Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát một số đặc tính Azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:123

Thêm vào BST

Báo xấu

86
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát một số đặc tính Azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày nêu lên việc tuyển chọn Azospirillum có khả năng cố định đạm và sinh IAA tốt, đặc điểm sinh thái, sinh lý, hóa sinh của chủng A2.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát một số đặc tính Azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH NGUYEÃN THANH ÑAØO KHAÛO SAÙT MOÄT SOÁ ÑAËC TÍNH AZOSPIRILLUM SP. VAØ AÛNH HÖÔÛNG CUÛA CHUÙNG TREÂN VAØI DAÏNG CAÂY TROÀNG NGAÉN NGAØY LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC TP. HOÀ CHÍ MINH – 2005
LÔØI CAÛM ÔN Toâi xin baøy toû loøng bieát ôn chaân thaønh vaø saâu saéc ñeán : TS. Trònh Thò Hoàng, ngöôøi ñaõ taän tình höôùng daãn, giuùp ñôõ vaø taïo moïi ñieàu kieän toát nhaát cho toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Quyù thaày coâ Khoa Sinh noùi chung vaø Boä moân Vi sinh noùi rieâng cuûa Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Tp. Hoà Chí Minh ñaõ cung caáp cho toâi nhöõng kieán thöùc quyù baùu trong suoát khoùa hoïc vaø giuùp ñôõ nhieät tình trong suoát quaù trình toâi thöïc hieän luaän vaên. Quyù thaày coâ vaø caùc baïn trong Boä moân Vi sinh, Sinh lyù Thöïc vaät, Sinh hoùa, Sinh hoïc Phaân töû Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân vaø Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp mieàn Nam ñaõ hoã trôï, ñoäng vieân vaø giuùp ñôõ toâi trong suoát quaù trình thöïc nghieäm. Gia ñình oâng Voõ Vaên Giuùp vaø oâng Nguyeãn Ngoïc Yeân ñaõ hoã trôï vaø giuùp ñôõ toâi thöïc hieän caùc thí nghieäm thöïc tieãn. Sôû Giaùo duïc vaø Ñaøo taïo tænh An Giang, Ban Giaùm hieäu Tröôøng Trung hoïc Phoå thoâng Nguyeãn Khuyeán ñaõ taïo moïi ñieàu kieän thuaän lôïi cho toâi trong suoát khoùa hoïc. Vaø thaät haïnh phuùc bieát bao khi trong cuoäc soáng, trong lao ñoäng vaø hoïc taäp luoân coù söï chaêm soùc, ñoäng vieân, giuùp ñôõ cuûa ngöôøi thaân, baïn beø. Toâi luoân bieát ôn vì nhöõng taám chaân tình ñoù vaø göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh ñeán nhöõng ngöôøi thaân yeâu cuûa toâi – gia ñình vaø baïn beø trong suoát thôøi gian qua. Nguyeãn Thanh Ñaøo
MUÏC LUÏC Trang Lôøi caûm ôn Muïc luïc Danh muïc caùc kyù hieäu, caùc chöõ vieár taét Danh muïc caùc baûng Danh muïc caùc hình Danh muïc caùc ñoà thò MÔÛ ÑAÀU ....................................................................................................... 1 Chöông 1 – TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU.............................................................. 3 1.1 Vai troø cuûa ñaïm vaø taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ............ 4 1.1.1 Ñaïm trong caây vaø vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng cuûa caây troàng ............................................................................................... 4 1.1.1.1 Tyû leä ñaïm vaø caùc daïng ñaïm trong caây .............................. 4 1.1.1.2 Vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng caây troàng ..................... 4 1.1.2 Taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm .................................. 7 1.1.2.1 Coá ñònh ñaïm hoùa hoïc ......................................................... 7 1.1.2.2 Coá ñònh ñaïm sinh hoïc......................................................... 9 1.2 Vi sinh vaät coá ñònh ñaïm vaø cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc ........................................................................................................... 10 1.2.1 Caùc loaøi vi sinh vaät coá ñònh ñaïm ................................................... 10 1.2.1.1 Vi khuaån coá ñònh nitô soáng töï do....................................... 10 1.2.1.2 Vi khuaån coá ñònh nitô coäng sinh ........................................ 10 1.2.1.3 Vi khuaån coá ñònh nitô soáng treân reã hay trong reã moät soá loaøi coû nhieät ñôùi ............................................................ 11
