Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân trong đánh giá sàng lọc phôi tiền làm tổ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:94

Thêm vào BST

Báo xấu

48
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là giải trình tự và xác định tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân của các mẫu phôi sinh thiết; khảo sát tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân ở các nhóm phôi khác nhau trong xét nghiệm PGT-A. Từ đó, khảo sát sự tương quan giữa chỉ số MA (tỷ số ADN ty thể/ADN nhân) và các tiêu chí chọn phôi hiện tại, tiềm năng của chỉ số MA trong việc đánh giá ưu tiên chuyển phôi ở mức độ di truyền.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân trong đánh giá sàng lọc phôi tiền làm tổ

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Thị Thanh Huyền MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỶ LỆ ADN TY THỂ VÀ ADN NHÂN TRONG ĐÁNH GIÁ SÀNG LỌC PHÔI TIỀN LÀM TỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------------------------- Trần Thị Thanh Huyền MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỶ LỆ ADN TY THỂ VÀ ADN NHÂN TRONG ĐÁNH GIÁ SÀNG LỌC PHÔI TIỀN LÀM TỔ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1: TS. Nguyễn Thị Trang Huyền Hướng dẫn 2: TS. Trần Thị Thanh Huyền Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nêu trong luận văn chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các số liệu, ví dụ và trích dẫn trong luận văn đảm bảo tính chính xác, tin cậy và trung thực. Tôi đã hoàn thành tất cả các môn học và đã thanh toán tất cả các nghĩa vụ tài chính theo quy định của Phòng Đào tạo - Học viện Khoa học và Công nghệ. Vậy tôi viết Lời cam đoan này đề nghị Phòng Đào tạo - Học viện Khoa học và Công nghệ xem xét để tôi có thể bảo vệ luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! NGƯỜI CAM ĐOAN Trần Thị Thanh Huyền
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, bên cạnh sự cố gắng và nỗ lực của bản thân tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới các tập thể và cá nhân đã tận tình giúp đỡ tôi. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Trang Huyền- Trường Đại Học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, TS. Trần Thị Thanh Huyền- Trung tâm công nghệ cao Vinmec – Hệ thống y tế Vinmec đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ, chỉ bảo tận tình về chuyên môn và sự động viên chân thành của tập thể nhân viên phòng Xét nghiệm, công ty TNHH Công nghệ GenHD. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô Phòng Đào tạo - Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày … tháng …. năm 2020 Học viên TRẦN THỊ THANH HUYỀN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic ADP Adenosine diphosphate Phân tử mang năng lượng ARN Ribonucleic acid Axit ribonucleic ATP Adenosine triphosphate Phân tử mang năng lượng bp Base pair Cặp bazơ Comprehensive chromosome Sàng lọc nhiễm sắc thể toàn CCS screening diện Comparative genomic Phương pháp lai so sánh hệ CGH hybridization gen CNV Copy number variation Biến thể số lượng bản sao dNTP Deoxynucleotide triphosphates Deoxynucleotit triphotphat FADH2 Flavin adenine dinucleotide Flavin adenin dinucleotit Fluorescence in situ Kỹ thuật lai huỳnh quang tại FISH hybridization chỗ ICM Inner cell mass Nguyên bào phôi Intra- cytoplasmic sperm Tiêm trực tiếp tinh trùng ICSI injection vào noãn để tạo phôi Bơm tinh trùng vào buồng IUI Intrauterine insemination tử cung ISH In situ hybridization Lai ghép tại chỗ
