Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella Pneumoniae tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:127

Thêm vào BST

Báo xấu

169
lượt xem 40
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella Pneumoniae tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh nêu lên đặc tính mẫu, sự phân bố vi khuẩn Klebsiella Pneumoniae trong các loại bệnh phẩm, khảo sát mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella Pneumoniae, tỉ lệ Klebsiella Pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella Pneumoniae tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Hoài An KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Hoài An KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE TẠI VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. CAO HỮU NGHĨA Thành phố Hồ Chí Minh – 2014
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nào khác. Tác giả Phạm Thị Hoài An
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, anh chị, gia đình và các bạn. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu cùng thầy cô Khoa Sinh – Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp em có cơ sở lí luận và kỹ năng nghiên cứu khoa học vững chắc. Ban Giám đốc Viện Pasteur và đặc biệt là TS. Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng - Viện Pasteur Tp. HCM đã tạo điều kiện cơ sở vật chất tốt nhất, tận tâm hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. ThS. Vũ Lê Ngọc Lan, ThS. Uông Nguyễn Đức Ninh cùng các Cô, Anh và Chị trong Phòng Vi sinh Bệnh Phẩm, khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng - Viện Pasteur Tp. HCM đã hết lòng chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và cùng đồng hành, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập, làm việc cũng như thu thập số liệu tại phòng để em có thể thực hiện khóa luận này. Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả những người thân trong gia đình, những người đã luôn bên cạnh ủng hộ em. Mong cho điều tốt đẹp nhất sẽ đến với mọi người. Em xin hết lòng cảm ơn. Tác giả Phạm Thị Hoài An
MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình - sơ đồ - biểu đồ MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................................................. 4 1.1. Klebsiella pneumoniae .............................................................................................4 1.1.1. Đặc điểm vi sinh học ......................................................................................4 1.1.1.1. Hình thái và cấu trúc ................................................................................4 1.1.1.2. Cấu trúc kháng nguyên .............................................................................4 1.1.1.3. Cấu trúc bộ gen.........................................................................................5 1.1.1.4. Tính chất nuôi cấy ....................................................................................5 1.1.1.5. Tính chất hóa sinh ....................................................................................6 1.1.2. Khả năng gây bệnh .........................................................................................6 1.1.2.1. Cơ chế gây bệnh .......................................................................................6 1.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng...................................................................................6 1.1.3. Chẩn đoán vi sinh vật .....................................................................................6 1.1.4. Phòng bệnh và điều trị ....................................................................................6 1.2. Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh ........................................................7 1.2.1. Định nghĩa kháng sinh ....................................................................................7 1.2.2. Phân loại kháng sinh .......................................................................................7 1.2.2.1. Dựa vào khả năng tác dụng ......................................................................7 1.2.2.2. Dựa vào phổ tác dụng ...............................................................................8 1.2.2.3. Dựa vào nguồn gốc...................................................................................8 1.2.2.4. Dựa trên cấu trúc hóa học.........................................................................9 1.2.2.5. Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh ...............................................11