1.2.1.4 Ñaïm do vi sinh vaät coá ñònh ñöôïc ....................................... 11 1.2.2 Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ................................................. 11 1.3 Vi khuaån Azospirillum ............................................................................. 14 1.3.1 Ñaëc tính hình thaùi ........................................................................... 14 1.3.2 Söï phaân boá cuûa Azospirillum trong ñaát.......................................... 17 1.3.3 AÛnh höôûng cuûa Azospirillum ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa thöïc vaät ................................................................................... 18 1.3.3.1 AÛnh höôûng nhieãm khuaån ñeán söï phaùt trieån boä reã............. 18 1.3.3.2 Söï hình thaønh khuaån laïc Azospirillum ôû reã ....................... 19 1.3.4 Caùc cô cheá hoaït ñoäng cuûa Azospirillum giuùp taêng tröôûng thöïc vaät ................................................................................................... 21 1.3.4.1 Söï coá ñònh nitô khoâng khí cuûa Azospirillum...................... 21 1.3.4.2 AÛnh höôûng cuûa hormon ngoaïi tieát Azospirillum leân sinh tröôûng vaø phaùt trieån ôû thöïc vaät.................................. 22 1.3.4.3 Azospirillum kích thích söï haáp thu caùc chaát dinh döôõng khoaùng cuûa thöïc vaät .......................................................... 23 1.3.4.4 Quan heä giöõa nitratreductase cuûa caây chuû vaø vi khuaån Azospirillum....................................................................... 24 1.4 Phaân vi sinh vaät ........................................................................................ 24 1.4.1 Ñònh nghóa .................................................................................... 24 1.4.2 Phaân loaïi ...................................................................................... 25 1.4.3 Muïc tieâu cuûa vieäc söû duïng phaân vi sinh vaät ............................... 26 1.4.4 Quy trình chung ñeå saûn xuaát phaân vi sinh vaät töø vi khuaån ........ 26 1.4.5 Phaân vi sinh töø Azospirillum ......................................................... 30 Chöông 2 - VAÄT LIEÄU-NOÄI DUNG-PHÖÔNG PHAÙP ................................. 34 2.1 Vaät lieäu ..................................................................................................... 35
2.1.1 Thieát bò vaø duïng cuï......................................................................... 35 2.1.2 Hoùa chaát vaø moâi tröôøng.................................................................. 35 2.1.3 Vaät lieäu thí nghieäm......................................................................... 39 2.2 Noäi dung vaø phöông phaùp nghieân cöùu ................................................... 40 2.2.1 Phaân laäp .......................................................................................... 40 2.2.2 Tuyeån choïn chuûng Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát .................................................................................... 41 2.2.3 Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng ñöôïc choïn ....................................................................................... 43 2.2.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån .......................... 46 2.2.4.1 Chuaån bò ............................................................................. 46 2.2.4.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån treân caây maï trong oáng nghieäm, caây luùa trong chaäu vaø caây luùa ngoaøi ruoäng.................................................................. 47 2.2.5 Taïo cheá phaåm “phaân vi sinh” ....................................................... 52 2.2.5.1 Chuaån bò ............................................................................. 52 2.2.5.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân caây luùa trong chaäu vaø rau caûi ngaén ngaøy ......................... 54 Chöông 3 – KEÁT QUAÛ-THAÛO LUAÄN ............................................................ 57 3.1 Phaân laäp ................................................................................................... 58 3.2 Tuyeån choïn chuûng Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát ..................................................................................................... 61 3.2.1 Khaû naêng coá ñònh ñaïm cuûa 5 chuûng A1 , A2 , A3 , A4 vaø A5 ......... 61 3.2.2 Khaû naêng sinh IAA cuûa 5 chuûng A1 , A2 , A3 , A4 vaø A5 ............... 62 3.3 Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng A2 vaø A3 .............................................................................................................. 65