ISP Ion Sphere Particles Hạt ISP IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm kb Kilobyte Kích thước tập tin Đơn vị khối lượng nguyên kDA Kilodalton tử Tỷ lệ ADN ty thể/ ADN MA mtDNA/nuDNA nhân Mb Megabyte Đơn vị thông tin mRNA Messenger ribonucleic acid ARN thông tin mtDNA Mitochondrial DNA Hệ gen ty thể Nicotinamide adenine Nicotinamit adenin NADH dinucleotide dinucleotit NGS Next generation sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới NST Nhiễm sắc thể nuDNA Nuclear DNA Hệ gen nhân PGCs Primordial germ cells Tế bào mầm nguyên thủy Preimplantation genetic testing Sàng lọc di truyền trước PGT-A for - Aneuploidy chuyển phôi QC Quality control Kiểm soát chất lượng Quantitative Polymerase Chain qPCR Định lượng phản ứng chuỗi Reaction
ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy hoạt động TE Trophectoderm Nguyên bào lá nuôi tRNA Transfer ribonucleic acid ARN vận chuyển WGA Whole genome amplification Khuếch đại toàn bộ hệ gen WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới µl Microliter Micro lít µm Micrometer Micro mét
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Ưu- nhược điểm của một số phương pháp hỗ trợ sinh sản ............. 5 Bảng 1. 2. Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phân chia theo tổ chức Alpha .............................................................................................................. 11 Bảng 1. 3. Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phôi nang theo Gardner’s ......................................................................................................................... 12 Bảng 1. 4. Ưu và nhược điểm của ba giai đoạn thực hiện sinh thiết phôi ...... 14 Bảng 2. 1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 29 Bảng 3. 1. Số lượng và tỷ lệ phần trăm (%) tổng số phôi nghiên cứu ............ 45 Bảng 3. 2. Số lượng và tỷ lệ phần trăm (%) tổng số phôi có hình thái tốt...... 51
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. 1. Sơ đồ quy trình PGT- A ................................................................... 7 Hình 1. 2. Hình ảnh time- lapse cho thấy sự phát triển của phôi ở các giai đoạn phát triển ................................................................................................... 8 Hình 1. 3. Bộ gen của ty thể động vật có vú mã hóa 13 polypeptit của chuỗi truyền điện tử ................................................................................................. 20 Hình 1. 4. Cơ chế di truyền thắt cổ chai ADN ty thể (mtDNA) ..................... 22 Hình 1. 5. Ion Torrent trên công nghệ bán dẫn.. ............................................. 28 Hình 2. 1. Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm ............................................. 31 Hình 2. 2. Tổng quan các bước tạo thư viện ................................................... 33 Hình 2. 3. Sơ đồ hóa quy trình hoạt động chuẩn bị khuôn giải trình tự ......... 35 Hình 2. 4. Tinh sạch bằng hạt từ tạo ADN sợi đơn ........................................ 36 Hình 2. 5. Quy trình xử lý dữ liệu giải trình tự trong phần mềm Torrent Suite ......................................................................................................................... 37 Hình 2. 6. Kết quả giải trình tự phôi 46, XY .................................................. 38 Hình 2. 7. Kết quả giải trình tự phôi 46, XX .................................................. 38 Hình 3. 1. Kết quả điện di sản phẩm sau bước khuếch đại ............................. 39 Hình 3. 2. Đánh giá tổng quan về chất lượng kết quả giải trình tự của 1 chu kì PGT-A ............................................................................................................. 40 Hình 3. 3. Đánh giá chất lượng kết quả giải trình tự của từng mẫu................ 41 Hình 3. 4. Đánh giá chất lượng kết quả xử lý số liệu giải trình tự ................. 42 Hình 3. 5. Hình ảnh phân tích các mẫu sinh thiết phôi ................................... 43 Hình 3. 6. Sự phân bố các đoạn đọc trên ty thể ở một số mẫu phôi ............... 44 Hình 3. 7. Sự phân bố chỉ số MA giữa nhóm phôi có hình thái không tốt và nhóm phôi có hình thái tốt. ............................................................................. 45 Hình 3. 8. Phôi có 1 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 19) .......................... 46
