặc là do thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa nên các tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân hủy vì vậy chỉ cho khuẩn lạc trắng hoặc tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen LacZ diễn ra chậm (đối với khuẩn lạc này khi quan sát kỹ sẽ thấy màu xanh nhạt). Kết quả biến nạp theo quy trình 2 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và khuẩn lạc trắng ít hơn rất nhiều so với biến nạp theo quy trình 1. Nhƣ vậy cho thấy quy trình 2 hiệu quả biến nạp tốt hơn và thể tích biến nạp nhƣ vậy là hợp lí. Khuẩn lạc mọc rời rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng nhân sinh khối để li trích đƣợc plasmid. Kết quả biến nạp theo quy trình 3 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và cũng cho nhiều khuẩn lạc trắng hơn so với biến nạp theo quy trình 2. Khuẩn lạc xanh tuy nhiều nhƣng mọc dày rất khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh trong môi trƣờng lỏng. Nhƣ vậy, qua kết quả chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng LB agar/Amp/X- gal/IPTG chúng tôi thấy biến nạp theo quy trình 2 là thích hợp. 4.2 Tách chiết DNA plasmid. 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng đĩa và tiến hành cấy sang ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc ở 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
41 DNA DNA genome plasmid 3.0kb Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1) Kết quả tách chiết plasmid lần 1 còn lẫn rất nhiều DNA của genome vi khuẩn. Có thể điều này là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính. DNA plasmid Hình 4.4 Sản phẩm tách 3.0kb chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2) Với nhận định trên tôi đã tiến hành tách chiết plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Nhờ khắc phục những sai sót của lần 1 kết quả của lần tách chiết này cho thấy đã loại đƣợc DNA của genome, thu đƣợc plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hóa chất sử dụng đơn giản. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp.
42 Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid Khi thêm dung dịch II chỉ đảo ngƣợc eppendorf khoảng 5-6 lần sau đó phải thêm dung dịch III ngay để trung hòa dung dịch II. Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen. Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới. 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit Tách chiết plasmid bằng Kit cho hiệu quả tách chiết cao hơn, lƣợng plasmid thu đƣợc nhiều hơn, tinh sạch hơn, thao tác đơn giản, nhanh. Sản phẩm tách chiết không cần phải qua bƣớc tinh sạch để sử dụng cho các bƣớc tiếp theo trong quá trình cloning. Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit DNA plasmid trên gel agarose 1% 3.0kb 4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV DC1 EcoRV 1 DC2EcoRV 2 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1) (DC1) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 1) sản phẩm cắt đươc bằng enzyme EcoRV; (DC2) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 2) sản phẩm không cắt được bằng EcoRV.
43 Kết quả ở hình trên cho thấy plasmid đã cắt hoàn toàn đúng kích thƣớc, vector đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS trở thành dạng thẳng, nhƣng chỉ có sản phẩm tách chiết plasmid ở mẫu đối chứng 1 là đƣợc cắt. Do đó chúng tôi tiến hành phản ứng cắt lần 2 để kiểm tra hoạt tính cắt của enzyme EcoRV thu đƣợc kết quả nhƣ sau: DC 1 2 3 4 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2) (DC): sản phẩm đã cắt bằng EcoRV ở lần 1; (1), (2): sản phẩm cắt bằng EcoRV; (3), (4): sản phẩm cắt bằng RsaI. Mẫu (1) và (2) sản phẩm tách chiết plasmid đã không bị cắt bởi enzyme EcoRV trong khi mẫu (3), (4) đƣợc cắt hoàn toàn. Vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với enzyme HindIII để kiểm tra sản phẩm tách chiết có phải là plasmid mong muốn hay không thì thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 2 DC 3 1 DC DC DC 2 1 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% bằng HindIII trên gel agarose 1% (1), (2), (3): sản phẩm cắt bằng (1), (2): sản phẩm cắt bằng HindIII; HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết (DC): sản phẩm tách chiết plasmid. plasmid.
44 Plasmid đã cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kích thƣớc của plasmid đối chứng. Do đó có thể suy ra rằng, trong quá trình làm thí nghiệm plasmid đã bị hƣ site cắt EcoRV trên vùng MCS hoặc enyme EcoRV bị giảm hoạt tính nên không thể nhận biết đƣợc vị trí site cắt EcoRV trên vùng MCS. Vì vậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi quyết định chọn sản phẩm cắt bằng HindIII, phủ đầu bằng để thực hiện phản ứng nối. Một số điều cần chú ý khi thực hiện phản ứng cắt RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn đƣợc bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trƣớc khi cất trở lại vào -200C. Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme. 4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA Trong đề tài này, chúng tôi thực hiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA sau đó tinh sạch đoạn DNA trên. Kết quả điện di cho thấy quá trình tinh sạch đã loại hết các thành phần tạp trong sản phẩm PCR. Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel. Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzyme Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể kiểm tra khi đã chèn vào đƣợc plasmid và biến nạp vào vi khuẩn.
45 Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX (1): sản phẩm PCR kích thước 223bp; (1), (2): sản phẩm PCR kích thước (2), (3): sản phẩm PCR kích thước 900bp; (3): ladder 100bp. 900bp. Một số điều cần lƣu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi cân, sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar). Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới. Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu và giữ trong buffer. 4.4.2 Tinh sạch plasmid Plasmid sau khi dùng enzyme HindIII cắt mở vòng mới tinh sạch. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản phẩm.
