Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể sau khi tiêm vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do E. coli gây ra ở lợn

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:66

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu chứng minh được tính khả thi trong việc phòng bệnh do E. coli trong hội chứng tiêu chảy bằng cách sử dụng vắc xin tái tổ hợp. Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do E. coli gây ra ở lợn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể sau khi tiêm vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do E. coli gây ra ở lợn

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân và sự giúp đỡ chân tình của các anh, chị bộ môn Miễn dịch học và vắc xin - Viện Công Nghệ Sinh Học – Đại học Huế. Các số liệu, hình ảnh và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Thành PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt 2 năm học tập, với sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, đến nay luận văn của tôi đã được hoàn thành. Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban Giám hiệu, quý thầy cô Khoa Chăn nuôi - Thú y, Phòng Đào tạo sau đại học của Trường Đại học Nông - Lâm Huế đã giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu khoa học. Lãnh đạo Trung tâm Giống vật nuôi Quảng Bình, Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin - Viện công nghệ sinh học – Đại Học Huế đã cho phép, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu này. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS. TS. Đinh Thị Bích Lân, cô đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân cùng bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài. Cuối cùng xin kính chúc tất cả mọi người thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành công! Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Thành PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài đã đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể ở lợn sau khi tiêm vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do E. coli gây ra ở lợn. Lợn nái được tiêm vắc xin vào thời điểm trước khi phối giống và ngày mang thai thứ 90, kiểm tra kháng thể trong sữa đầu và huyết thanh (trước khi tiêm vắc xin và tại thời điểm nái sinh con). Kết quả ELISA cho thấy vào thời điểm trước khi tiêm vắc xin, lượng kháng thể kháng kháng nguyên bám dính E. coli trong huyết thanh lợn nái rất thấp, giá trị OD450 chỉ đạt 0,330 ± 0,048). Vào thời điểm nái sinh con, hàm lượng kháng thể trong huyết thanh và sữa đầu tăng rất cao, giá trị OD450 của kháng thể trong huyết thanh đạt 0,876 ± 0,045, còn trong sữa đầu là 1,956 ± 0,445. Kiểm tra kháng thể thụ động ở lợn con sinh ra từ các nái được tiêm vắc xin cho thấy lượng kháng thể trong huyết thanh lợn con vào thời điểm 7 ngày tuổi có giá trị OD450 = 0.734 ± 0,029, sau đó giảm dần, đến thời điểm 28 ngày tuổi, lượng kháng thể trong huyết thanh của lợn con còn rất thấp (có giá trị OD450 là 0,329 ± 0,012). Để đánh giá đáp ứng miễn dịch chủ động ở lợn con, chúng tôi tiến hành tiêm cho lợn 2 mũi vắc xin lúc 35 và 49 ngày tuổi, lấy máu 2 tuần 1 lần để kiểm tra lượng kháng thể. Kết quả ELISA cho thấy, sau mũi tiêm thứ nhất lượng kháng thể giảm nhanh. Vào ngày tuổi 49 (sau mũi tiêm thứ nhất 2 tuần) lượng kháng thể chỉ cho giá trị OD450 là 0,136 ± 0,024. Tuy nhiên sau khi sau mũi tiêm thứ 2, lượng kháng thể tăng cao và kéo dài, giá trị OD450 của kháng thể vào thời điểm 63 ngày tuổi là 0,980 ± 0,142, sau đó giảm dần và kéo dài đến ít nhất 119 ngày tuổi (0,457 ± 0,038). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy lợn con của lợn nái được tiêm 2 mũi vắc xin E. coli tái tổ hợp ít bị tiêu chảy do E. coli hơn là lợn con của nái không được tiêm vắc xin E. coli tái tổ hợp. Điều này chứng tỏ vắc xin có hiệu quả cao trong phòng bệnh do E. coli. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii TÓM TẮT LUẬN VĂN ........................................................................................... iii MỤC LỤC .................................................................................................................iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................. viii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ix DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................x MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI .....................................................................................2 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ............................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................. 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................... 