1.3. Cơ chế tác động của kháng kháng sinh ..................................................................11 1.4. Cơ chế kháng kháng sinh........................................................................................14 1.4.1. Bản chất di truyền của tính đề kháng và các phương thức chuyển tải gen...14 1.4.1.1. Đề kháng tự nhiên ..................................................................................15 1.4.1.2. Đề kháng mắc phải .................................................................................15 1.4.2. Cơ chế kháng kháng sinh ..............................................................................16 1.4.2.1. Tạo enzyme phân hủy kháng sinh làm bất hoạt kháng sinh...................17 1.4.2.2. Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn .................................................20 1.4.2.3. Thay đổi cấu trúc receptor của kháng sinh làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận .........................................................................21 1.4.2.4. Bơm đẩy .................................................................................................22 1.4.3. Cơ chế kháng một số nhóm kháng sinh của vi khuẩn Gram âm ..................22 1.4.3.1. Kháng Penicillin và Cephalosporin ........................................................22 1.4.3.2. Kháng Carbapenemes .............................................................................23 1.4.3.3. Kháng Aminoglycoside ..........................................................................23 1.4.3.4. Kháng Fuoroquinolones .........................................................................24 1.4.3.5. Kháng Tetracyclin ..................................................................................24 1.4.3.6. Kháng Sulfonamid..................................................................................24 1.5. Tình hình kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae trên thế giới và trong nước ......................................................................................................................25 1.5.1. Trên thế giới..................................................................................................25 1.5.1. Tại Việt Nam ................................................................................................29 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 32 2.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................32 2.1.1. Đối tượng ......................................................................................................32 2.1.2. Cỡ mẫu .........................................................................................................32 2.1.3. Thời gian nghiên cứu ....................................................................................32 2.1.4. Địa điểm thực hiện đề tài ..............................................................................33 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................33 2.2.1. Vật liệu..........................................................................................................33 2.2.2. Phương pháp thực hiện .................................................................................36
2.2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu ...............................................................................................................39 2.2.2.2. Nhuộm Gram: xác định vi khuẩn Gram âm ...........................................42 2.2.2.3. Dùng các thử nghiệm sinh hóa để định danh Klebsiella pneumoniae ...43 2.2.2.4. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer .............................47 2.2.2.5. Thử nghiệm đĩa đôi ................................................................................50 2.2.2.6 Thử nghiệm Hodge test ...........................................................................51 2.2.2.7. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng kháng sinh ..............................52 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................57 3.1. Đặc tính mẫu...........................................................................................................57 3.1.1. Đặc tính về giới tính của bệnh nhân .............................................................57 3.1.2. Đặc tính về tuổi bệnh nhân ...........................................................................57 3.2. Sự phân bố vi khuẩn Klebsiella pneumoniae trong các loại bệnh phẩm................58 3.3. Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae ...........................59 3.4. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng........................................63 3.5. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase ..................................................67 3.6. Kết quả PCR ...........................................................................................................68 3.6.1. Gen CMY-2 ..................................................................................................69 3.6.2. Gen bla OXA -1 .................................................................................................72 3.6.3. Gen bla NDM-1 .................................................................................................75 3.6.4. Gen bla IMP .....................................................................................................78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................................81 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................82 PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AM Ampicilline AMC Amoxiclline/clavalanic acid AN Amikacine BHI Brain Heart Infusion CA Chocolate Agar + Polyvitex CAZ Caftazidime CDC Centers for Disease Control and Prevention - Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kì CFU Colony Forming Unit - Đơn vị tạo khuẩn lạc CIP Ciprofloxacine CN Cephalexine CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute - Viện tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm CS Colistin CO Columbia Agar + 5% máu cừu ADN Acid đeoxyribonucleic DNT Dịch não tủy EPM Etapenem ESBL Extended Spectrum Beta Lactamase - β - lactamase phổ rộng EP Nước muối sinh lý vô trùng FT Nitrofurantoin I Intermediate - Trung tâm ISO International Organization for Standardiazation - Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế IPM Imipenem KPC Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LPS Lipopolysaccharide MHA Mueller Hinton Agar
MBL Metallo- β -lactamase MPM Meropenem MEC Mecillinam mARN messenger RNA NET Netilmicine PBP Penicillin-binding protein PIP Piperacilline R Resistant - Đề kháng ARN Acid ribonucleic S Susceptibility - nhạy cảm SXT Trimethoprim+Sulfamethoxazole TE Tetracyline TSA Tryptic Soy Agar UDP Uridindiphosphat WHO World Health Organization - Tổ chức y tế thế giới
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Lớp, phân lớp kháng sinh beta lactam……………………………………....9 Bảng 1.2. Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler…………………………....18 Bảng 1.3. Phân loại enzyme β-lactamase theo Karen Bush………………………......18 Bảng 2.1. Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm……………………………....39 Bảng 2.2. Các đoạn mồi dùng trong PCR phát hiện gen kháng kháng sinh………......53 Bảng 2.3. Các thành phần trong phản ứng PCR…………………………………........54 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho từng gen mục tiêu…………………………………......55 Bảng 3.1. Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo giới tính………………………....57 Bảng 3.2. Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo độ tuổi………………………......58 Bảng 3.3. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae phân lập từ các loại bệnh phẩm……………..59 Bảng 3.4. Tính nhạy cảm kháng sinh của Klebsiella pneumoniae…………………....60 Bảng 3.5. So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh với các nghiên cứu trước……………….....61 Bảng 3.6. Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae…............................63 Bảng 3.7. Kết quả của một số nghiên cứu về Klebsiella pneumoniae sinh ESBL……64 Bảng 3.8. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL theo mẫu bệnh phẩm………….....64 Bảng 3.9. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL kháng với các kháng sinh……….65 Bảng 3.10. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase………………………..67 Bảng 3.11. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase theo mẫu bệnh phẩm…67 Bảng 3.12. Kết quả PCR phát hiện 4 gen kháng kháng sinh……………………….....68 Bảng 3.13. Kết quả điện di gen CMY-2……………………………………………....70 Bảng 3.14. Kết quả điện di gen bla OXA-1 ………………………………………………71 Bảng 3.15. Kết quả điện di gen bla NDM-1 ………………………………………….......74
DANH MỤC CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ Trang Hình 1.1. Klebsiella pneumoniae………………………………………………………4 Hình 1.2. Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên môi trường CA…………………….5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 4 nhóm β-lactam……………………………………...9 Hình 1.4. Cơ chế tác động của kháng sinh…………………………………………....12 Hình 1.5. Các phương thức lan truyền gen đề kháng………………………………....16 Hình 1.6. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn………………………………….....17 Hình 2.1. Klebsiella pneumoniae bắt màu hồng trên phết nhuộm Gram…………......42 Hình 2.2. API định danh vi khuẩn của BIOMERIEUX – Pháp………………………46 Hình 2.3. Kết quả định danh API 20E của Klebsiella pneumoniae………………......47 Hình 2.4. Kháng sinh đồ của Klebsiella pneumoniae………………………………...50 Hình 2.5. Thử nghiệm đĩa đôi………………………………………………………...51 Hình 2.6. Thử nghiệm Hodge test……………………………………………….........52 Hình 3.1. Kết quả PCR gen CMY-2 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…….69 Hình 3.2. Kết quả PCR gen bla OXA-1 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…….72 Hình 3.3. Kết quả PCR gen bla NDM-1 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…....76 Hình 3.4. Kết quả PCR gen bla IMP đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)….......79 Sơ đồ 2.1. Phương pháp nghiên cứu sự kháng kháng sinh của K. pneumoniae………37 Sơ đồ 2.2. Quy trình nuôi cấy Klebsiella pneumoniae từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu………………………………………………………………..38 Sơ đồ 2.3. Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán kháng sinh trên mặt thạch………………………………………………...48 Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae………………….61 Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng………………..63
