Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến một số Exon của gen DJ 1 trên người bệnh Parkinson

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:107

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là phân tích và đánh giá các điểm đột biến một số exon của gen DJ-1 trên người bệnh Parkinson; đánh giá mối liên quan của những đột biến được xác định với một số biểu hiện lâm sàng điển hình trên người bệnh Parkinson. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến một số Exon của gen DJ 1 trên người bệnh Parkinson

BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hồ Trường Giang NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN MỘT SỐ EXON CỦA GEN DJ-1 TRÊN NGƯỜI BỆNH PARKINSON LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hồ Trường Giang NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN MỘT SỐ EXON CỦA GEN DJ-1 TRÊN NGƯỜI BỆNH PARKINSON Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy Hà Nội, 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 HỒ TRƯỜNG GIANG
LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu của tôi được thực hiện tại Phòng Hệ gen học Vi sinh – Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của đề tài được tiến hành thuận lợi. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Hệ gen học Vi sinh thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện nghiên cứu, điều này khiến tôi thực sự cảm kích và biết ơn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô thuộc Khoa Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy, truyền thụ kiến thức để tôi hoàn thành khóa học và nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã luôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 HỒ TRƯỜNG GIANG
1 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU ............................................ 4 DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ 6 DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... 7 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 8 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 10 1.1. BỆNH PARKINSON ............................................................................... 11 1.1.1. Khái niệm .............................................................................................. 11 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ................................................................................... 11 1.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ ..................................................... 18 1.1.4. Một số đặc điểm lâm sàng bệnh Parkinson ........................................... 20 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN BỆNH PARKINSON......... 21 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 21 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 24 1.3. CƠ SỞ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH PARKINSON .................................................................................................. 25 1.3.1. Vai trò của một số gen trong bệnh Parkinson ....................................... 25 1.3.2. Cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của gen DJ-1 ....................... 26 1.3.3. Vai trò gen DJ-1 trong bảo vệ chống oxy hóa tế bào thần kinh ........... 29 1.3.4. Tương tác của DJ-1 và ty thể ................................................................ 30 1.3.5. Sự thiếu hụt gen DJ-1 ........................................................................... 32 1.3.6. Đột biến gen DJ-1 trong bệnh Parkinson .............................................. 32
2 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 33 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ......................................... 33 2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng và mẫu nghiên cứu .............................. 33 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ................................................................................ 33 2.1.3. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................... 34 2.1.4. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................... 34 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ..................................................................... 35 2.2.1. Hóa chất................................................................................................. 35 2.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 35 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 35 2.3.1. Thu thập đối tượng nghiên cứu ............................................................. 