Hình 3. 9. Phôi có 3 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 4, 8 và 22) .............. 46 Hình 3. 10. Phôi có 5 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 4, 13, 14, 15, 21) .. 47 Hình 3. 11. Phôi có 13 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 3, 4, 5, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 21 và Y) ............................................................................. 47 Hình 3. 12. Sự phân bố số lượng phôi trong từng nhóm theo số NST bị bất thường.............................................................................................................. 47 Hình 3. 13. Sự phân bố chỉ số MA dựa theo nhóm phôi có số NST bị bất thường.............................................................................................................. 48 Hình 3. 14. Sự phân bố số lượng phôi theo mức độ bất thường số lượng NST ......................................................................................................................... 49 Hình 3. 15. Sự phân bố chỉ số MA giữa các nhóm phôi theo mức độ bất thường NST ..................................................................................................... 50 Hình 3. 16. Sự phân bố chỉ số MA giữa các nhóm phôi theo trạng thái bất thường số lượng NST ...................................................................................... 52
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4 1.1. VÔ SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP HỖ TRỢ SINH SẢN ............. 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI (PGT- A) ............................................................. 6 1.2.1. Sinh thiết phôi ................................................................................ 7 1.2.2. Các kỹ thuật phân tích di truyền sàng lọc phôi ............................ 15 1.2.3. Khó khăn của PGT-A ................................................................... 18 1.3. TỔNG QUAN VỀ TY THỂ ............................................................... 19 1.3.1. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể ................ 19 1.3.2. Chức năng của ty thể .................................................................... 22 1.4. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ ADN TY THỂ TRONG IVF ..... 24 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TY THỂ.................... 26 1.5.1. Phương pháp định lượng phản ứng chuỗi (quantitative polymerase chain reaction/qPCR) ................................................................................ 26 1.5.2. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS: Next generation sequencing) ............................................................................................... 27 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 29 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU .......................................................................... 29