1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Klebsiella là một loại vi khuẩn Gram âm thường được tìm thấy trong ruột của người (mà không gây bệnh), phân người hoặc ở đường hô hấp. Chúng xâm nhập vào đường hô hấp (hít thở) và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi, hoặc xâm nhập vào đường máu gây nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng vết thương, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang... Ngày nay, có nhiều vi khuẩn Klebsiella đã kháng thuốc, nhất là với loại thuốc kháng sinh carbapenem, điển hình là ổ dịch hoành hành khắp các bệnh viện ở Israel khiến 120-200 người tử vong bắt đầu khoảng năm 2006 [65], cùng thời điểm đó tại các bệnh viện Hàn Quốc cho thấy Klebsiella pneumoniae kháng cephalosporin thế hệ 3 là 29%. (Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005-2007). Tình hình kháng thuốc của Klebsiella pneumoniae không chỉ xuất hiện ở Israel và Hàn Quốc mà còn diễn ra tại một đất nước có nền y học phát triển đó là Hoa Kì, “dịch kháng thuốc” của Klebsiella pneumoniae do sản xuất carbapenemase (KPC) được mô tả lần đầu tiên vào năm 1996 gây chết người liên tiếp. Kể từ đó lan rộng ra 41 tiểu bang, thường xuyên xảy ra trong một số bệnh viện ở New York và New Jersey [63]. Riêng Việt Nam, theo kết quả tìm hiểu thực trạng sử dụng kháng sinh trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại các đơn vị điều trị tích cực ở một số cơ sở khám, chữa bệnh cho thấy 4 chủng vi khuẩn phân lập được nhiều nhất là Acinetobacter spp., Pseudomonas spp., E.coli, Klebsiella spp. 4 chủng này đều là vi khuẩn đa kháng kháng sinh. Hiện nay, sự kháng thuốc của chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae cực kì nguy hiểm bởi vì bản thân loại vi khuẩn này có khả năng sinh được hai loại enzyme: β lactamase phổ rộng và carbapenemase [15]. Các enzyme này làm biến đổi, phá hủy cấu trúc hóa học của kháng sinh [27]. β lactamase phổ rộng có khả năng phân giải hầu hết các loại kháng sinh thuộc nhóm β lactam đặc biệt đối với penicillins và cephalosporins thế hệ thứ 3 [47]. Quan trọng hơn nữa là Klebsiella pneumoniae còn có khả năng sản sinh được carbapenemase phân giải carbapenem như imipenem,
2 meropenem..., trong khi carbapenem được xem như là cứu cánh cuối cùng trong việc lựa chọn kháng sinh để điều trị [69]. Để tránh tình trạng đa kháng trên lâm sàng, điều cấp thiết nhất đặt ra cho chúng ta là làm thế nào để phát hiện nhanh, chính xác được vi khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh β lactamase phổ rộng và carbapenemase càng sớm càng tốt giúp các bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp nhất để điều trị cho bệnh nhân. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae tại viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh” 2. Mục đích nghiên cứu Xác định đặc tính kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae tại Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được từ các bệnh phẩm tại Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh từ 01-06/2014. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nuôi cấy, phân lập và định danh chủng Klebsiella pneumoniae. - Khảo sát tỷ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae ở giới tính, các lứa tuổi, bệnh phẩm khác nhau. - Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae phân lập được. - Sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi, sinh carbapenemase bằng Hodge test. - Xác định một số gen mã hóa cho tính kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu mẫu, nuôi cấy, phân lập, định danh, làm kháng sinh đồ, sàng lọc chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase, β-lactamases phổ rộng, phát hiện gen kháng thuốc được thực hiện theo quy trình chuẩn của Viện Pasteur Tp. HCM đạt chuẩn ISO 15189:2007. - Thu mẫu bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu. - Phân lập và định danh các chủng Klebsiella pneumoniae bằng các thử nghiệm hóa sinh hoặc API 20E.
3 - Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer. - Thử nghiệm đĩa đôi, thử nghiệm Hodge test sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamases phổ rộng, carbapenemase. - Phát hiện các gen kháng kháng sinh bằng phương pháp PCR. 6. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài - Dự kiến thời gian : từ 01/2014 đến tháng 06/2014. - Địa điểm thực hiện đề tài: Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh.