35 2.3.2. Thu thập và bảo quản mẫu .................................................................... 36 2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 37 2.3.4. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng DNA tổng số .............................. 38 2.3.5. Thiết kế mồi .......................................................................................... 39 2.3.6. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR ...................................................... 40 2.3.7. Giải trình tự DNA ................................................................................. 41 2.3.8. Phân tích số liệu .................................................................................... 45 2.3.9. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ......................................................... 45 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 46 3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .................... 46 3.1.1. Phân bố bệnh nhân Parkinson theo độ tuổi và giới tính ....................... 46 3.1.2. Phân bố bệnh nhân theo thời gian mắc bệnh và giai đoạn bệnh ........... 48
3 3.2. KHUẾCH ĐẠI VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC EXON TRONG GEN DJ-1 ................................................................................................................. 49 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................... 49 3.2.2. Khuếch đại các exon trong gen DJ-1 .................................................... 50 3.2.3. Xác định trình tự các đoạn exon trong gen DJ-1 .................................. 53 3.3. PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN DJ-1 ........................................... 54 3.3.1. Kết quả xác định các đột biến trên exon 5 gen DJ-1. ........................... 57 3.3.2. Kết quả xác định các đột biến exon 7 gen DJ-1 . ................................. 59 3.3.3. Đột biến intron 4 và intron 5 của gen DJ-1 .......................................... 61 3.4. ĐỐI CHIẾU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG ĐIỂN HÌNH TRÊN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU………………………………………………63 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 66 4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 66 4.1.1. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu .......................................... 66 4.1.2. Phân tích và đánh giá các đột biến gen DJ-1 và đối chiếu lâm sàng trên bệnh nhân Parkinson ....................................................................................... 66 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 68 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 78
4 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU Chữ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt APS Ammonium persulphate ATP Adenosine triphosphate Bcl-xL B-cell lymphoma-extra large U lympho tế bào B cực lớn BLB blood lysis buffer Dung dịch đệm phân giải tế bào máu bp base pair Cặp bazơ nitơ CMA Chaperone-mediated autophagy Tự thực bào qua trung gian chaperone DA Dopamine DNA Deoxyribonucleic Acid Acid deoxyribonucleic dNTP deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphotphat EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid GSH Glutathione Kb Kilobase Kilobazơ LAMP2A Lysosomal associated membrane Lysosome liên kết màng protein 2A protein 2A NF-kB Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi nhờ polymeraza
5 PD Parkinson disease Bệnh Parkinson RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic RNase Ribonuclease Ribonuclease ROS Reaction oxidative species Các chất có tính oxy hóa SNc Substantia Nigra pars compacta Phần đặc liềm đen TAE Tris – acetic acid – EDTA TE Tris – EDTA VTA Ventral tegmental area Vùng trần trung não UCP Uncoupling protein Protein không ghép cặp
6 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các gen chính và loci liên quan đến bệnh Parkinson Bảng 2.1. Trình tự mồi tương ứng của các exon 2, 3, 4, 5, 6, 7 gen DJ-1 Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR Bảng 2.3. Thành phần phản ứng giải trình tự Bảng 3.1. Phân bố bệnh nhân theo độ tuổi và giới tính Bảng 3.2. Phân bố bệnh nhân theo thời gian mắc bệnh và giai đoạn bệnh Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của các exon 2, 3, 4, 5, 6, 7 gen DJ-1 Bảng 3.4. Thông tin bệnh nhân và các đột biến gen DJ-1 Bảng 3.5. Các đột biến được xác định trên 6 exon của gen DJ-1 Bảng 3.6. Một số triệu chứng lâm sàng của nhóm bệnh nhân Parkinson Bảng 3.7. Đối chiếu một số đặc điểm lâm sàng trên nhóm bệnh nhân có đột biến gen DJ-1