3 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ E. COLI GÂY BỆNH Ở LỢN .......................3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở trong nước .................................................................. 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ................................................................. 4 1.2. VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI..................................................................... 5 1.2.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................5 1.2.2. Đặc tính sinh hóa ..............................................................................................5 1.2.3. Đặc tính nuôi cấy ..............................................................................................6 1.2.4. Sức đề kháng .................................................................................................... 7 1.2.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli ....................................................7 1.2.6. Phân loại............................................................................................................ 8 1.3. TÍNH MIỄN DỊCH..............................................................................................9 1.4. YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA E. COLI .................................................................. 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v 1.4.1. Độc tố ruột ...................................................................................................... 10 1.4.2. Nhóm độc tố tế bào.........................................................................................12 1.4.3. Độc tố Stx2e ................................................................................................... 13 1.5. CÁC KHÁNG NGUYÊN BÁM DÍNH CỦA E. COLI .................................... 14 1.5.1. Kháng nguyên bám dính F4 ........................................................................... 14 1.5.2. Kháng nguyên bám dính F18 ......................................................................... 16 1.5.3. Kháng nguyên bám dính F5 ........................................................................... 18 1.5.4. Kháng nguyên bám dính F6 ........................................................................... 18 1.5.5. Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bám dính để sản xuất vắc xin ................ 19 1.6. BỆNH DO E. COLI GÂY RA Ở LỢN .............................................................20 1.6.1. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli ............................................................20 1.6.2. Triệu chứng..................................................................................................... 21 1.6.3. Bệnh tích ......................................................................................................... 21 1.6.4. Chuẩn đoán ..................................................................................................... 22 1.7. PHÒNG BỆNH ................................................................................................. 23 1.7.1. Phòng bệnh bằng các chế phẩm sinh học .......................................................23 1.7.2. Phòng bệnh bằng kháng sinh .......................................................................... 23 1.7.3. Phòng bệnh bằng vắc xin................................................................................ 23 1.8. PHƯƠNG PHÁP ELISA ...................................................................................24 1.8.1. Khái niệm ....................................................................................................... 24 1.8.2. Các phương pháp ELISA thường dùng ..........................................................25 1.9. VẮC XIN ........................................................................................................... 25 1.9.1. Lịch sử ra đời của vắc xin .............................................................................. 25 1.9.2. Định nghĩa ...................................................................................................... 26 1.9.3. Đặc tính cơ bản của một vắc xin .................................................................... 26 1.9.4. Các loại vắc xin ..............................................................................................27 1.9.5. Thành phần của vắc xin ..................................................................................28 1.9.6. Nguyên lý ....................................................................................................... 