46 DC TS Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1% (DC) plasmid cắt bằng HindIII chưa tinh sạch; (TS) plasmid cắt bằng HindIII tinh sạch bằng cột GFX. Từ sản phẩm trên tiến hành phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid và tinh sạch lại bằng qui trình tinh sạch sử dụng RNAse. Sau đó tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối. 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp Thực hiện phản ứng phủ đầu bằng cho sản phẩm PCR và plasmid sau khi cắt HindIII, tinh sạch sản phẩm, nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid. Biến nạp plasmid đã nối này vào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp,và thực hiện tƣơng tự với plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Cả hai trƣờng hợp biến nạp đọan DNA 900bp và 223bp đều cho toàn khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng LB agar/Amp/X-gal/IPTG. A B C Hình 4.13 Biến nạp plasmid tái tổ hợp (A) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 223bp; (B) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 900bp; (C) Biến nạp plasmid chưa tái tổ hợp.
47 Kết quả trên có thể là đã biến nạp hoàn toàn plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn hoặc những khuẩn lạc màu trắng trên là do các tế bào vi khuẩn bị đột biến kháng kháng sinh tạo thành. Còn trên đĩa đối chứng xuất hiện cả khuẩn lạc màu xanh và trắng. 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp Chọn lọc những khuẩn lạc trắng, mọc rời rạc cấy sang môi trƣờng LB lỏng/ampicillin (60µg) nhân sinh khối qua đêm tiến hành tách chiết theo qui trình ở mục 3.4.6.1. Chạy điện di chỉ thu đƣợc toàn genome của vi khuẩn. Còn kết quả li trích plasmid của khuẩn lạc xanh trên đĩa đối chứng thì thu đƣợc DNA plasmid. Nhƣ vậy biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α chƣa thành công. Điều này có thể là do nồng độ plasmid sau khi cắt và nối sử dụng để biến nạp là chƣa phù hợp, vì chúng tôi đã không thể tính toán đƣợc nồng độ plasmid hao hụt sau khi thực hiện phản ứng cắt và nối. Hoặc cũng có thể thời gian sốc nhiệt quá ngắn nên plasmid không thể biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Do đó, trong quá trình phủ đầu bằng cho đoạn DNA và plasmid phải luôn chú ý cẩn thận tính toán các thành phần trong phản ứng cho phù hợp. Còn trong quá trình thiết lập phản ứng nối phải chú ý đến việc tính toán tỉ lệ thể tích giữa vector và đoạn DNA, nhiệt độ ủ của phản ứng sao cho phù hợp và nên thêm các chất xúc tác cho phản ứng nối nhƣ: PEG hay Hexamminecobalt chloride. Biến nạp vào vi khuẩn nên sốc nhiệt ở thời gian lâu hơn, thử nghiệm nhiều qui trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt và kèm theo đối chứng. Vì thời gian giới hạn chúng tôi đã không thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau nên đã không cho ra đƣợc kết quả nhƣ mong muốn.
48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: - Hoàn thiện quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phƣơng pháp hóa học, tế bào khả nạp có thể tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng. - Hoàn thiện đƣợc quy trình biến nạp plasmid pBluescript SK(+/-) vào vi khuẩn E. coli DH5α và chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng chứa Ampicillin/X-gal/IPTG. - Đã đƣa ra quy trình tách chiết plasmid chuẩn bằng phƣơng pháp SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần. Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ. Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
49 Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -200C trong 1 giờ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Tùy lƣợng mẫu mà thêm vào. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. - Đã thiết lập đƣợc phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn để kiểm tra kết quả tách chiết. 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện các quy trình cắt bằng HindIII, nối đoạn DNA từ phản ứng PCR vào plasmid pBluescript SK(+/-) và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. - Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sản phẩm nối giữa plasmid pBluescript SK(+/-) đã cắt bằng HindIII và đoạn DNA từ phản ứng PCR, giải trình tự sản phẩm nối trên.
50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục. 2. Lê Đình Lƣợng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật. 3. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh và Cao Cƣờng, 2002, Công nghệ gen, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005, Sinh học phân tử - Giới thiệu phương pháp và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM. 5. Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005, Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α, Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 6. Phạm Thành Hổ, 8-2003, Di truyền học, NXB Giáo Dục. 7. Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp và Nguyễn Thúy Hƣơng, 1999, Vi sinh vật học đại cương, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 8. Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo và Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM 29 trang. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài. 9. T.A. Brown, 1997 , Gen cloning an introduction , third edition, Chapman & Hall. 10. Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan. 11. Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH. 12. Sambrook J, E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH. 13. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Engineering Techniques. Các website http://www.protocol-online.org/prot/Mmolecular_Biology/ http://brahms.chem.uic.edu/~cgpage/protocol/cloning.html
51 http://core.eai.edu/biol/foruvellm/farwelebpage/Biotech3100/pvector.200.pfd http://bioprotocol.endlex.com/protocols/lygation.html
52 PHỤ LỤC 1. Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm  Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút  Môi trƣờng LB agar Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút.  Môi trƣờng LB + Ampicillin Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút, sau đó để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillin nồng độ cuối 100µg/ml  Môi trƣờng LB + Ampicillin + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coli) Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào mỗi đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillin, dùng que trang, trang đều trên đĩa, để cho mặt thạch khô. Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đều trên đĩa và để cho khô mặt thạch
53 2. Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid Dung dịch I Tris – HCl 25mM pH8 Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng) 100 µl Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 40µl NaOH 5N Nƣớc cất 2 lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol trong TAE 1X 40% Dung dịch Lysozyme: Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0. Dung dịch X-gal 20mg/ml Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác) Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock) Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,2μm
54 Dung dịch kháng sinh Ampicillin 100mg/ml Cân 100mg ampicillin dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,45μm. 3. Các loại buffer  Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM  NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer của enzym DNA polymerase I large fragment) NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM  Ligation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM 660μM ATP