7 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Parkinson và các triệu chứng điển hình Hình 1.2. Quá trình oxy hóa dopamine (DA) Hình 1.3. Chức năng gen DJ-1 trong tế bào Hình 1.4. Cấu trúc bộ gen của gen DJ-1 và một số đột biến được xác định trong bệnh Parkinson Hình 1.5. Gen DJ-1 được kích hoạt như một chất chống oxy hóa Hình 1.6. Cấu trúc của ba loại đường 5 carbon. Hình 1.7. Sơ đồ biểu diễn của một hệ thống giải trình tự DNA mao quản Hình 3.1. Kết quả điện di agarose kiểm tra tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu của 32 bệnh nhân Parkinson và 5 mẫu chứng Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại và tinh sạch của exon 2, kích thước 392 bp trên gel agarose 1%; M: Marker 1 kb PLUS. Hình 3.3. Sản phẩm PCR sau tinh sạch của 6 exon nghiên cứu. Hình 3.4. Ví dụ kết quả giải trình tự exon 6 đủ độ tin cậy và được lựa chọn Hình 3.5. Trình tự acid amin exon 5 của các mẫu bệnh và vị trí acid amin đột biến Hình 3.6. Trình tự acid amin exon 7 của các mẫu bệnh và vị trí acid amin đột biến Hình 3.7. Đặc điểm lâm sàng những trường hợp đột biến exon 7 gen DJ-1
8 MỞ ĐẦU Bệnh Parkinson là một bệnh gây nên rối loạn nhiều yếu tố của hệ thần kinh vận động. Đặc trưng lâm sàng chính của bệnh bao gồm các triệu chứng: run khi nghỉ, cứng cơ, vận động chậm, suy giảm tư thế,… Ngoài những thay đổi về vận động, bệnh nhân Parkinson còn có những triệu chứng suy giảm chức năng đi kèm của các hệ cơ quan khác như: tiêu hóa, tâm thần và một số giác quan,…. Những triệu chứng này là hậu quả của sự tổn thương (mất chức năng và/hoặc hoại tử) tiến triển của các tế bào hệ dopaminergic vùng liềm đen thuộc trung não dẫn đến gián đoạn dẫn truyền hệ dopaminergic ở vùng lưng thể vân, là nơi kết thúc tiền synap với các tế bào thần kinh này [1]. Ngày nay, sau bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson là chứng rối loạn thoái hóa thần kinh phổ biến thứ hai trên thế giới. Tỷ lệ mắc bệnh này phụ thuộc vào tuổi: bệnh Parkinson ảnh hưởng đến 1-2% dân số trên 60 tuổi, nhưng tỷ lệ này tăng lên 4-5% ở 85 tuổi [2]. Thống kê tại Mỹ, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson trong cộng đồng người da trắng là 120/100.000. Ở nhóm trên 65 tuổi, tỷ lệ đó là 1 - 1,5% [3]. Ở Châu Âu, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson ở nhóm bệnh nhân trên 65 tuổi là 1,6%. Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson so với các bệnh lý thần kinh khác là khoảng 1,6% [4]. Những nghiên cứu gần đây đã xác định được khoảng 11 gen của các dạng di truyền Parkinson. Các dạng di truyền do đột biến chiếm 10-15% của tất cả các trường hợp mắc bệnh Parkinson [5]. Cho đến nay, các nghiên cứu đã chỉ ra hai gen di truyền dạng trội của nhiễm sắc thể thường được cho là gây ra bệnh Parkinson, chủ yếu là di truyền từ mẹ hoặc cha hoặc cả hai: α- Synuclein (SNCA) và Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2); và bốn gen gây di truyền dạng lặn của nhiễm sắc thể thường: Parkin, Phosphatase và Tensin Homologue (PTEN) - giảm Kinase 1 (PINK1), PARK7 (DJ-1), và ATPase type 13A2 (ATP13A2). Trong đó, đột biến các gen Parkin, PINK1, và DJ-1 liên quan đến rối loạn chức năng ty thể và stress oxy hóa [6].
9 Gen DJ-1 mã hóa protein PARK 7 đóng vai trò là một cảm biến stress oxy hóa – nó loại bỏ các peroxide bằng cách tự oxy hóa (autoxidation) [7]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các tế bào có mức độ DJ-1 cao, có khả năng chống lại stress oxy hóa và chất độc thần kinh như 6-OHDA (6- hydroxydopamin) trong khi mức độ DJ-1 thấp hơn sẽ khiến các tế bào dễ bị stress oxy hóa hơn [8]. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng DJ-1 bảo vệ các tế bào thần kinh hệ dopaminergic chống lại các tổn thương oxy hóa không chỉ trong in vitro mà còn cả trong in vivo [9]. DJ-1 bị oxy hóa đã được chứng minh là giảm đáng kể trong bệnh Parkinson khởi phát sớm, nguyên phát. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen DJ-1. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đột biến các exon của gen DJ-1 trên bệnh nhân Parkinson ở Việt Nam. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đột biến một số exon của gen DJ-1 trên người bệnh Parkinson” với mục tiêu: 1. Phân tích và đánh giá các điểm đột biến một số exon của gen DJ-1 trên người bệnh Parkinson. 2. Đánh giá mối liên quan của những đột biến được xác định với một số biểu hiện lâm sàng điển hình trên người bệnh Parkinson.