2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................. 29 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 29 2.1.3. Hóa chất .......................................................................................... 29 2.1.4. Máy móc và trang thiết bị ............................................................... 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 30 2.2.1. Thu thập mẫu .................................................................................. 32 2.2.2. PGT-A ............................................................................................. 32 2.2.3. Phân tích số liệu .............................................................................. 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 39 3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI THƯ VIỆN ............................................... 39 3.2. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ................................................................ 40 3.2.1. Sơ bộ về chất lượng giải trình tự và bộ số liệu thô ......................... 40 3.2.2. Tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân ở phôi hình thái tốt và hình thái không tốt ................................................................................................... 44 3.2.3. Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân về hình thái phôi và bất thường di truyền ..................................................................... 46 3.2.4. Mối liên quan tỷ lệ giữa ADN ty thể và ADN nhân trong nhóm phôi lệch bội và nguyên bội có hình thái tốt ..................................................... 50 3.3. THẢO LUẬN ....................................................................................... 52 3.3.1. Tương quan giữa chỉ số MA và hình thái phôi ............................ 52 3.3.2. Tương quan tỷ lệ chỉ số MA giữa các nhóm phôi nguyên bội và lệch bội ở phôi có hình thái tốt ................................................................. 55 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 57 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 57 4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 66
1 MỞ ĐẦU Thống kê mới nhất từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO - World Health Organization) cho biết Việt Nam đang là một trong những quốc gia tại khu vực Châu Á - Thái Bình Dương có tỷ lệ vô sinh khá cao [1]. Hiện tại, vô sinh hiếm muộn đang dần trẻ hóa và có diễn biến phức tạp, gây khó khăn và áp lực không nhỏ lên quá trình hỗ trợ và điều trị sinh sản. Theo số liệu từ Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản - Bệnh viện Phụ sản Trung ương, nếu như 10 năm trước chỉ tiếp nhận 2-3 cặp vợ chồng có các vấn đề về sức khỏe sinh sản mỗi ngày thì năm 2015 con số này đã tăng lên gấp 20 lần. Các phương pháp hỗ trợ sinh sản cho thấy sự tiến bộ đáng kể trong hơn 30 năm qua; nhờ đó khả năng điều trị thành công vô sinh hiếm muộn cũng dần tăng lên. Tuy đã có những cải thiện đáng kể nhưng tỷ lệ sinh sau IVF (In Vitro Fertilization - Thụ tinh trong ống nghiệm) vẫn còn tương đối thấp, trung bình chỉ từ 20 – 30% mỗi lần chuyển phôi tươi ở hầu hết các phòng khám [2], [3]. Mặc dù các phương pháp giúp tăng tỷ lệ cấy phôi thành công đã được đề xuất và thực hiện như: chấm điểm hình thái phôi, FISH (Fluorescence in situ hybridization- Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ), CGH (Comparative genomic hybridization- Phương pháp lai so sánh hệ gen), NGS (Next generation sequencing- Giải trình tự gen thế hệ mới), sàng lọc nhiễm sắc thể toàn diện (CCS- Comprehensive chromosome screening), xét nghiệm thụ thể nội mạc tử cung…nhưng phương pháp được nhiều trung tâm ưu tiên sử dụng đến nay vẫn là dựa trên những đánh giá về đặc điểm hình thái. Tuy nhiên, đánh giá hình thái phôi không phản ánh hoàn toàn chất lượng thực của phôi. Những phôi được chỉ định ở mức hình thái tốt nhất cũng có khả năng không thể làm tổ hoặc không phát triển thành trẻ khỏe mạnh. Một trong những nguyên nhân chính của việc phôi làm tổ thất bại hay bị sảy thai là do sự hiện diện của các bất thường về số lượng nhiễm sắc thể (lệch bội) trong các tế bào phôi. PGT-A (Preimplantation genetic testing for Aneuploidy/Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi) được phát triển để phát hiện những bất thường như vậy trong các mẫu phôi sinh thiết. Dựa trên kết quả PGT-A, bác sĩ lâm sàng