29 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi 1.9.7. Một số điều cần chú ý khi sử dụng vắc xin ....................................................29 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................................34 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 34 2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ..................................................34 2.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................................................34 2.3.1. Vắc xin ............................................................................................................ 34 2.3.2. Hóa chất .......................................................................................................... 34 2.3.3. Dụng cụ và thiết bị .........................................................................................35 2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 35 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................... 35 2.5.1. Phương pháp lấy mẫu và tách huyết thanh .....................................................35 2.5.2. Nghiên cứu đáp ứng kháng thể chủ động ở lợn nái sau khi tiêm vắc xin E. coli tái tổ hợp. ........................................................................................................... 36 2.5.3. Nghiên cứu đáp ứng kháng thể thụ động ở lợn con sinh ra từ lợn nái được tiêm vắc xin E. coli tái tổ hợp...................................................................................36 2.5.4. Nghiên cứu đáp ứng kháng thể chủ động ở lợn con sau cai sữa khi tiêm phòng vắc xin E. coli tái tổ hợp. .............................................................................. 36 2.5.5. Theo dõi tỷ lệ tiêu chảy của lợn con theo mẹ sau khi tiêm phòng vắc xin E. coli tái tổ hợp. ........................................................................................................... 37 2.5.6. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc xin E. coli tái tổ hợp đối với lợn sau cai sữa. ............................................................................................................................37 2.5.7. Phương pháp ELISA gián tiếp ....................................................................... 37 2.5.8. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 39 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ CHỦ ĐỘNG Ở LỢN NÁI SAU KHI TIÊM VẮC XIN E. COLI TÁI TỔ HỢP ................................................................. 39 3.2. ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ THỤ ĐỘNG Ở LỢN CON SINH RA TỪ LỢN NÁI ĐƯỢC TIÊM VẮC XIN E. COLI TÁI TỔ HỢP............................40 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii 3.3. ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ CHỦ ĐỘNG Ở LỢN CON SAU CAI SỮA KHI TIÊM PHÒNG VẮC XIN E. COLI TÁI TỔ HỢP ................................42 3.4. THEO DÕI TỶ LỆ TIÊU CHẢY CỦA LỢN CON THEO MẸ SAU KHI TIÊM PHÒNG VẮC XIN E. COLI TÁI TỔ HỢP ..................................................43 3.5. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC XIN E. COLI TÁI TỔ HỢP ĐỐI VỚI LỢN SAU CAI SỮA ...............................................................................45 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................46 4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 46 4.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................47 PHỤ LỤC .................................................................................................................55 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AEEC : Adhesive Enteropathogeneic E. coli Ci : Simmons’ Citrate Cs : Cộng sự DAEC : Diffusely adherent E. Coli EIEC : Enteroinvasive E. coli EMB : Methylene Blue ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay ETEC : Enterotoxigenic Escherichia coli EPEC : Enteropathogeneic E. Coli F : Kháng nguyên Fimbriae KIA : Kligler Iron Agar LT : Heat Labile Toxin MC : MacConkey MR : Methyl Red ST : Heat Stable Toxin VTEC : Verotoxigeneic E. coli VP : Proskauer PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả ELISA đánh giá đáp ứng miễn dịch ở lợn nái sau khi được tiêm vắc xin E. coli tái tổ hợp ......................................................... 39 Bảng 3.2. Tỷ lệ tiêu chảy ở lợn con theo mẹ.................................................... 44 Bảng 3.3. Theo dõi tỷ lệ tiêu chảy của nhóm lợn được tiêm và không tiêm vắc xin ................................................................................................... 