10 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH PARKINSON 1.1.1. Khái niệm Bệnh Parkinson được đặt theo tên của một bác sĩ người Anh là James Parkinson, ông đã mô tả các triệu chứng lâm sàng của một bệnh lý thần kinh mà ông quan sát được và liệt kê trong bài luận có tên: "An Essay on the Shaking Palsy" (1817). Parkinson là một bệnh rối loạn thoái hoá của hệ thần kinh trung ương gây ảnh hưởng đến tình trạng vận động, thăng bằng và kiểm soát cơ của bệnh nhân. Bệnh Parkinson thuộc nhóm các bệnh rối loạn vận động. Bệnh có đặc điểm cứng cơ, run, tư thế và dáng đi bất thường, chuyển động chậm chạp và trong trường hợp bệnh nặng người bệnh có thể mất hoàn toàn một số chức năng vận động. Các triệu chứng chính của bệnh xuất hiện tương ứng với sự giảm khả năng dẫn truyền từ vùng vỏ não do hạch nền (basal galia) điều khiển. Thông thường điều này liên quan đến sự giảm sản xuất dopamine trong tế bào thần kinh dopaminergic của trung não (cụ thể là liềm đen - substantia nigra). Parkinson là bệnh mãn tính nguyên phát. Trong trường hợp thứ phát - hội chứng Parkinson (Parkinsonism), nguyên nhân gây bệnh có thể là do độc tính của một số loại thuốc, chấn thương sọ não, hay các bệnh lý tổn thương thần kinh khác. Hình 1.1. Parkinson và các triệu chứng điển hình (Nguồn: https://theconversation.com và https://medindia.net)
11 Một số thuật ngữ về Parkinson: - Hội chứng Parkinson (Parkinsonism, Parkinson’s syndrom): là hội chứng gồm các triệu chứng thứ phát tương tự bệnh Parkinson. - Bệnh Parkinson (Parkinson’s disease): là bệnh do thoái hoá nguyên phát một số cấu trúc của não (nhân đỏ, liềm đen, hạch nền,…). Gồm có: bệnh Parkinson khởi phát sớm (Early Onset Parkinson’s disease) và bệnh Parkinson tản phát (Sporadic Parkinson’s disease). 1.1.2. Cơ chế sinh bệnh Stress oxy hóa Ở bệnh nhân Parkinson quá trình oxy hóa protid và lipid tăng cao. Quá trình dị hóa này tạo ra nhiều gốc tự do có hại cho tế bào nói chung và tế bào thần kinh nói riêng [10]. Các chất oxy hoá (ROS) là nguy cơ chính gây nhiễm độc thần kinh bao gồm các rối loạn chuyển hóa, rối loạn thoái hoá. Các thành phần dưới tế bào như ty thể, màng tế bào và các cấu trúc dưới tế bào khác của tế bào thần kinh là mục tiêu tấn công của các chất độc thần kinh trong đó có các gốc tự do [11]. Stress oxy hóa nhận được sự quan tâm nhất trong cơ chế bệnh sinh bệnh Parkinson vì có liên quan đến chuyển hóa oxy hóa của dopamine [12], liên quan đến hydro peroxide (H2O2) và các chất có tính oxy hóa khác (Hình 1.2). Hình 1.2. Quá trình oxy hóa dopamine (DA)
12 Stress oxy hóa và hậu quả là dẫn đến chết tế bào tiến triển trong phần đặc của liềm đen dưới những hoàn cảnh như: (a, b) Tăng chuyển hóa dopamine dẫn đến hình thành peroxide dư thừa; (c) Sự thiếu hụt glutathione (GSH), từ đó làm mất khả năng chuyển hóa và loại bỏ H2O2 của não; hoặc (d) tăng phản ứng của sắt, có thể thúc đẩy hình thành OH*. Các nghiên cứu vùng phần đặc của liềm đen trên những bệnh nhân Parkinson sau chết não thấy có biểu hiểu tăng sắt, giảm glutathione (GSH); có sự phá hủy của ROS đến lipid, protein, DNA, cho thấy phần đặc của liềm đen ở tình trạng stress oxy hóa. Cả chuyển hóa enzym và hóa học của dopamine đều dẫn đến hình thành H2O2. H2O2 trong điều kiện bình thường được phân hủy bằng phản ứng kết hợp với glutathione (GSH) (Hình 1.2). Sự gia tăng nồng độ H2O2 có thể dẫn đến một phản ứng với sắt tạo ra gốc hydroxyl (OH*) có hoạt tính phản ứng cao và có khả năng gây độc