2 sẽ xác định và ưu tiên chuyển những phôi bình thường về số lượng nhiễm sắc thể [4]. Dù vậy, vẫn có trường hợp phôi nguyên bội nhưng không thể làm tổ thành công [5]. Do đó, việc kết hợp kết quả xét nghiệm PGT-A với một số yếu tố đánh giá bổ sung trong bước chọn phôi ưu tiên làm tổ là cần thiết để tăng hiệu quả IVF. Ty thể là bào quan thiết yếu chịu trách nhiệm sản xuất năng lượng trong tế bào, chúng có hệ gen riêng và sao chép độc lập với chu kì tế bào. Số lượng ty thể trong tế bào là một dấu hiệu cho thấy mức độ hoạt động của tế bào đó (tế bào trứng có khoảng 105 bản sao mtDNA, tế bào sinh dưỡng có khoảng 10³- 104 bản sao của mtDNA) [6] và có vai trò quan trọng trong chức năng của tế bào. Gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy mtDNA như một dấu ấn sinh học trong sự làm tổ của phôi. Tuy những báo cáo đó cho thấy hàm lượng mtDNA cao trong phôi nang có liên quan đến khả năng làm tổ kém thì bên cạnh đó một số công trình nghiên cứu khác không đồng thuận với quan điểm này. Các yếu tố gây nhiễu có thể ảnh hưởng đến số lượng bản sao của mtDNA trong phôi nguyên bội. Cho đến nay, có rất ít nghiên cứu tiến hành xem xét vai trò của hàm lượng mtDNA ảnh hưởng tới kết quả quá trình sàng lọc trước khi chuyển phôi và liệu số bản sao mtDNA có thể được xem là một tiêu chí giúp bác sĩ lâm sàng chọn lọc phôi để chuyển hay không vẫn còn bỏ ngỏ. Ở Việt Nam chưa có trung tâm hỗ trợ sinh sản IVF nào xem xét số liệu về hàm lượng mtDNA trong xét nghiệm PGT-A. Từ đó có thể thấy, nghiên cứu hàm lượng mtDNA trong hỗ trợ sinh sản ở thế giới và Việt Nam là một hướng đi còn khá mới và mở rộng. Xuất phát từ thực tiễn và yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân trong đánh giá sàng lọc phôi tiền làm tổ”. Mục tiêu của đề tài:  Giải trình tự và xác định tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân của các mẫu phôi sinh thiết.  Khảo sát tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân ở các nhóm phôi khác nhau trong xét nghiệm PGT-A. Từ đó, khảo sát sự tương quan giữa chỉ số
3 MA (tỷ số ADN ty thể/ADN nhân) và các tiêu chí chọn phôi hiện tại, tiềm năng của chỉ số MA trong việc đánh giá ưu tiên chuyển phôi ở mức độ di truyền. Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu mối tương quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa phôi có hình thái tốt và hình thái không tốt.  Nghiên cứu mối tương quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa các nhóm phôi nguyên bội, nhóm phôi lệch bội, thể khảm và thể khảm- lệch bội.  Nghiên cứu mối tương quan tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa phôi hình thái tốt nguyên bội và phôi hình thái tốt lệch bội.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VÔ SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP HỖ TRỢ SINH SẢN Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vô sinh là một bệnh trong hệ thống sinh sản được xác định là do người phụ nữ không mang thai lâm sàng trên 12 tháng sau khi quan hệ tình dục thường xuyên và không sử dụng các biện pháp phòng tránh. Vô sinh nguyên phát là vô sinh ở một cặp vợ chồng chưa bao giờ có con. Vô sinh thứ phát là thất bại trong việc thụ thai sau lần mang thai trước [1]. Một định nghĩa khác về vô sinh được sử dụng ở Mỹ, một người phụ nữ dưới 35 tuổi không thụ thai sau 12 tháng giao hợp mà không sử dụng các biện pháp tránh thai. Nếu trên 35 tuổi, sau 6 tháng quan hệ tình dục không sử dụng các biện pháp tránh thai mà vẫn không thụ thai. Ở Anh, vô sinh là không