45 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Đáp ứng miễn dịch ở lợn nái được tiêm vắc xin E. coli tái tổ hợp ......... 40 Hình 3.2. Kết quả ELISA đánh giá đáp ứng kháng thể thụ động của lợn con sinh ra từ lợn nái được tiêm vắc xin E. coli tái tổ hợp ........................................ 41 Hình 3.3. Đáp ứng kháng thể chủ động ở lợn cai sữa được tiêm vắc xin E. coli tái tổ hợp ............................................................................................................ 42 Hình 3.4. Tỷ lệ tiêu chảy ở lợn con .......................................................................... 43 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi ngày càng có vị trí hết sức quan trọng trong cơ cấu của ngành nông nghiệp. Sản phẩm của ngành chăn nuôi là nguồn thực phẩm không thể thiếu được đối với nhu cầu đời sống con người. Chủ trương hiện nay của Nhà nước là phát triển ngành chăn nuôi thành ngành sản xuất hàng hóa thực sự nhằm tạo ra sản phẩm chăn nuôi có chất lượng cao phục vụ cho nhu cầu tiêu thụ trong nước và một phần cho xuất khẩu. Nói đến ngành chăn nuôi phải kể đến chăn nuôi lợn bởi tầm quan trọng và ý nghĩa thiết thực của nó đối với đời sống kinh tế xã hội của nhân dân. Chăn nuôi lợn đã góp phần giải quyết công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo, tăng thu nhập và là cơ hội làm giàu cho người dân. Tuy vậy, nghành chăn nuôi lợn cũng chịu ảnh hưởng rất lớn của tình hình dịch bệnh đặc biệt là hội chứng tiêu chảy ở lợn. Bệnh xảy ra ở phần lớn các trang trại chăn nuôi lợn khắp nơi trên thế giới và được cho là nguyên nhân gây tổn thất kinh tế trầm trọng nhất trong chăn nuôi lợn. Có nhiều tác nhân truyền nhiễm gây tiêu chảy ở lợn con và một trong những tác nhân quan trọng nhất đó là Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). ETEC là nhóm vi khuẩn E. coli đóng vai trò gây bệnh tiêu chảy rất quan trọng ở trẻ em dưới 5 tuổi cũng như bê non và lợn con, nhất là trong các trang trại chăn nuôi tập trung. Vi khuẩn E. coli gây bệnh thông qua 2 yếu tố độc lực chính là kháng nguyên bám dính và độc tố đường ruột (Zhang và cs, 2007). Kháng nguyên bám dính giúp tế bào vi khuẩn bám và xâm nhập vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột vật chủ và sau đó là tiết độc tố đường ruột. Các độc tố này làm thay đổi cân bằng nước và chất điện giải ở tế bào niêm mạc ruột vật chủ gây nên tiêu chảy (Gyles và Fairbrother, 2010). Việc sử dụng kháng sinh để điều trị tuy có hiệu quả nhưng gây ảnh hưởng lớn đến hệ vi sinh vật đường ruột, lợn con chậm lớn cũng như tạo ra các chủng vi sinh vật đề kháng kháng sinh không những ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng mà còn ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh sau này. Do đó việc sử dụng vắc xin để phòng ngừa tiêu chảy ở lợn là cần thiết nhằm bảo vệ vật nuôi, nâng cao năng suất và chất lượng thịt theo yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về thực phẩm sạch, an toàn và chất lượng để bảo vệ sức khỏe cho con người. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2 Trên thị trường hiện nay có nhiều loại vắc xin phòng tiêu chảy trên đàn lợn nhưng chủ yếu là vắc xin vô hoạt, mặc dù những vắc xin này khi tiêm phòng đã có những kết quả nhất định, tuy nhiên đáp ứng miễn dịch còn chưa cao và các phản ứng phụ dễ xảy ra. Vắc xin tái tổ hợp được tạo ra bằng cách loại bỏ các yếu tố gây bệnh của vi sinh vật nhưng vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên của chúng, cùng với đó là sự an toàn, ít tác dụng phụ nên được các nhà khoa học quan tâm. Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế đã chế tạo thành công vắc xin E. coli tái tổ hợp và vắc xin đã được đánh giá trong việc phòng bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli ở lợn. Tuy vậy, vắc xin E. coli tái tổ hợp vẫn chưa được sử dụng rộng rãi tại các địa phương. Xuất phát từ những vấn đề trên tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể sau khi tiêm vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do E. coli gây ra ở lợn”. 2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do E. coli gây ra ở lợn. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu chứng minh được tính khả thi trong việc phòng bệnh do E. coli trong hội chứng tiêu chảy bằng cách sử dụng vắc xin tái tổ hợp. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Chế tạo vắc xin tái tổ hợp giúp điều trị hiệu quả bệnh tiêu chảy ở lợn, giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trong điều trị, tránh hiện tượng tồn dư kháng sinh đồng thời góp phần bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ E. COLI GÂY BỆNH Ở LỢN 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở trong nước Ở Việt Nam, vai trò gây bệnh tiêu chảy do E. coli ở lợn đã xuất hiện đã được khẳng định trong nghiên cứu của Đào Trọng Đạt và cs (1995). Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn E. coli đã được nhiều tác giả nghiên cứu như Lý Thị Liên Khai (2001), Lê Văn Dương và cs, (2010). Đỗ Ngọc Thúy và cs, (2004) cho biết vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy thường mang kháng nguyên F4, F18, độc tố đường ruột STb là chủ yếu và thuộc các nhóm O149, O139, O138, O141, O1, O86, O111, O55, O26, O8, O64. Các yếu tố gây bệnh thường gặp là F4/STb/LT, F4/STa/STb, F4/Sta/STb/LT, F18/Sta/STb/LT, F18/Sta/STb, F18/Sta/LT. Nghiên cứu của Hồ Soái và Đinh Thị Bích Lân (2005), cho thấy kết quả kiểm tra độc lực 5 chủng E. coli từ phân lợn bị tiêu chảy ở Quảng Trị cho thấy 4 chủng gây chết 100% chuột, chiếm tỷ lệ 80% và 1 chủng gây chết 50% chuột, chiếm tỷ lệ 20%. Cùng thời gian đó, tác giả Trương Quang (2005), khi tiến hành kiểm tra độc lực của 30 chủng E. coli phân lập được từ phân của lợn 1 đến 60 ngày tuổi bị tiêu chảy cho kết quả như sau: 27 chủng E. coli (chiếm 90%) giết chết 100% số chuột thí nghiệm và 3 chủng (chiếm 10%) giết chết 50% số chuột thí nghiệm sau thời gian từ 24-72 giờ. Một nghiên cứu khác của Vũ Khắc Hùng và cs, (2015) đã tiến hành nghiên cứu chế tạo thành công vắc xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và và phó thương hàn lợn. Kết quả nghiên cứu lợn sau khi tiêm vắc xin với thành phần kháng nguyên Salmonella và E. coli đều có tác dụng bảo hộ tốt, đạt tiêu chuẩn cơ sở. Bằng phương pháp PCR, Vũ Khắc Hùng và cs, (2005) xác định được tỷ lệ sinh độc tố STa, LT và VT2a lần lượt là 24%, 20%, 4,5% từ 216 chủng lợn con sau cai sữa. Phần lớn các chủng sinh độc tố đều mang yếu tố bám dính. Đỗ Ngọc Thúy và cs, (2002) đã xác định đặc tính kháng nguyên và vai trò gây bệnh của E. coli gây tiêu chảy ở lợn cho thấy, trong tổng số 170 chủng được kiểm tra, các chủng có mang tổ hợp các yếu tố gây bệnh F4/STa/STb/LT và thuộc serotype kháng nguyên O149, K91 là phổ biến nhất. Các chủng đại diện cho tổ hợp PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
4 các yếu tố gây bệnh và serotype kháng nguyên O đều biểu hiện đặc tính gây bệnh invitro và invivo điển hình. Theo Lý Thị Liên Khai (2001) khi phân lập E. coli từ phân lợn con bị tiêu chảy và phân lợn con khỏe mạnh đã cho biết các chủng E. coli mang K88, K99 và 987P là nguyên nhân chính gây tiêu chảy cho lợn con từ 1 đến 2 tuần tuổi. Vi khuẩn E. coli thường xuyên cư trú trong ruột lợn và chúng chỉ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi như: Tác động stress làm giảm sức đề kháng của lợn, làm tăng số lượng vi khuẩn và sinh độc tố. Tạ Thị Vịnh và cs, (1996) đã chiết xuất thành công chế phẩm gamma globulin từ huyết thanh ngựa để điều trị dự phòng cho lợn con tiêu chảy. Cũng trên cơ sở nghiên cứu căn cứ vào nguyên nhân và quá trình diễn biến của bệnh đặc biệt tập trung vào quá trình nhiễm khuẩn bội nhiễm, các tác giả đã đưa ra hàng loạt các giải pháp gồm nhiều sinh phẩm khác nhau nhằm mục đích phòng bệnh tiêu chảy. Nguyễn Thị Nội (1986) nghiên cứu sử dụng vắc xin E. coli tiêm phòng cho nái chửa, đã dựa vào kết quả xác định tần xuất của các serotype O trong số chủng E. coli gây bệnh phân lập được, từ đó chọn một số serotype có tần số xuất hiện cao nhất để chế vắc xin. Dùng các loại vắc xin tiêm phòng cho lợn mẹ 2 lần vào lúc 6 và 12 tuần tuổi trước khi đẻ để tạo kháng thể truyền qua sữa đầu, bảo vệ lợn con trong một vài tuần lễ đầu sau khi sinh. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn E. coli. Các kết quả nghiên cứu đã khẳng định được vai trò vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con (Gyles và Fairbrother, 2010). Hiện nay các nghiên cứu tập trung xác định cấu trúc phân tử và các đặc tính sinh học của yếu tố bám dính, độc tố (Smeds và cs, 2001; Zhang và cs, 2007), sử dụng kháng nguyên bám dính và độc tố để sản xuất vắc xin phòng bệnh (Tiels và cs, 2008; Verdonck và cs, 2004). Fairbrother (1992) khi nghiên cứu về các yếu gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ các thể bệnh khác nhau, tác giả đã đặt tên các chủng vi khuẩn E. coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sinh ra như: Enterotoxngeneic E. coli (ETEC), Enteropathogeneic E. coli (EPEC); Verotoxigeneic E. coli (VTEC), Adhesive Enteropathogeneic E. coli (AEEC). Từ PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