tế bào theo phản ứng Fenton (d). Vai trò của sắt đối với stress oxy hóa Rất nhiều các nghiên cứu, sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau, đã chứng minh rằng lượng sắt tăng lên ở vùng liềm đen của những bệnh nhân Parkinson. Nghiên cứu sử dụng Laser microprobe (LAMMA) chỉ ra rằng sắt tích tụ chủ yếu trong hạt neuromelanin của tế bào thần kinh dopaminergic [13]. Sự tích tụ sắt ở những khu vực bị ảnh hưởng có thể thấy ở những tình trạng thoái hóa thần kinh khác. Ngoài ra, sự tăng tích tụ sắt ở vùng phần đặc liềm đen cũng được quan sát thấy khi gây tổn thương bằng 1,2,3,6-methyl- phenyl-tetrahydropyridine (MPTP) hoặc 6-hydorxydopamine (6-OHDA). Từ phát hiện này chỉ ra rằng sự tích tụ sắt là thứ phát ở những tế bào bị thoái hóa do nhiều nguyên nhân khác nhau. Tuy nhiên, điều này không phủ nhận tầm quan trọng của nó trong bệnh Parkinson, như sắt có thể gây chết tế bào ngay cả khi nó được tích lũy thứ phát do nguyên nhân khác. Vai trò của glutathione đối với stress oxy hóa Sự khiếm khuyết trong một hoặc nhiều hệ thống phòng thủ chống oxy hóa tự nhiên có thể dẫn đến thoái hóa thần kinh trong bệnh Parkinson [14]. Đáng chú ý nhất đó là sự phát hiện ra việc giảm có chọn lọc của glutathione ở
13 vùng phần đặc liềm đen trên bệnh nhân Parkinson. Sự giảm nồng độ của glutathione không được phát hiện ở những khu vực khác của não bộ những bệnh nhân Parkinson cũng như không được báo cáo ở bất cứ rối loạn thoái hóa khác. Giảm glutathione có thể dẫn đến làm suy yếu khả năng loại bỏ H2O2 và thúc đẩy hình thành OH*, đặc biệt là khi gia tăng sự có mặt của sắt. Không có sự rối loạn trong các enzyme chủ yếu liên quan đến tổng hợp glutathione. Tuy nhiên, có sự tăng đáng kể nồng độ của γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTT), enzyme có vai trò trong chuyển các tiền chất của glutathione và chuyển hóa dạng oxy hóa của glutathione (GSSG). Sự tăng γ- GTT có thể chống lại một nỗ lực của những tế bào còn sống sót cố gắng dung nạp tiền chất của glutathione vào tế bào để bổ sung lượng giảm sụt của GSH hoặc cơ chế bù trừ để loại bỏ GSSG - là một dạng độc tố tiềm tàng dẫn đến hậu quả của stress oxy hóa. So sánh kết quả giải phẫu bệnh não của bệnh nhân Parkinson qua khám nghiệm tử thi cũng phát hiện có thể Lewy ngẫu nhiên (Incidental Lewy bodies - ILB) ở liềm đen là hệ quả do sự thiếu hụt về glutathione [15]. Tổn thương do stress oxy hóa Bằng chứng về tổn thương do oxy hóa ở não bộ những bệnh nhân Parkinson là có sự tăng nồng độ các sản phẩm của lidpid peroxidation malondialdehyde (MDA) và lipid hydroperoxide ở vùng phần đặc liềm đen nhưng không thấy ở vỏ não ở những bệnh nhân Parkinson [16]. Nhuộm 4- hydroxynonenal cho thấy lipid peroxy, một sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa, có khả năng làm biến đổi protein và thúc đẩy độc tế bào tăng lên ở những tế bào thần kinh dopaminergic còn sống sót. Ngoài ra còn có sự tăng nồng độ của protein carbonyl và 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, phản ánh quá trình oxy hóa với protein và DNA tương ứng đã được tìm thấy ở vùng phần đặc liềm đen cũng như ở nhiều vùng khác trong não bộ bệnh nhân Parkinson [16]. Nhìn chung, những kết quả này cho thấy sự tổn thương do oxy hóa là khá phổ biến ở bệnh nhân Parkinson. Tuy nhiên phần lớn các bệnh nhân Parkinson được điều trị bằng levodopa, và cũng không chắc chắn liệu thuốc này có góp phần vào trong chuyển hóa oxy hóa gây tổn thương oxy hóa hay không.