thể thụ thai sau khi quan hệ tình dục thường xuyên không sử dụng các biện pháp tránh thai trong 2 năm, trong trường hợp không có bệnh lý sinh sản đã biết [7]. Vô sinh nam chiếm khoảng 20-35% các trường hợp vô sinh, trong khi 20-35% là do vô sinh nữ, 30- 40% là do các vấn đề xảy ra ở cả 2 giới và 10- 15% các trường hợp không tìm thấy nguyên nhân [8]. Nguyên nhân phổ biến nhất gây vô sinh nữ là các vấn đề về rụng trứng, thường biểu hiện bằng các kỳ kinh nguyệt thưa thớt hoặc vắng mặt. Vô sinh nam thường gặp nhất là do các vấn đề trong quá trình xuất tinh, sự thiếu hụt tinh trùng trong tinh dịch, và chất lượng tinh trùng … Sự phát triển của y học và khoa học kỹ thuật với những bước tiến lớn đã tạo ra các phương pháp hỗ trợ sinh sản có thể giúp khắc phục tình trạng hiếm muộn, vô sinh. Tùy vào tình trạng của bệnh nhân mà bác sĩ sẽ chỉ định thực hiện các phương pháp hỗ trợ sinh sản khác nhau: Thụ tinh nhân tạo- Bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI); Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) hoặc thụ tinh trong ống nghiệm theo phương pháp tiêm trực tiếp tinh trùng vào noãn để tạo phôi (ICSI); hỗ trợ phôi thoát màng; cho nhận noãn, tinh trùng và phôi; phương pháp trưởng thành noãn trong ống nghiệm; chuyển giao tử qua ống dẫn trứng, …
5 Bảng 1. 1. Ưu- nhược điểm của một số phương pháp hỗ trợ sinh sản Các phương pháp Chỉ định Tỷ lệ thành công Ưu điểm Khuyết điểm hỗ trợ sinh sản + Rối loạn khả năng xuất tinh. + Tùy thuộc vào + Kỹ thuật đơn + Chịu ảnh hưởng của + Chất lượng tinh trùng kém: ít, lứa tuổi. giản, thời gian thực thuốc kích thích rụng Thụ tinh nhân tạo kém di động... + 15-20% trong hiện ngắn. trứng. - Bơm tinh trùng + Rụng trứng không đều. mỗi chu kì. + Chi phí phù hợp, + Áp lực canh rụng vào buồng tử cung + Lạc nội mạc tử cung nhẹ, trung tự nhiên. trứng. (IUI) bình. + Bất tiện. + Vô sinh không rõ nguyên nhân. + Nguy cơ mang đa thai. + Tinh trùng ít, xuất tinh ngược + 41% (dưới 35 + Hiệu quả cao. + Phải IVF hơn 1 lần. hoặc không xuất tinh. tuổi). + Có thể lưu phôi. + Tác dụng phụ bởi hội + Không có tinh trùng. + 32% (35-37 tuổi). + Vừa có thể có chứng kích thích buồng + Lạc nội mạc tử cung + 23% (38-40 tuổi). con, vừa có thể sử trứng. Thụ tinh trong + Tắc 2 vòi trứng. dụng trong sản + Đa thai (20-30%), thai ống nghiệm (IVF) + Xin trứng. khoa để sàng lọc di ngoài tử cung (1-3%). + Vô sinh không rõ nguyên nhân. truyền. + Kỹ thuật phức tạp, đòi + Bơm tinh trùng vào buồng tử hỏi tay nghề chuyên môn cung nhiều lần nhưng thất bại. cao, tốn kém. + Chất lượng tinh trùng ít, kém, + 31% (35-37 tuổi). + Tận dụng trứng + Tốn kém, mất thời Phương pháp tiêm không có tinh trùng. + 21% (38-40 tuổi). đông lạnh. gian. trực tiếp tinh + Các trường hợp không rõ + 11% (41-42 tuổi). + Áp dụng cho + Biến chứng cho thai trùng vào noãn để nguyên nhân. + 5% (trên 43 tuổi). trường hợp vô sinh nhi tạo phôi (ICSI) nặng. + Mang đa thai, ngoài tử cung.
6 Thông thường khi tiến hành điều trị vô sinh, IUI sẽ được cân nhắc đầu tiên vì đây là phương pháp hỗ trợ sinh sản giúp người phụ nữ có thể mang thai một cách tự nhiên. Tuy nhiên, đối với các cặp vợ chồng không thể thụ thai tự nhiên hoặc thụ tinh nhân tạo thất bại nhiều lần, IVF/ICSI là lựa chọn tối ưu do hiệu quả mà chúng đem lại trong việc chữa trị vô sinh hiếm muộn. Do tỷ lệ thành công tương đối cao và ít gây ảnh hưởng tới phôi nên phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm IVF đang là phương pháp điều trị vô sinh hiếm muộn phổ biến hiện nay. Song song với việc thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm, để tăng khả năng mang thai và giảm rủi ro sảy thai, ngày nay người ta áp dụng một số xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi để xác định những bất thường về mặt gen