5 đó sắp xếp các serotype cùng mang các yếu tố gây bệnh vào các nhóm gây nên những thể bệnh đặc trưng cho từng lứa tuổi khác nhau ở lợn. Ở Đan Mạch, kết quả nghiên cứu của Frydendahl (2002) cho thấy trên 44% số chủng vi khuẩn E. coli (94/214 chủng) phân lập từ lợn sau cai sữa tiêu chảy mang kháng nguyên bám dính F4 (44,7%), F6 (0,9%) và F18 (39,3%). Ở Cộng hoà Slovakia, Vũ Khắc Hùng và Pilipcinec (2003) đã tìm thấy trong 218 mẫu phân lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy có chứa kháng nguyên bám dính F4, F5+F41, F6 của E. coli với tỷ lệ lần lượt 37,7%, 0,46%, 3,2%. Một nghiên cứu gần đây của Chae và cs, (2012) trên 105 chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con tiêu chảy từ 1-6 tuần tại Hàn Quốc tìm thấy kháng nguyên bám dính F4, F6 hiện diện với tỷ lệ lần lượt là 27,62%, 31,43% và không tìm thấy chủng nào mang kháng nguyên bám dính F5. 1.2. VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Vi khuẩn Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, nhóm Escherichae, loài Escherchia. Trong các vi khuẩn đường ruột, loài Escherchia là loài phổ biến nhất. E. coli xuất hiện và sinh sống trong động vật chỉ vài giờ sau khi con non sinh ra và tồn tại cho đến khi con vật chết. Ở điều kiện bình thường các chủng E. coli không gây bệnh, khi các điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém, vệ sinh thú y không đảm bảo dẫn đến sức chống chịu bệnh tật của con vật suy giảm thì vi khuẩn E. coli hoạt động mạnh, trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh. 1.2.1. Đặc điểm hình thái E. coli là trực khuẩn đường ruột, Gram âm, là những vi khuẩn hình que, 2 đầu tròn, kích thước dài ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, đường kính khoảng 1 µm. Không hình thành bào tử, tạo giáp mô mỏng, có lông quanh cơ thể, một số có lông bám (pili). Khuẩn lạc trên môi trường đặc phát triển hoàn toàn sau 1 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc có bìa tròn, hoặc nhăn nheo hoặc nhầy. Một vài chủng có khả năng gây dung huyết (Fairbrother và Gyles, 2006). 1.2.2. Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi glucose, lactose, mannitol, maltose, mannose, xylose, fructose. Có thể lên men hoặc không lên men các đường saccharose, raffinose, salicin, esculin, dunxit, glycerol. Ngược lại, vi khuẩn E. coli PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
6 không lên men các đường dextrin, emidon, glycogene, inositol, cellobiose, Metylglycosit (Quinn và cs, 2004). Cũng theo Quinn và cs, (2004) vi khuẩn E. coli được định danh bằng phản ứng sinh hóa qua các môi trường như: môi trường Kligler Iron Agar (KIA), môi trường kiểm tra indole, môi trường Methyl Red (MR), môi trường Voges. Proskauer (VP) và môi trường Simmons’ Citrate (Ci). E. coli sinh indole, phản ứng MR dương tính, VP âm tính, hoàn nguyên nitrate thành nitrite, không sử dụng ure. Trên môi trường KIA: E. coli lên men đường glucose và lactose, phần thạch nghiêng và thạch đứng đều chuyển sang màu vàng, làm nứt thạch, ngoài ra không sinh H2S, không cho kết tủa đen. Kết quả xét nghiệm IMViC của vi khuẩn E. coli như sau : Indole: trong môi trường có tryptophane, E. coli nhờ có enzyme tryptophanase sẽ phân giải tryptophane trong môi trường tạo thành indole. Để nhận diện indole người ta nhỏ vào vài giọt thuốc thử Kovac’s, indole kết hợp với paradimethylamino-benzaldehyde trong thuốc thử tạo thành hợp chất rosindole có màu đỏ : indole dương tính. Methyl Red (MR): trong môi trường có glucose, E. coli tạo nồng độ H+ cao (pH < 4,5) cho thuốc thử Methyl Red vào môi trường có màu đỏ: MR dương tính. Voges – Proskauer (VP): tùy loại enzyme vi khuẩn có được mà quá trình lên men glucose sẽ cho sản phẩm cuối cùng khác nhau. Một trong số đó là aceton, sẽ tạo phức hợp màu đỏ với thuốc thử α- naphthol và KOH E. coli có VP âm tính (không có màu đỏ). Citrate: E. coli không sử dụng được nguồn cacbon duy nhất là citrate có trong môi trường Simmon’s citrate, do đó không làm tăng pH của môi trường, không làm thay đổi màu xanh lục của môi trường có chứa chất chỉ thị màu xanh bromothymol. Vi khuẩn E. coli không mọc và không làm thay đổi màu xanh lá cây của môi trường. 1.2.3. Đặc tính nuôi cấy E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản nên chúng được chọn làm mẫu để nghiên cứu về sinh vật học. E. coli thuộc loại trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 37 0C, tuy nhiên có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 15-40 0C, pH PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