14 Nhưng levodopa đã được chứng minh là gây ra sự thoái hóa tế bào thần kinh dopaminergic trong môi trường nuôi cấy. Mặc dù vậy, tình huống có thể khác ở những bệnh nhân Parkinson khi mà cơ chế phòng vệ bị suy giảm. Rối loạn chức năng ty thể Có sự giảm chọn lọc 30 - 40% hoạt động của Phức hợp I của ty thể trong chuỗi hô hấp vùng phần đặc liềm đen ở những bệnh nhân Parkinson. Sự giảm vận động Phức hợp I của ty thể cũng được tìm thấy trong tiểu cầu và cơ của những bệnh nhân Parkinson. Một khiếm khuyết trong Phức hợp I của ty thể có thể góp phần làm thoái hóa tế bào trong bệnh Parkinson thông qua làm giảm tổng hợp ATP và gây rối loạn năng lượng sinh học. Ở đầu tận synap của não chuột, ức chế Phức hợp I của ty thể bởi MPTP hoặc MPP+ có thể dẫn đến sự suy giảm ATP của tế bào. Tuy nhiên, các nghiên cứu ở động vật thực nghiệm cho thấy sự sụt giảm hoạt động của Phức hợp I của ty thể ở mức 40% hoặc ít hơn không gây ảnh hưởng đến ATP của tế bào [17]. Sự khiếm khuyết ở Phức hợp I của ty thể cũng có thể dẫn đến tổn thương tế bào thông qua các gốc tự do được sinh ra trực tiếp tại vị trí này hoặc theo con đường tăng bù đắp hô hấp tại Phức hợp II ty thể. Sự khiếm khuyết của Phức hợp I của ty thể có thể góp phần vào sự phát triển của quá trình chết theo chương trình (apoptosis). Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy việc giảm điện thế màng ty thể gây hậu quả là làm rối loạn chức năng bơm proton dẫn đến mở các lỗ nhỏ và làm tăng tính thấm của ty thể gây thoát các protein ty thể nhỏ, đó là dấu hiệu cho sự khởi đầu của quá trình chết theo chương trình. Phức hợp I của ty thể là vị trí chính của bơm proton, vì thế có thể một khiếm khuyết của Phức hợp I của ty thể ở bệnh nhân Parkinson có thể góp phần làm tổn thương thần kinh và dẫn đến chết theo chương trình. Nhiễm độc kích thích Nhiễm độc kích thích là nguyên nhân gây thoái hóa thần kinh liên quan đến bệnh Parkinson và có thể diễn ra theo hai cơ chế. Cơ chế đầu tiên liên quan đến sự nhiễm độc kích thích “mạnh” do sự tăng tổng hợp glutamate. Tế bào thần kinh dopaminergic vùng phần đặc liềm đen rất giàu các thụ thể
15 glutamate, nhận dẫn truyền glutamate từ vỏ não và các nhân dưới đồi và đã cho thấy sự đáp ứng mạnh mẽ với glutamate ngoại sinh. Tổn thương các tế bào hệ dopaminergic bất hoạt ức chế các tế bào thần kinh vùng dưới đồi và làm tăng tỷ lệ kích hoạt các kích thích đầu ra của các tế bào thần kinh này. Các sợi trục của các tế bào thần kinh vùng dưới đồi dẫn truyền tới vùng phần đặc liềm đen, tổn thương các tế bào hệ dopaminergic có thể thúc đẩy làm tăng nhiễm độc kích thích. Thực tế, tổn thương các tế bào thần kinh vùng dưới đồi giúp bảo vệ tế bào thần kinh vùng phần đặc liềm đen khỏi độc tố của 6- OHDA. Giả thuyết thứ hai liên quan đến cơ chế nhiễm độc kích thích “yếu”. Giả thuyết này cho rằng việc giảm quá trình chuyển hóa năng lượng do một khiếm khuyết chức năng của ty thể do mất các thụ thể phụ thuộc ATP Mg- blockade của N-methyl-D-aspartate (NMDA) và các thụ thể này cho phép các glutamate ở nồng độ sinh lý cho phép Ca++ vào trong tế bào [17]. Tổn thương do nhiễm độc kích thích được cho là bởi nitric oxide (NO). NO được hình thành bởi sự chuyển hóa của arginine thành citrulline trong phản ứng được xúc tác bởi nitric oxide synthase (NOS). Phản ứng thông qua glutamate làm tăng cytosolic calcium kết