di truyền ở các phôi được tạo ra trong quá trình IVF. 1.2. TỔNG QUAN VỀ XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI (PGT- A) Phôi bình thường ở người có 23 cặp nhiễm sắc thể (22 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính). Một bản sao của cặp nhiễm sắc thể được di truyền từ mẹ và bản còn lại được di truyền từ bố. Các bất thường xảy ra trong giai đoạn đầu của sự phát triển ở tinh trùng, tế bào trứng hoặc phôi đều có thể dẫn tới sự sai lệch về số lượng các nhiễm sắc thể trong phôi. Trường hợp có thêm hoặc mất một hay nhiều nhiễm sắc thể được gọi là sự lệch bội (bất thường số lượng nhiễm sắc thể). Sự lệch bội là nguyên nhân cho phần lớn các trường hợp sảy thai trong ba tháng đầu của thai kỳ, là yếu tố quan trọng làm cho tỷ lệ sinh thấp ở người và sự thất bại của IVF. Các bất thường nhiễm sắc thể có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi của phụ nữ, tỷ lệ này gia tăng theo tuổi mẹ. Hầu hết các bất thường nhiễm sắc thể đều không phù hợp với sự phát triển của phôi dẫn tới phôi không làm tổ, sảy thai hoặc sinh non. Trong trường hợp những đứa trẻ này được sinh ra thường bị ảnh hưởng bởi các rối loạn di truyền như hội chứng Down (sự có mặt của 3 bản sao nhiễm sắc thể số 21), hội chứng Patau (3 bản sao nhiễm sắc thể số 13), hội chứng Edward (3 bản sao nhiễm sắc thể số 18), hội chứng Turner (1 bản sao nhiễm sắc thể giới tính X ở nữ), …
7 PGT-A (Xét nghiệm sàng lọc di truyền trước chuyển phôi) là một xét nghiệm di truyền cho phép xác định những bất thường số lượng nhiễm sắc thể trong phôi được thực hiện IVF bằng cách sàng lọc toàn bộ 23 cặp nhiễm sắc thể người. Những phôi mang đúng số lượng nhiễm sắc thể sẽ có khả năng phát triển thành những đứa trẻ bình thường. Bằng cách chọn lọc các phôi khỏe mạnh mang đúng số lượng nhiễm sắc thể để chuyển vào tử cung của thai phụ, PGT-A giúp cải thiện tỷ lệ thành công IVF và khả năng thụ thai sau chuyển phôi, giảm tỷ lệ sảy thai, cho phép chuyển đơn phôi - giảm nguy cơ biến chứng khi chuyển đa phôi, tránh sinh ra những đứa trẻ mang hội chứng di truyền…[9]. IVF tạo Sinh thiết Xét nghiệm Chuyển phôi phôi di truyền phôi Hình 1. 1. Sơ đồ quy trình PGT- A 1.2.1. Sinh thiết phôi 1.2.1.1. Sự phát triển của phôi trước khi làm tổ Khi tinh trùng lọt vào bào tương noãn, màng tế bào bọc tinh trùng sát nhập với màng tế bào bọc noãn. Nhân và bào tương tinh trùng lọt vào bào tương của noãn, màng tinh trùng nằm lại bên ngoài noãn và nhân của tinh trùng gọi là tiền nhân đực. Cùng lúc đó, noãn bào 2 đã hoàn thành lần phân chia thứ 2 của quá trình giảm phân sinh ra noãn chín (tiền nhân cái) và cầu cực 2 [10].
8 Hình 1. 2. Hình ảnh time- lapse cho thấy sự phát triển của phôi ở các giai đoạn phát triển [Nguồn: https://www.utahfertility.com/understanding-embryo-grading/] 18 giờ sau khi quá trình thụ tinh diễn ra, sự xuất hiện của 2 tiền nhân (đực - cái) và 2 cầu cực (sản phẩm hai lần phân bào giảm nhiễm của noãn) chứng tỏ noãn đã được thụ tinh thành công. Chỉ sau đó vài giờ, 2 tiền nhân tiến lại gần nhau, hòa màng và hợp nhân. Hợp tử hình thành chứa nhân tế bào với bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội và ngay lập tức tiến hành lần phân chia nguyên nhiễm đầu tiên sinh ra 2 phôi bào. 24 giờ sau thụ tinh, hợp tử bắt đầu quá trình phân chia gọi là phân cắt. Sự phân cắt phân chia hợp tử thành các phôi bào giống hệt nhau về hình thái và chức năng nhưng không làm thay đổi kích thước của hợp tử. Giai đoạn 4 phôi bào xuất hiện vào khoảng 40 - 50 giờ sau khi thụ tinh. Qua mỗi lần phân chia, các phôi bào mới được hình thành có kích thước nhỏ hơn phôi bào sinh ra nó nhưng kích thước của cả hợp tử thì không đổi. Vào đầu ngày thứ 4, khi trứng được thụ tinh có khoảng 12 -16 phôi bào, giai đoạn này gọi là phôi dâu.