3.3.1 Ñaëc ñieåm hình thaùi ......................................................................... 65 3.3.2 Ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa ............................................................ 66 3.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån..................................... 69 3.4.1 Thôøi gian thích hôïp nhieãm dòch nuoâi caáy vi khuaån ñaït hieäu quaû ................................................................................................. 69 3.4.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån treân caây maï trong oáng nghieäm, caây luùa trong chaäu vaø caây luùa ngoaøi ruoäng.... 71 3.4.2.1. Caây maï trong oáng nghieäm ............................................... 71 3.4.2.2. Caây luùa trong chaäu .......................................................... 76 3.4.2.3. Caây luùa ngoaøi ruoäng ......................................................... 78 3.5 Taïo cheá phaåm “phaân vi sinh”.................................................................. 88 3.5.1 Chuaån bò ........................................................................................ 88 3.5.1.1. Dòch nuoâi caáy vi khuaån ................................................. 88 3.5.1.2. Cheá phaåm “phaân vi sinh” .................................................. 95 3.5.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân caây luùa trong chaäu vaø rau caûi ngaén ngaøy ............................................. 97 3.5.2.1 Luùa trong chaäu.................................................................... 97 3.5.2.2 Caûi thìa................................................................................ 99 KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ......................................................................... 106 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO
DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Trang Baûng 3.1. Ñaëc ñieåm khuaån laïc cuûa 5 chuûng treân moâi tröôøng NFb raén coù boå sung congo ñoû sau 5 ngaøy nuoâi caáy ............................................. 60 Baûng 3.2. Haøm löôïng ñaïm cuûa 5 chuûng trong moâi tröôøng Dobereiner dòch theå 61 Baûng 3.3. Haøm löôïng IAA trong dòch nuoâi caáy (μg/ ml) theo thôøi gian ........... 64 Baûng 3.4. Chieàu cao trung bình caây luùa (mm) sau 7 ngaøy theo thôøi gian ngaâm haït ................................................................................................ 70 Baûng 3.5. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây maï sau 7 ngaøy caáy trong oáng nghieäm cuûa chuûng A2 ................................................................................................... 73 Baûng 3.6. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây maï sau 7 ngaøy caáy trong oáng nghieäm cuûa chuûng A3 ................................................................................................... 74 Baûng 3.7. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây luùa trong chaäu .......................... 77 Baûng 3.8. Chieàu cao trung bình caây luùa ngoaøi ruoäng (cm) cuûa chuûng A2 .......... 80 Baûng 3.9. Chieàu cao trung bình caây luùa ngoaøi ruoäng (cm) cuûa chuûng A3.81 Baûng 3.10. Soá nhaùnh trung bình cuûa caây luùa ngoaøi ruoäng (nhaùnh/caây) vaøo thôøi ñieåm 45 ngaøy cuûa chuûng A2 vaø A3 ...........................................83 Baûng 3.11. AÛnh höôûng A2 treân chæ tieâu caây luùa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ........ 85 Baûng 3.12. AÛnh höôûng A3 treân chæ tieâu caây luùa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ........ 86 Baûng 3.13. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A2 theo thôøi gian ................. 88 Baûng 3.14. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A3 theo thôøi gian ................. 89 Baûng 3.15. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm .............................................................................. 91