quả là kích hoạt NOS với sự tăng sản xuất NO. NO phản ứng với các gốc superoxide để hình thành gốc peroxynitrite và hydroxyl, cả hai là các tác nhân oxy hóa rất mạnh [16]. NO cũng có thể góp phần gây thoái hóa tế bào bằng cách tách sắt từ ferritin, và nó có thể tham gia vào phản ứng Fenton, sau đó là ức chế Phức hợp IV ty thể, do đó có khả năng chuyển đổi Phức hợp I của ty thể thuận nghịch rối loạn sang một rối loạn chuỗi hô hấp không thể đảo ngược. David Marsden FRS và cộng sự (1994) [15] đã chứng minh rằng chuỗi hô hấp ty thể bị hư hại do tiếp xúc lâu dài với NO và glutathione là một yếu tố bảo vệ quan trọng. Điều này có ý nghĩa đối với những bệnh nhân Parkinson khi mà có lượng glutathione giảm. Chất ức chế NOS là 7-nitroindazole (7-NI), ngăn chặn hình thành NO, có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh dopaminergic từ độc tố của MTTP ở cả chuột cống và khỉ đầu chó [17].
16 Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh Các nghiên cứu kinh điển trên in vitro của Levi-Montalcini & Hamburger (1953) [17] đã chứng minh rằng các tế bào thần kinh giao cảm được nuôi cấy không thể tồn tại nếu lấy đi yếu tố tăng trưởng thần kinh (nerve growth factor - NGF). Tương tự như vậy, thí nghiệm cắt đứt sợi trục tế bào thần kinh (axotomy) có thể gây thoái hóa tế bào thần kinh dopaminergic của con đường dẫn truyền thần kinh liềm đen – thể vân nếu không cung cấp cho những tế bào này những yếu tố cần thiết cho sự sống tại mô đích. Cả tế bào thần kinh và các tế bào thần kinh đệm hình sao đều có thể tổng hợp mRNA và protein từ nhiều loại phân tử dinh dưỡng thần kinh, bao gồm cả yếu tố dinh dưỡng thần kinh võng mạc (ciliary neurotrophic factor - CNTF), yếu tố dinh dưỡng thần kinh nguồn gốc từ não (brain-derived neurotrophc factor - BDNF), và yếu tố dinh dưỡng thần kinh có nguồn gốc thần kinh đệm (glial derived neurotrophic factor - GDNF), có khả năng hỗ trợ cho sự sống của các tế bào thần kinh lân cận. Ở hệ thống thần kinh trung ương của cơ thể trưởng thành khỏe mạnh, các yếu tố dinh dưỡng này được duy trì liên tục ở nồng độ thấp, nhưng chúng có thể được tăng tổng hợp sau chấn thương. Thương tổn thần kinh dưới liều gây chết ở chuột cống trưởng thành kích hoạt tế bào thần kinh đệm hình sao với sự tăng tổng hợp các yếu tố dinh dưỡng thần kinh như CNTF, NGF, và yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (fibroblas growth factor - FGF). Sự tăng hoạt tính của tế bào thần kinh đệm đã được chỉ ra ở những khu vực bị mất tế bào thần kinh dopaminergic trên bệnh nhân Parkinson. Cũng có những bằng chứng rõ ràng cho thấy một số phân tử dinh dưỡng có khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh dopaminergic dưới tác hại của các độc tố. BDNF tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh dopaminergic nuôi cấy và bảo vệ chúng khi tiếp xúc với MPTP. Cả GDNF và CNTF đều có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vùng phần đặc liềm đen ở chuột cống trong thí nghiệm cắt ngang sợi trục của con đường dẫn truyền liềm đen – thể vân. GDNF đã được chứng minh là làm tăng khả năng sống sót và phát triển của các tế bào thần kinh dopaminergic ở loài gặm nhấm và động vật linh trưởng có tổn thương các tế bào thần kinh dopaminergic và đảo ngược được những triệu chứng của bệnh Parkinson ở linh trưởng gây ra bởi MPTP. Nghiên cứu bằng kỹ thuật