4 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Klebsiella pneumoniae Năm 1882, Fridlander C.Uber đầu tiên phát hiện ra Klebsiella là tác nhân gây bệnh viêm phổi [45]. Vào năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853- 1938) phát triển kỹ thuật nhuộm Gram để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae [17]. 1.1.1. Đặc điểm vi sinh học 1.1.1.1. Hình thái và cấu trúc Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Klebsiella Loài: Klebsiella pneumoniae [90] Hình 1.1. Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae là thành viên quan trọng nhất của chi Klebsiella trong họ Enterobacteriaceae. Klebsiella pneumoniae là một loại trực khuẩn Gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, kích thước 0,5-2 µm, hình que, không có lông, không di động, có vỏ, không sinh nha bào [75] [85]. 1.1.1.2. Cấu trúc kháng nguyên Gồm hai loại kháng nguyên trên bề mặt tế bào + Kháng nguyên O Đây là kháng nguyên của vách tế bào. Kháng nguyên O bản chất là lipopolysaccharide (LPS) một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên, còn lipid quyết định các đặc tính sinh học và độc tính (nội độc tố). Kháng nguyên O bao gồm 20 đến 40 đơn vị oligosaccharide, mỗi đơn vị oligosaccharide lại bao gồm 2 đến 8 monosaccharid khác nhau. Dựa trên sự có mặt hay thiếu hụt của kháng nguyên O mà khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ biểu hiện là dạng S (dạng S - Smooth: nhẵn, khuẩn lạc
5 thường nhỏ, màu trong, mặt lồi, bờ đều, bóng) hoặc R (dạng R - Rough: xù xì, khuẩn lạc thường dẹt, bờ đều hoặc nhăn nheo, mặt xù xì, khô) khi vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch Agar. Kháng nguyên O không bị huỷ ở 100°C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Người ta đã biết có 9 serotypes khác nhau của Klebsiella pneumoniae. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao và thường được sử dụng để phân loại vi khuẩn. + Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, mang tính chất đặc hiệu type với hơn 80 serotypes khác nhau. Trong đó type 1 và type 2 hay gặp nhất trong nhiễm khuẩn đường hô hấp. Cả hai góp phần vào khả năng gây bệnh và cơ sở hình thành serogrouping [4][6] [72] [76]. 1.1.1.3. Cấu trúc bộ gen Bộ gen hoàn chỉnh đã được xác định vào năm 2006 tại trung tâm giải trình tự gen tại Đại học Washington ở St Louis. Bộ gen được đặt tên là Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78.578. Nó bao gồm một nhiễm sắc thể là 5,3 Mbp. Có năm plasmid, pKPN3, pKPN4, pKPN5, pKPN6, và pKPN7. Tương ứng, mỗi chiều dài plasmid là 0,18 Mbp, 0.11 Mbp, 0,089 Mbp, 0,0043 Mbp, và 0,0035 Mbp. ADN là dạng vòng [62]. 1.1.1.4. Tính chất nuôi cấy Klebsiella pneumoniae là loài sống hiếu kỵ khí tùy nghi. Phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường [6] [17]. - Trên thạch dinh dưỡng hay thạch máu, khuẩn lạc lầy nhầy có màu xám, kích thước 3-4mm, dạng M, tuy nhiên vẫn có thể gặp một số khuẩn lạc dạng R. - Trong canh thang, vi khuẩn mọc nhanh và đục đều, ở đáy ống có lắng cặn. Hình 1.2. Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên môi trường CA
6 1.1.1.5. Tính chất hóa sinh Lên men nhiều loại đường: glucose, lactose, saccarose. Phản ứng indol âm tính. Phản ứng citrat dương tính. Urease dương tính. Phản ứng Red Methyl âm tính. Phản ứng Voges-Proskauer dương tính. H 2 S âm tính [6] [17]. 1.1.2. Khả năng gây bệnh 1.1.2.1. Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn Gram âm thường nguy hiểm hơn vì màng ngoài của chúng được bọc bởi một nang. Nang này che các kháng nguyên làm cơ thể phát hiện tác nhân xâm lấn khó khăn hơn. Ngoài ra, màng ngoài vi khuẩn Gram âm có chứa lipopolysaccharide, đóng vai trò là nội độc tố và làm tăng độ nặng của phản ứng viêm, có thể gây sốc nhiễm khuẩn [4] [6]. 1.1.2.2. Biểu hiện lâm sàng Trong những năm gần đây, Klebsiella pneumoniae đã trở thành tác nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện, gây nhiễm trùng cơ hội ở những bệnh nhân bị suy giảm miễm dịch hoặc ở các bệnh nhân đang hồi sức hô hấp (đang dùng máy hô hấp nhân tạo), gây nhiễm trùng đường hô hấp dưới như viêm phổi, viêm phế quản thứ phát, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu, đường mật, đường sinh dục, viêm màng não, viêm xoang, viêm nội tâm mạc [4] [6]. 1.1.3. Chẩn đoán vi sinh vật Chủ yếu dựa vào chẩn đoán trực tiếp từ các bệnh phẩm khác nhau: đàm, mủ, máu, dịch não tủy... bằng cách nuôi cấy lên các môi trường thích hợp để phân lập và xác định vi khuẩn dựa vào hình thể, tính chất nuôi cấy đặc biệt (khuẩn lạc nhầy, dính), tính chất sinh hóa, khả năng gây bệnh. Xác định type bằng phản ứng ngưng kết hoặc phản ứng phình vỏ với kháng huyết thanh đặc hiệu type [4] [6]. 1.1.4. Phòng bệnh và điều trị + Phòng bệnh Hiện nay chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu. Thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung. Chủ yếu là tránh những điều kiện thuận lợi cho nhiễm trùng cơ hội xuất hiện bằng cách nâng cao sức đề kháng của người bệnh và dự phòng tốt các nhiễm trùng bệnh viện [4] [6].