Baûng 3.16. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm93 Baûng 3.17. Maät ñoä teá baøo A2 vaø A3 trong 1 gram cheá phaåm theo thôøi gian vôùi söï thay ñoåi ñoä aåm 95 Baûng 3.18. AÛnh höôûng cuûa NH3 leân söï gia taêng soá löôïng teá baøo ....................... 96 Baûng 3.19. Söï bieán ñoåi maät ñoä teá baøo A2 vaø A3 theo thôøi gian96 Baûng 3.20. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây luùa trong chaäu .........................98 Baûng 3.21. Soá laù trung bình cuûa caây caûi thìa (laù/caây)....................................... 100 Baûng 3.22. Chieàu cao trung bình cuûa caây caûi thìa (cm/caây) 102 Baûng 3.23. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây caûi thìa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ................................................................................................ 104
DANH MUÏC CAÙC HÌNH Trang Hình 3.1. Phaân laäp Azospirillum töø ñaát vuøng reã luùa ........................................... 58 Hình 3.2. Hình daïng khuaån laïc cuûa caùc chuûng sau 5 ngaøy nuoâi caáy treân moâi tröôøng NFb raén coù boå sung congo ñoû ........................................... 59 Hình 3.3. Ñònh tính IAA cuûa caùc chuûng thoâng qua thuoác thöû Salkowski ......... 62 Hình 3.4. Phaûn öùng maøu IAA vôùi thuoác thöû Salkowski cuûa caùc chuûng nuoâi caáy 5 ngaøy ................................................................................... 65 Hình 3.5. Khaû naêng söû duïng nguoàn carbon treân moâi tröôøng dòch theå - NFb cuûa chuûng A2 vaø A3 ...................................................................... 67 Hình 3.6. Khaû naêng söû duïng nguoàn carbon treân moâi tröôøng dòch theå Andrade cuûa chuûng A2 vaø A3 ............................................................... 68 Hình 3.7. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån (caây maï 7 ngaøy tuoåi treân moâi tröôøng MS) ........................................................................................... 72 Hình 3.8. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo chæ thò maøu bromothymol blue ...................................................... 92 Hình 3.9. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo chæ thò maøu bromothymol blue 94
DANH MUÏC CAÙC ÑOÀ THÒ Trang Ñoà thò 3.1. Ñöôøng töông quan tuyeán tính giöõa haøm löôïng IAA chuaån vaø OD530nm ............................................................................................... 63 Ñoà thò 3.2. Haøm löôïng IAA trong dòch nuoâi caáy (μg/ml) theo thôøi gian ........... 64 Ñoà thò 3.3. Hieäu quaû cuûa thôøi gian ngaâm haït maàm thoâng qua chieàu cao caây (mm) sau 7 ngaøy troàng luùa trong oáng nghieäm............................. 71 Ñoà thò 3.4. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån treân chieàu cao caây luùa ngoaøi ruoäng (cm/caây) cuûa chuûng A2 vaø A3..………………………………..79 Ñoà thò 3.5. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån ñeán khaû naêng phaân nhaùnh cuûa caây luùa ngoaøi ruoäng (nhaùnh/caây) vaøo thôøi ñieåm 45 ngaøy cuûa chuûng A2 vaø A3……….. .......................................................................... 82 Ñoà thò 3.6. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A2 theo thôøi gian ................. 89 Ñoà thò 3.7. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A3 theo thôøi gian ................. 90 Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm .............................................................................. 91 Ñoà thò 3.9. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm.. ............ ………………………………………………93 Ñoà thò 3.10. AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” ñeán soá löôïng laù caûi thìa .................................................................................................... 101 Ñoà thò 3.11. AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân chieàu cao caây caûi thìa (cm/caây) ............................................................................... 103