7 thích hợp là 7,2-7,4. Chúng mọc dễ dàng trong MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue (EMB), có khả năng sản sinh dung huyết α và β. Trên môi trường EMB, khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi, trơn bóng, có màu tím ánh kim, đường kính khuẩn lạc khoảng 1-2 mm. Trên môi trường MC, vi khuẩn E. coli lên men đường Lactose hình thành khuẩn lạc màu hồng sáng, to, tròn đều, mặt khuẩn lạc hơi lồi, trơn bóng, đường kính khuẩn lạc khoảng 1-2 mm (Quinn và cs, 2004). 1.2.4. Sức đề kháng Cũng như các loại vi khuẩn không sinh nha bào khác, E. coli không chịu được nhiệt độ, đun 500C trong 1 giờ, 600C trong 30 phút, và 1000C vi khuẩn chết ngay. Các chất sát trùng thông thường: axít phenic, biclorua thuỷ ngân, formol (0,2%) diệt vi khuẩn sau 5 phút. Ở môi trường bên ngoài các chủng E. coli độc tố có thể tồn tại đến 4 tháng. Vi khuẩn E. coli có khả năng đề kháng với sự sấy khô và hun khói (Đào Trọng Đạt và cs, 1995). Trong đất và nước E. coli sống được khoảng vài tháng. Chúng có độ nhạy cảm cao với nhiều loại kháng sinh (Đào Trọng Đạt và cs, 2000). 1.2.5. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli Theo Phạm Hồng Sơn (2002), cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia súc rất đa dạng và phức tạp với 4 nhóm kháng nguyên chính là các kháng nguyên O (kháng nguyên thân) chịu nhiệt, kháng nguyên H (kháng nguyên lông) không chịu nhiệt, kháng nguyên K (kháng nguyên giáp mô) và kháng nguyên F (kháng nguyên bám dính) chịu nhiệt ở mức độ trung gian. Sự đa dạng về tính kháng nguyên này gây rất nhiều khó khăn cho công tác phòng chống bệnh trên gia súc. Kháng nguyên O (xuất phát từ chữ Ohne Hauch - không có màng hơi) là các hợp chất lipopolysaccharide có trong thành phần vách tế bào, là chất gây sốt rất độc đối với động vật, chịu nhiệt (100 0C, hơn 2 giờ), không bị ethanol 50% phá hủy nhưng bị formol 0,5% làm biến tính. Các kháng nguyên thân đều nằm trên bề mặt nên có thể tiếp xúc với hệ thống miễn dịch của cơ thể động vật trừ một số trường hợp bị kháng nguyên bề mặt che lấp. Khi trộn kháng nguyên thân với kháng thể tương ứng thì xuất hiện phản ứng ngưng kết gọi là ngưng kết O: thân tế bào vi khuẩn dính với nhau, hình thành những hạt nhỏ lắc rất khó tan, huyền dịch vi khuẩn trong. Kháng nguyên H (xuất phát từ chữ Hauch - màng hơi) là những phân tử protein flagellin gần giống myosin trong cơ của động vật, không chịu nhiệt, dễ bị PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
8 ethanol 50% và enzyme proteinase phá hủy, nhưng bảo tồn trong formol 0,5%. Khi gặp kháng thể tương ứng, kháng nguyên H hình thành ngưng kết gọi là phản ứng lên bông do các tế bào vi khuẩn dính nhau gián tiếp qua các lông roi nên hình thành các khối nhỏ không bền, dễ vỡ khi lắc. Kháng nguyên K (xuất phát từ chữ Kapsule - vỏ bọc) là kháng nguyên bao bọc thân vi khuẩn. Tuy gọi là kháng nguyên vỏ bọc nhưng về mặt hình thái học lại có nguồn gốc từ những hợp chất có trên bề mặt tế bào chứ không phải trong thành phần của vỏ nhầy. Điều đáng chú ý là những kháng nguyên này ức chế phản ứng ngưng kết O rất mạnh, vì vậy khi thí nghiệm với các kháng thể O phải rất lưu ý. Hiện nay, người ta phát hiện được rằng bản chất của nhiều kháng nguyên K là các sợi lông nhung (hay Fimbria) có thuộc tính giúp vi khuẩn bám dính nên người ta gọi các kháng nguyên nhóm này là kháng nguyên F (F antigen, từ chữ Fimbria – lông nhung), là kháng nguyên bám dính hay yếu tố bám dính (Adhesin), vì vậy xuất hiện các ký hiệu F1, F2,… (Phạm Hồng Sơn, 2013). Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae - kháng nguyên bám dính): Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính. Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhầy để xâm nhập và gây bệnh, đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột. Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC (Enteroxigenic E. coli) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4, F18 và F41 (Carter G. R và cs, 1995). 1.2.6. Phân loại Vi khuẩn E. coli thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae, tộc Escherichiea, giống Escherichia. Giống này có 5 loài khác nhau là E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii và E. vulneris. Trong đó, loài chủ yếu là E. coli (Hirsh, 2004). Căn cứ vào các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn E. coli được chia làm 6 nhóm chính (Croxen và cs, 2010). Các nhóm vi khuẩn này mang các yếu tố độc lực điển hình và gây nên các bệnh lý khác nhau trên động vật và người (Kaper và cs, 2004). - Enteropathogenic E. coli (EPEC): Mang yếu tố bám dính và có khả năng xâm nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột, kèm theo biểu hiện sốt và tiêu chảy. Vi khuẩn nhóm này thường gây bệnh ở người, thỏ, chó, mèo, lợn và ngựa. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