7 + Điều trị Sử dụng kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên Klebsiella pneumoniae thường có sức đề kháng cao với kháng sinh. Nên cần cẩn thận, cân nhắc để lựa chọn kháng sinh công hiệu [4] [6]. 1.2. Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh 1.2.1. Định nghĩa kháng sinh - Năm 1928, nhà khoa học Alexander Flemming người Scotland lần đầu tiên thấy trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm Penicilium thì khuẩn lạc gần nấm này sẽ không phát triển được, sau đó chất peniciline đã được chiết xuất từ nấm để dùng trong điều trị. - Vào năm 1941, peniciline trở thành kháng sinh đầu tiên được tìm ra và được sản xuất để dùng trong lâm sàng. Khi đó, kháng sinh được coi là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật khác, từ gốc Hy Lạp là antibiotic, nghĩa là chống lại sự sống. - Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên và nhân tạo, do đó định nghĩa kháng sinh đã thay đổi: kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn [3] [14]. 1.2.2. Phân loại kháng sinh - Ngày nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh, trong đó có khoảng 100 loại dùng trong y khoa và thú y [38]. - Có nhiều cách để phân loại kháng sinh [1] [10] [38] [73] [83]. 1.2.2.1. Dựa vào khả năng tác dụng Gồm kháng sinh diệt khuẩn, kháng sinh hãm khuẩn.  Kháng sinh diệt khuẩn ß-lactams: Penicillin, Ampicillin, Amoxcillin, Cephalosporin Aminosid: Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Spectinomycin
8 Quinolon: Flumequin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Marbofloxacin Polypeptid: Colistin, Bacitracin, Polymycin  Kháng sinh hãm khuẩn Tetracyclin: Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlotetracyclin, Doxycyclin Macrolid: Erythromycin, Spiramycin, Tylosin, Tiamulin, Josamycin Lincomycin, Phenicol: Chloramphenicol, Thiamphenicol, Florfenicol Sulfamid, Diaminopyrimidin: Trimethoprim, Diaveridin, Ormethoprim, Pyrimethamin 1.2.2.2. Dựa vào phổ tác dụng Tùy thuộc vào phạm vi của các loại vi khuẩn mà nó ảnh hưởng người ta chia: kháng sinh đặc hiệu, kháng sinh phổ rộng, kháng sinh phổ hẹp.  Kháng sinh đặc hiệu là các loại kháng sinh có khả năng tác động lên một loại vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn nhất định (Spectinomycin tác động lên vi khuẩn lậu).  Các loại kháng sinh phổ rộng có hoạt tính đối với nhiều loại vi khuẩn khác nhau, được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh truyền nhiễm. Nhóm này gồm: Amoxicillin; Carbapenems: Imipenem, Meropenem, Ertapenem; Piperacillin/tazobactam; Levofloxacin, Gatifloxacin, Moxifloxacin, Ciprofloxacin; Streptomycin; Tetracycline; Chloramphenicol; Ticarcillin...  Kháng sinh phổ hẹp là các loại kháng sinh chỉ tác động lên một loại vi khuẩn gồm: Azithromycin, Clarithromycin, Clindamycin, Erythromycin, Vancomycin... 1.2.2.3. Dựa vào nguồn gốc Gồm kháng sinh tổng hợp tự nhiên, bán tổng hợp, tổng hợp.  Tổng hợp tự nhiên: được sản xuất và phân lập từ các sinh vật sống. Benzylpenicilin là một penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum. Aztreonam (Azactam): là chất duy nhất của nhóm Monobactam được phân lập từ Chromobacterium violacerum.  Tổng hợp: tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh như sulfonamides, quinolones, oxazolidinones...  Bán tổng hợp: biến đổi về mặt hóa học từ các hợp chất ban đầu được tìm thấy trong tự nhiên như là beta-lactams (trong đó bao gồm penicillins được sản suất bởi
9 nấm trong chi Penicillium, cephalosporins, carbapenems) 1.2.2.4. Dựa trên cấu trúc hóa học  Nhóm beta lactam: Các kháng sinh β-lactam được chia thành 4 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học: - Các penam: vòng A có 5 cạnh bão hòa, gồm các penicilin và các chất ức chế β- lactamase. - Các cephem: vòng A có 6 cạnh không bão hòa, gồm các cephalosporin. - Các penem: vòng A có 5 cạnh không bão hòa, gồm các imipenem, ertapenem. - Các monobactam: không có vòng A, là kháng sinh có thể tổng hợp như aztreonam. Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của 4 nhóm β-lactam Phân loại kháng sinh nhóm beta lactam [17] [38] Bảng 1.1. Lớp, phân lớp kháng sinh beta lactam Lớp kháng sinh Phân nhóm kháng sinh Kháng sinh tiêu biểu Penicillins Penicillin Penicillin Amino- penicillin Ampicillin, Amoxicillin Ureido- penicillin Azlocillin, Mezlocillin, Piperacillin Carboxy- penicillin Carpenicillin, Ticarcillin