DANH MUÏC CAÙC KYÙ HIEÄU, CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT A2 : Chuûng Azospirillum 2 A3 : Chuûng Azospirillum 3 CFU (colony forming unit) : Maät ñoä teá baøo CP : Cheá phaåm CV% (Coefficient of Variation) : heä soá ño löôøng chính xaùc cuûa thí nghieäm ÑC : Ñoái chöùng IAA : Indole-3-acetic acid LSD (Least significant difference test) traéc nghieäm phaân haïng caùc loâ thí nghieäm MT1 : Moâi tröôøng voâ ñaïm NFb MT2 : Moâi tröôøng voâ ñaïm NFb raén coù boå sung congo ñoû MT3 : Moâi tröôøng Dobereiner vaø coäng söï MT4 : Moâi tröôøng Andrade MT5 : Moâi tröôøng nuoâi caáy thöû khaû naêng khöû nitrate MT6 : Moâi tröôøng MS MS : Murashige & Skoog N : Ñaïm NFb : nitrogen-fixing broth OD (Optical Density) : Maät ñoä quang PL : Phaân loaïi a, b, c, … trong xöû lyù thoáng keâ TN : Thí nghieäm
MÔÛ ÑAÀU Ñoàng Baèng Soâng Cöûu Long laø nôi cung caáp gaïo lôùn nhaát nöôùc, goùp phaàn xuaát khaåu gaïo ra theá giôùi. Theá nhöng haøng naêm luõ luït keùo veà ñaõ gaây thieät haïi veà ngöôøi cuõng nhö muøa maøng. Nhaèm chaêm lo ñôøi soáng cho ngöôøi daân vuøng luõ ñoàng thôøi vaãn ñaùp öùng ñuû gaïo cho nhu caàu tieâu duøng vaø xuaát khaåu, chính quyeàn khu vöïc chæ ñaïo bao ñeâ moät soá vuøng ngaäp luõ. An Giang cuõng khoâng thuoäc ngoaïi leä. Töø ñoù, ñaát khoâng coøn ñoä maøu môõ do phuø sa mang laïi. Chính vì vaäy, ñeå ñaùp öùng nhu caàu dinh döôõng cho caây troàng, ñaát phaûi thöôøng xuyeân ñöôïc boùn phaân. Vieäc söû duïng phaân boùn hoùa hoïc lieân tuïc laøm cho ñaát bò baïc maøu vaø chua, vai troø cuûa vi sinh vaät ñaát giaûm, chaát löôïng noâng saûn keùm thaäm chí gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Trong khi ñoù, phaân vi sinh vaät laø loaïi saûn phaåm chöùa moät hoaëc nhieàu chuûng vi sinh vaät soáng, coù ích ñaõ ñöôïc tuyeån choïn maø hoaït ñoäng cuûa chuùng taïo neân trong ñaát troàng caùc chaát dinh döôõng hay caùc chaát coù hoaït tính kích thích sinh tröôûng, taïo ñieàu kieän naâng cao naêng suaát hoaëc chaát löôïng noâng saûn, taêng ñoä maøu môõ cho ñaát. Caùc chuûng vi sinh vaät naøy khoâng aûnh höôûng xaáu ñeán ngöôøi, vaät nuoâi, moâi tröôøng sinh thaùi vaø chaát löôïng noâng saûn. Hieän nay ngöôøi ta ñaõ nghieân cöùu saûn xuaát phaân vi sinh vaät bao goàm phaân boùn vi sinh vaät coá ñònh ñaïm, phaân boùn vi sinh phaân giaûi caùc hôïp chaát phospho khoù tan, phaân boùn vi sinh vaät phaân giaûi cellulose, phaân boùn vi sinh vaät quang hôïp. Caùc loaïi phaân ñaïm vi sinh hieän nay ñeàu ñöôïc saûn xuaát töø caùc loaïi vi khuaån coá ñònh ñaïm nhö Azotobacter vaø Azospirillum. Caùc vi khuaån naøy phaân boá nhieàu trong ñaát vaø quanh vuøng reã. Ngoaøi khaû naêng coá ñònh ñaïm chuùng coù theå tieát ra moät soá hoaït chaát coù taùc duïng kích thích sinh tröôûng ôû thöïc vaät ñöa vaøo moâi tröôøng ñaát. Ñaùng chuù yù laø khaû naêng coá ñònh ñaïm cuûa Azospirillum ñöôïc Beijerinck phaùt hieän 1
töø naêm 1922, nhöng vai troø cuûa noù trong hoaït ñoäng coá ñònh ñaïm vuøng reã caây hoøa thaûo chæ ñöôïc bieát ñeán vaøo nhöõng naêm ñaàu cuûa thaäp nieân 70 nhôø vieäc tìm ra nôi cö truù cuûa chuùng. Khi ñaùnh giaù nhöõng döõ lieäu thu thaäp khaép theá giôùi hôn 30 naêm qua ôû ñoàng ruoäng thöû nghieäm nhieãm Azospirillum treân caùc ñoái töôïng caây troàng khaùc nhau, ngöôøi ta keát luaän raèng caùc vi khuaån naøy coù khaû naêng laøm taêng naêng suaát treân nhöõng loaïi ñaát troàng khaùc nhau vaø ôû nhöõng vuøng khí haäu khaùc nhau. ÔÛ Vieät Nam, trong thôøi gian qua, ngöôøi ta ñaõ ñeà caäp tôùi söï toàn taïi, phaân laäp, xaùc ñònh ñaëc ñieåm cuûa Azospirillum trong ñaát vaø reã luùa khu vöïc ngoaïi thaønh Haø Noäi vaø nghieân cöùu khaû naêng coá ñònh nitô cuûa moät soá chuûng Azospirillum sp. trong ñieàu kieän hoäi sinh vôùi maàm luùa [8]. Ñöôïc söï ñoäng vieân vaø giuùp ñôõ nhieät tình cuûa TS. Trònh Thò Hoàng, toâi ñaõ coù cô hoäi thöïc hieän ñeà taøi naøy vôùi loøng mong moûi ñoùng goùp phaàn naøo cho coâng cuoäc xaây döïng queâ höông An Giang giaøu ñeïp. Noäi dung cuûa ñeà taøi bao goàm : - Phaân laäp vaø tuyeån choïn Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát. - Tìm hieåu moät soá ñaëc tính sinh lyù, sinh hoùa. - Böôùc ñaàu taïo cheá phaåm “phaân vi sinh” baèng caùch coá ñònh treân chaát mang laø than buøn. - Sô boä öùng duïng cheá phaåâm “phaân vi sinh” treân caây troàng ngaén ngaøy (luùa nöôùc vaø caûi thìa) trong phoøng thí nghieäm vaø ngoaøi thöïc tieãn vôùi quy moâ nhoû. 2
CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 3
1.1. Vai troø cuûa ñaïm vaø taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm 1.1.1. Ñaïm trong caây vaø vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng cuûa caây troàng 1.1.1.1. Tyû leä ñaïm vaø caùc daïng ñaïm trong caây Tyû leä ñaïm trong caây bieåu hieän töø 1 - 6% troïng löôïng chaát khoâ. Tyû leä ñaïm trong boä phaän non cao hôn boä phaän giaø. Trong thôøi kyø hình thaønh quaû, ñaïm taäp trung chuû yeáu ôû caùc cô quan sinh saûn. Trong caây, ñaïm chuû yeáu coù trong thaønh phaàn protein vaø chieám 15 - 17%. Trong ñieàu kieän bình thöôøng, ngöôøi ta tính ñöôïc haøm löôïng protein thoâ trong caây thoâng qua ñònh löôïng nitô toång soá. Ñaïm trong caây coøn toàn taïi döôùi daïng hôïp chaát ñaïm höõu cô hoøa tan (caùc amin vaø amid). Moät löôïng raát nhoû ñaïm vaø trong ñieàu kieän dinh döôõng ñaïm khoâng bình thöôøng, ñaïm toàn taïi trong caây döôùi daïng NH4+ vaø NO3-. Tyû leä giöõa ñaïm höõu cô hoøa tan vaø ñaïm voâ cô theå hieän tình traïng toång hôïp höõu cô trong caây. Thöôøng khi thieáu glucid hoaëc thieáu caùc ñieàu kieän caàn thieát cho vieäc khöû nitrate, cho quaù trình amin hoùa thì tyû leä treân giaûm xuoáng. Ñaïm voâ cô trong caây toàn taïi chuû yeáu döôùi daïng NO3- vì söï tích tröõ löôïng NH4+ nhieàu laøm cho caây deã bò ngoä ñoäc. 1.1.1.2. Vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng caây troàng Ñaïm laø yeáu toá quan troïng haøng ñaàu ñoái vôùi cô theå soáng vì noù laø thaønh phaàn cô baûn cuûa protein - chaát cô baûn bieåu hieän söï soáng. Ñaïm naèm trong nhieàu hôïp chaát cô baûn caàn thieát cho söï phaùt trieån cuûa caây nhö dieäp luïc vaø caùc enzyme, caùc base A,T,G,X - thaønh phaàn cô baûn cuûa caùc nucleic acid, trong caùc DNA vaø RNA cuûa teá baøo - nôi cö truù cuûa caùc thoâng tin di truyeàn, ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc toång hôïp protein. Do vaäy ñaïm laø yeáu toá cô baûn cuûa quaù trình ñoàng hoùa carbon, kích thích söï phaùt trieån cuûa boä reã vaø kích thích vieäc huùt caùc yeáu toá dinh döôõng khaùc. 4
Caây troàng ñöôïc boùn ñuû ñaïm bieåu hieän ôû laù coù maøu xanh thaãm, sinh tröôûng khoûe maïnh, choài buùp phaùt trieån nhanh, naêng suaát cao. Boùn thöøa ñaïm, laù coù maøu xanh toái, thaân meàm, tyû leä nöôùc cao neân deã bò saâu beänh. Tình hình loáp ñoå cuûa caùc gioáng luùa thaân daøi cuõng laø haäu quaû cuûa vieäc boùn thöøa ñaïm. Ngoaøi ra, boùn thöøa ñaïm sinh tröôûng cuûa caây bò keùo daøi, chín muoän, chaát löôïng noâng saûn keùm, nitrate bò keùo xuoáng laøm oâ nhieãm maïch nöôùc ngaàm. Caây thieáu ñaïm, laù coù maøu vaøng, sinh tröôûng vaø phaùt trieån keùm, coøi coïc coù khi bò thui choät thaäm chí ruùt ngaén chu kyø soáng, naêng suaát thaáp. y Taùc duïng cuûa ñaïm ñoái vôùi caây luùa [10] Ñaïm laø yeáu toá dinh döôõng chuû yeáu, noù coù aûnh höôûng nhieàu ñeán thu hoaïch vì chæ khi ñuû ñaïm caùc chaát khaùc môùi phaùt huy taùc duïng. Ñaïm keát hôïp vôùi caùc chaát ñöôøng, boät ôû laù taïo ra amino acid roài töø ñoù hình thaønh neân caùc loaïi protein caàn thieát cho ñôøi soáng caây luùa. Ñaïm laø moät thaønh phaàn caáu taïo cuûa chaát dieäp luïc thuùc ñaåy quaù trình quang hôïp. Neáu thieáu ñaïm, trong caây seõ coù nhieàu ñaïm töï do, caây luùa seõ coù söùc soáng yeáu deã bò saâu beänh phaù haïi. Caây luùa huùt ñaïm ôû hai daïng : amoân (NH4+) vaø nitrate (NO3-). Trong ruoäng ngaäp nöôùc luùa huùt amoân nhieàu hôn, coøn trong ruoäng caïn nöôùc luùa huùt nitrate nhieàu hôn. Ñaïm amoân huùt vaøo reã coù theå keát hôïp ngay vôùi caùc loaïi acid höõu cô ôû ñoù taïo thaønh caùc daïng amino acid vaø seõ ñöôïc chuyeån leân laù ñeå toång hôïp protein. Caùc gioáng luùa Indica thaân cao huùt ñaïm ít hôn so vôùi gioáng luùa Japonica thaân thaáp. Yeâu caàu veà ñaïm cuûa caây luùa thay ñoåi trong quaù trình sinh tröôûng cuûa noù. Luùa caàn ñaïm nhieàu trong thôøi kyø ñeû nhaùnh, nhaát laø khi ñeû roä vaø giaûm daàn khi luùa ñöùng caùi thoâi ñeû nhaùnh. Luùa cuõng caàn nhieàu ñaïm trong thôøi kyø phaân hoùa ñoøng vaø phaùt trieån ñoøng thaønh boâng, thôøi kyø hình thaønh caùc boä phaän sinh saûn. Caùc gioáng 5
luùa thaân cao thöôøng coù hai ñænh cao veà nhu caàu ñaïm ñoù laø luùc ñeû nhaùnh vaø luùc saép troå boâng. Coøn caùc gioáng luùa thaân thaáp thì thöôøng coù nhu caàu veà ñaïm taêng ñeàu suoát thôøi kyø ñeû nhaùnh ñeán luùc troå boâng, chæ sau khi troå nhu caàu veà ñaïm môùi giaûm xuoáng. Vì vaäy trong kyõ thuaät boùn phaân caàn cung caáp ñuû ñaïm cho luùa ñeû nhaùnh vaø laøm ñoøng, nhöng neáu thöøa ñaïm cuõng khoâng toát vì luùa thöøa ñaïm deã bò loáp ñoå, giaûm söùc choáng chòu vôùi saâu beänh vaø caùc ñieàu kieän khoâng thuaän lôïi khaùc. Keát hôïp boùn phaân höõu cô vôùi phaân ñaïm seõ deã thoûa maõn caùc yeâu caàu veà ñaïm. Boùn phaân ñaïm vieân moät laàn sau khi caáy cuõng seõ cung caáp, ñieàu hoøa ñaïm cho caây trong suoát thôøi gian sinh tröôûng maø khoâng daãn ñeán hieän töôïng thöøa ñaïm taïm thôøi roài laïi thieáu ñaïm nhö hieän töôïng boùn vaõi nhieàu laàn. y Taùc duïng cuûa ñaïm ñoái vôùi rau [25] Caây troàng haáp thu moät löôïng lôùn ñaïm töø ñaát thoâng qua heä thoáng reã. Ñoái vôùi döôõng chaát NH4+, khi caây troàng haáp thu vöôït troäi NO3-, daãn ñeán söï phoùng thích H+ töø reã vaø seõ taïo acid hoùa moâi tröôøng beân ngoaøi. Ngöôïc laïi, ñoái vôùi döôõng chaát NO3-, khi caây troàng huùt NH4+ troäi hôn seõ laøm cho moâi tröôøng kieàm hôn. Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy caây troàng haáp thu NH4+ nhanh hôn NO3- trong giai ñoaïn sinh tröôûng sinh döôõng, trong khi caây haáp thu NO3- nhieàu hôn NH4+ khi caây ôû giai ñoaïn sinh tröôûng sinh thöïc. Khi NH3 töï do tích luõy trong caây vôùi löôïng lôùn seõ gaây ngoä ñoäc cho caây neân khi ñöôïc huùt vaøo thöôøng bò ñoàng hoùa ngay baèng nhieàu caùch. Tröôùc heát NH3 ñöôïc ñoàng hoùa baèng con ñöôøng amin hoùa tröïc tieáp caùc cetoacid ñeå taïo thaønh caùc amino acid nhö : amin hoùa α-cetoglutaric ñeå taïo thaønh glutamic acid, amin hoùa oxaloacetic acid ñeå taïo thaønh aspatic acid, amoniac cuõng coù theå keát hôïp ngay vôùi pyruvic acid ñeå taïo thaønh alanin … Caùc loaïi amino acid tham gia vaøo caùc quaù trình ñoàng hoùa sô caáp amoniac nhö α-cetoglutaric acid, 6
pyruvic acid, fumaric acid … ñeàu laø nhöõng acid ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình chuyeån hoùa glucid. Khaùc vôùi amoân, nitrate khoâng gaây ngoä ñoäc cho caây neân coù theå tích tuï moät löôïng khaù lôùn trong caây, chính söï tích tuï nitrate naøy neân khi söû duïng rau laøm thöùc aên seõ aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán söùc khoûe con ngöôøi. Dinh döôõng nitrate cuõng laøm taêng haøm löôïng protein vaø caùc amid. Vì vaäy ngöôøi ta cho raèng nitrate vaøo trong caây chòu söï chuyeån hoùa raát maïnh. Quaù trình chuyeån hoùa nitrate ôû trong caây tröôùc heát daãn ñeán söï taïo thaønh NH3. Thöïc chaát quaù trình chuyeån hoùa naøy laø moät quaù trình khöû : Mo Cu,Fe,Mn Cu,Fe,Mn Mg,Mn HNO3 HNO2 (HNO)2 HN2OH NH3 Nitrate coù theå bò khöû hoaøn toaøn ôû reã thaønh daïng amoân, laø daïng ñaïm tham gia tröïc tieáp trong quaù trình taïo amino acid. Neáu boùn nhieàu ñaïm maø thieáu laân hay khoâng boùn laân, kali caân ñoái, ñaëc bieät laø thieáu nguyeân toá vi löôïng Mo thì quaù trình khöû nitrate seõ bò chaäm laïi vaø daãn ñeán tình traïng toàn dö nitrate trong caây. Löôïng nitrate toàn dö trong caây coøn do boùn cho caây caän ngaøy thu hoaïch laøm haøm löôïng nitrate khoâng ñuû thôøi gian ñeå khöû thaønh amoân, taïo thaønh amino acid vaø protid coù ích cho caây. 1.1.2. Taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm 1.1.2.1. Coá ñònh ñaïm hoùa hoïc Trong khoâng khí, phaân töû nitô thöôøng toàn taïi ôû traïng thaùi lieân keát hai nguyeân töû nitô laïi vôùi nhau nhôø noái ba beàn vöõng (N≡N). Naêng löôïng caàn cho söï phaù vôõ lieân keát naøy khoaûng 225kcal neân caây troàng (cuõng nhö caùc loaøi ñoäng vaät) khoâng coù khaû naêng ñoàng hoùa nguoàn nitô naøy. Vì vaäy vieäc nghieân cöùu phaù vôõ caùc lieân keát naøy ñeå taïo ra daïng nitô deã haáp thu ñoái vôùi caây xanh laø heát söùc caàn thieát [3]. 7
Naêm 1905 laàn ñaàu tieân con ngöôøi tìm ñöôïc phöông phaùp phaù vôõ vaø lieân keát vôùi CaC2 ñeå taïo ra moät daïng phaân ñaïm hoùa hoïc ñaàu tieân laø CaCN2. Muoán thöïc hieän phaûn öùng ngöôøi ta duy trì moät nhieät ñoä cao töø 1000 – 1100oC : 1000oC CaC2 + N2 CaCN2 + C Ít laâu sau caùc nhaø khoa hoïc Nauy laïi tìm ñöôïc caùch lieân keát N2 vôùi O2 ñeå taïo thaønh moät daïng phaân ñaïm hoùa hoïc khaùc (nitrate) phaûn öùng naøy cuõng ñoøi hoûi nhieät ñoä cao ñeán 4000oC : 4000oC O2 O2 N2 + O2 2NO NO2 HNO3 H 2O Naêm 1908 nhaø khoa hoïc Ñöùc Ga-be ñaõ tìm ñöôïc phöông phaùp lieân keát N2 vôùi H2 ñeå taïo thaønh NH3. Phaûn öùng naøy khoâng nhöõng ñoøi hoûi nhieät ñoä cao (600oC), aùp suaát cao (1000atm) maø coøn ñoøi hoûi coù maët moät soá chaát xuùc taùc ñaét tieàn (Os, Ru). Töø ñoù ñeán nay ngaønh coâng nghieäp hoùa hoïc ñaõ coù nhöõng tieán boä raát lôùn. Ngöôøi ta saûn xuaát roäng raõi nhieàu loaïi phaân ñaïm hoùa hoïc khaùc nhau vôùi saûn löôïng ngaøy caøng taêng. Neáu nhö naêm 1913 toaøn theá giôùi saûn xuaát ñöôïc 0,51 trieäu taán phaân ñaïm thì ñeán naêm 1964 con soá naøy ñaõ taêng leân 29 laàn (14,5 trieäu taán) trong khi ñoù phaân kali chæ taêng 8,4 laàn, phaân phospho taêng coù 5,8 laàn [3]. Duø sao thì phaân ñaïm hoùa hoïc treân toaøn theá giôùi cuõng buø ñaép ñöôïc moät phaàn nhoû soá löôïng ñaïm trong ñaát bò laáy ñi haøng naêm. Coù moät thoáng keâ cho bieát haøng naêm caùc saûn phaåm noâng nghieäp treân theá giôùi laáy ñi khoûi ñaát khoaûng 100 - 110 trieäu taán ñaïm, con soá naøy vöôït ñeán baûy laàn so vôùi phaân ñaïm hoùa hoïc saûn xuaát ra ôû caùc nöôùc goäp laïi haøng naêm. Phaân ñaïm coù taùc duïng raát lôùn ñeán muøa maøng, ví duï : boùn 1kg ñaïm thu hoaïch theâm ñöôïc khoaûng 10 -20kg thoùc, 15 - 20kg ngoâ hoaëc 15 - 40kg coû khoâ (G.Colarva P.Greenland, 1963). 8
Khoù khaên chuû yeáu laøm caûn trôû vieäc môû roäng nhanh choùng hôn nöõa vieäc saûn xuaát phaân ñaïm hoùa hoïc laø vì ñieàu kieän ñeå phaù vôõ caùc lieân keát trong phaân töû nitô khoâng phaûi laø ñôn giaûn (caàn nhieät ñoä cao, aùp suaát cao, chaát xuùc taùc ñaét tieàn). 1.1.2.2. Coá ñònh ñaïm sinh hoïc Töông töï nhö quaù trình coá ñònh ñaïm hoùa hoïc, quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc cuõng laø quaù trình phaù vôõ caùc lieân keát trong phaân töû nitô khoâng khí ñeå taïo thaønh caùc daïng nitô deã haáp thu cho caây troàng. Nhöng ôû quaù trình naøy vieäc phaù vôõ caùc lieân keát cuûa phaân töû nitô xaûy ra ôû ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng. Chính vì vaäy maø vai troø cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc coù yù nghóa heát söùc lôùn lao ñoái vôùi noâng nghieäp, nhaát laø ñoái vôùi caùc nöôùc coù neàn coâng nghieäp phaân ñaïm chöa phaùt trieån. Quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc laø moät giai ñoaïn cuûa chu trình tuaàn hoaøn nitô trong töï nhieân, ñöôïc thöïc hieän bôûi caùc nhoùm vi sinh vaät nhö laø: vi khuaån, taûo lam, xaï khuaån. Caùc loaïi vi sinh vaät naøy coù theå soáng ñoäc laäp nhö nhöõng vi sinh vaät soáng töï do hoaëc coù theå quan heä ôû nhöõng möùc ñoä khaùc nhau vôùi vi khuaån, thöïc vaät vaø ñoäng vaät khaùc. Moái quan heä naøy thay ñoåi töø quan heä hoäi sinh keát hôïp ñeán quan heä coäng sinh baét buoäc. Trong ñoù thöïc vaät chuû laø vi sinh vaät quan heä treân möùc ñoä phaân töû vaø chöùc naêng sinh lyù chung. Trung taâm cuûa caû heä thoáng naøy laø vi khuaån Procaryote coá ñònh ñaïm chöùa phöùc hôïp enzyme nitrogenase (ñaûm nhieäm söï chuyeån hoùa N2 thaønh NH3) . Chæ vaøi loaøi Procaryote xaùc ñònh môùi coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. Thöïc vaät (ngoaïi tröø caùc loaïi taûo vaø caùc thöïc vaät coäng sinh) khoâng coù khaû naêng coá ñònh ñaïm maø chæ coù nhöõng loaøi Procaryote soáng chung vôùi thöïc vaät môùi coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. Quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc haøng naêm cung caáp cho ñaát töø 100 - 180 trieäu taán ñaïm vaø ñoùng goùp 65% löôïng nitô ñöôïc söû duïng trong noâng nghieäp 9