9 - Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC): Phân lập được từ người và động vật nhai lại. Nhóm này thường sản sinh yếu tố xâm nhiễm, độc tố Shiga (Stx). Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh thường gây nên những bệnh lý tế bào rất nặng. - Enterotoxigenic E. coli (ETEC): Vi khuẩn thuộc nhóm này thường có khả năng mang một số kháng nguyên bám dính và sinh độc tố đường tiêu hóa. Vi khuẩn nhóm này thường gây bệnh tiêu chảy trên người, lợn, cừu, gà, bò, chó và ngựa. - Enteroaggregative E. coli (EAEC): Vi khuẩn bám lên lên thành ruột non và ruột già, sản sinh độc tố tế bào và độc tố đường tiêu hóa (EAST1). Vi khuẩn nhóm này chỉ có thể tìm thấy ở người và có thể ở lợn, bò. - Enteroinvasive E. coli (EIEC): Vi khuẩn xâm nhiễm vào biểu mô tế bào ruột kết, làm dung giải thể thực bào (phagosome). Vi khuẩn thuộc nhóm này chủ yếu được phân lập ở người. - Diffusely adherent E. coli (DAEC): Có thể tìm thấy trong ruột non, đặc biệt là ở trẻ em từ 12 tháng tuổi trở lên. 1.3. TÍNH MIỄN DỊCH Miễn dịch đối với bệnh nhiễm trùng do E. coli đường ruột là miễn dịch dịch thể và ban đầu được cung cấp qua sữa đầu. Kháng thể ức chế vi khuẩn bám dính vào các thụ thể trên các tế bào biểu mô ruột và trung hòa các hoạt động của độc tố hoặc những độc tố tế bào do E. coli tiết ra (Faibrother và Gyles, 2006). Lợn nái sản sinh IgG trong sữa đầu rất cao, sau đó giảm nhanh trong quá trình cho sữa và IgA trở thành lớp globulin miễn dịch chính. IgA, IgM và IgG trong sữa của lợn nái được sản xuất trong các tuyến vú. Trong suốt thai kỳ, một số lượng lớn các tế bào lympho được kích thích bởi kháng nguyên trong ruột di chuyển đến tuyến vú và sản xuất kháng thể đặc hiệu chống lại tác nhân gây bệnh đường ruột. Những kháng thể này đang được vận chuyển tích cực đến sữa đầu cho lợn con bú. Lợn con sơ sinh bắt đầu tổng hợp globulin miễn dịch đặc hiệu và phát triển miễn dịch đường ruột trong tuần tuổi đầu tiên. Lúc đầu, IgM chiếm ưu thế, nhưng sau 12 tuần, nó được thay thế bởi IgA là lớp globulin miễn dịch quan trọng nhất trong ruột. Như vậy, trong tuần tuổi đầu tiên, sữa đầu là nguồn miễn dịch chính bảo vệ cho lợn con. Có nhiều nguyên nhân làm cho việc bảo vệ lợn con qua sữa đầu thất bại. Lợn mẹ bài thải quá nhiều vi khuẩn ETEC theo phân làm môi trường của lợn con sống PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
10 bị nhiễm khuẩn, hoặc sữa đầu không chứa đủ các kháng thể đặc hiệu cần thiết để bảo vệ chống lại sự bám dính và gia tăng số lượng của ETEC. Ngoài ra, lợn mẹ mắc bệnh cũng sẽ giảm tiết sữa đầu, ví dụ như viêm vú hoặc núm vú bị thương có thể gây giảm tổng sản lượng sữa non. Lợn con không nhận được sữa non do dị tật, mắc bệnh, hoặc trọng lượng quá nhỏ, sẽ dễ bị nhiễm trùng do ETEC hơn (Faibrother và Gyles, 2006). Tiêm vắc xin phòng bệnh cho lợn mẹ là một trong những cách hiệu quả nhất để kiểm soát tiêu chảy do ETEC gây ra ở lợn con. Xác định các yếu tố độc lực quan trọng do ETEC sinh ra gây tiêu chảy và ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp đã hỗ trợ việc sản xuất vắc xin hiệu quả hơn. Một trong những phương pháp phòng bệnh đầu tiên là lấy chất chứa trong ruột non lợn con tiêu chảy đem nuôi cấy trong môi trường sữa, sau đó trộn vào thức ăn cho lợn nái mang thai một tháng trước khi đẻ. Phương pháp này có hiệu quả, khả năng miễn dịch kéo dài và bảo vệ lợn con trong suốt thời gian theo mẹ. Vắc xin đang có trên thị trường thường được sử dụng là vắc xin vô hoạt hoặc vắc xin kháng nguyên bám dính tinh khiết. Vắc xin thường chứa các chủng đại diện cho các nhóm huyết thanh quan trọng nhất và sản xuất các kháng nguyên bám dính như F4, F5, F6, và F41 (Nagy, 1986). Chúng thường được tiêm vào khoảng 6 tuần và 2 tuần trước khi sinh. Ngày nay, công nghệ DNA tái tổ hợp đã cho phép sản xuất số lượng lớn các kháng nguyên bám dính tinh khiết để sản xuất vắc xin tiêm phòng cho lợn mẹ. Trong trường hợp ở địa phương nào đó tiêm phòng không đạt hiệu quả, thì điều quan trọng là phải xác định type huyết thanh có liên quan để đưa vào thành phần kháng nguyên của vắc xin (Faibrother và Gyles, 2006). 1.4. YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA E. COLI 1.4.1. Độc tố ruột Fairbrother và cs, (1992) cho biết độc tố đường ruột do E. coli tạo ra (ETEC) gây tiêu chảy trầm trọng cho lợn sơ sinh từ 1 - 4 ngày tuổi. E. coli xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột bằng một hoặc nhiều yếu tố bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) và F41 rồi xâm nhập vào thành ruột. Tại đó chúng sản sinh ra độc tố đường ruột gồm hai loại: - Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin = ST): Độc tố này chịu được nhiệt độ 100°C trong vòng 15 phút. Độc tố ST chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên đặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong Methanol. STa là một protein không có PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma